Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

この手順の全体的な目的は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）からTリンパ球を生成し、その特性を解析することです。iPS細胞は、OP9-DL1培養システムを用いてin vitroで分化させ、その後、Rag欠損マウスを用いてin vivoで成熟させることができます。あるいは、細胞を遺伝子工学的に操作してOT-1 TCRを過剰発現させ、in vivoでの発達のために養子移入させることも可能です。

in vivoでの6週間の分化後、マウスにEEG seven腫瘍細胞を腹腔内投与してチャレンジを行い、iPS細胞由来T細胞の抗原特異性を評価できます。最終的に、iPS細胞は通常T細胞と抗原特異的T細胞の両方に分化することができ、後者は腫瘍チャレンジから動物を保護することが可能です。この技術の意義は、個別化がん免疫療法へと展開されます。

本手法により、最小限の患者の血液または皮膚組織から、大量の腫瘍反応性T細胞を生成することが可能です。0日目に、20% FBS含有$\alpha$-MEM培地を用いて、$5\times10^4$個のiPS細胞を、OP9-DL1細胞のコンフルエントな単層が形成された100 mm培養ディッシュに播種します。5日目にトリプシン処理を行い、細胞を遠心分離します。その後、新しい100 mm培養ディッシュに入れ、37°Cのインキュベーターで30分間静置します。20% FBS含有$\alpha$-MEM培地とマウスFlt3リガンドを用い、OP9-DL1細胞の単層が形成された新しい100 mmディッシュに、$5\times10^5$個の浮遊細胞を播種します。8日目に、緩く接着している細胞を緩やかにピペッティングで回収し、遠心分離した後、OP9-DL1細胞がコンフルエントにコーティングされた6ウェル培養プレートの1ウェルに細胞を移します。37°C、5% $\text{CO}_2$条件下でさらに2週間培養し、22日目まで維持します。

遊離させたIPS細胞を新しい培養皿に入れ、新鮮な培地にて37 °Cで30分間インキュベートします。その後、浮遊細胞の約半分を取り出し、70 µmのナイロンストレーナーに通して細胞塊を除去し、得られた単一細胞懸濁液を冷PBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、細胞を1.5 × 10⁷ cells/mLの濃度になるようPBSで再懸濁し、IV注射まで氷上で保持します。

4週齢のRag欠損マウスを赤外線ランプの下に置き、尾静脈を拡張させます。次に、26.5ゲージの針を装着した1 mLシリンジに細胞懸濁液 200 µLを満たし、拡張させた尾静脈から細胞を養子転送します。3週間後、養子転送したマウスの安楽死を確認した後、組織を機械的に破砕してリンパ節と脾臓を摘出します。

単細胞懸濁液をCK溶解バッファーで溶解し、得られた単核細胞を冷PBSで2回洗浄します。その後、細胞表面マーカーで染色し、0日目にフローサイトメトリー解析で細胞を評価します。1日目に、Gene Art転写試薬を用いて、プレートEパッケージング細胞にOT1 MIDRを overnight でトランスフェクションします。2日目に、0.1%ゼラチンでプレコートした24ウェルプレートの1ウェルに1×10⁶個のiPS細胞を播種します。プレートE細胞から擬似ウイルス含有上清を回収し、遠心後、0.4 µmフィルターに通して潜在的な不純物を除去します。ポリブレン存在下、32 °C、330 ×g で1時間、細胞を導入します。

導入手順を繰り返した後、同温で一晩インキュベートします。4日目に導入したiPS細胞をトリプシンで剥離し、遠心してペレット化した後、新鮮な培地で再懸濁し、あらかじめコード化された照射済みのsnl 7 6 7フィーダー細胞上に播種します。導入細胞がコンフルエントに達したら、フローサイトメトリーを用いてGFPおよびDS redのダブルポジティブ細胞を分取します。

iPS細胞の養子移入から6週間後、腫瘍チャレンジの50日目に、同マウスの腹腔内に50 µLのEEG-7腫瘍細胞を注入します。Miltenyi Biotec社のCD8陽性T細胞分離キットを用いて、養子移入した動物の脾臓およびリンパ節からCD8陽性T細胞を分取します。分取したCD8陽性T細胞を、ナイーブなC57BL/6Jマウス由来の照射済み脾細胞と1:10の比率で混合し、0.5 µmol/mLのOVAで40時間パルスします。

その後、さらに4時間、細胞にfelden Aを添加します。最後に、フローサイトメトリー分析により細胞集団を評価します。ナイーブなC 57 black six JマウスからSP細胞を単離した後、細胞懸濁液を2つのグループに分けます。

CFSE high群を5 µMのCFSEでラベルし、10 µg/mLのovaペプチドで1時間パルスします。CFSE low群は0.5 µMのCFSEでラベルし、パルスは行いません。PBS中で、2.5 × 10⁶個のCFSE high細胞と2.5 × 10⁶個のCFSE low細胞を混合します。その後、フローサイトメトリーを用いて細胞のCFSE発現を解析します。

目的のマウスに養択移入を行ってから16時間後、腫瘍チャレンジの20日目に腹腔内腫瘍細胞数を計測します。18.5ゲージの針を装着した10 mLシリンジと冷PBSを用いて、腹腔内を洗浄してください。回収した腫瘍細胞をカウントし、腫瘍浸潤細胞を同定します。

腫瘍負荷の最終段階で腫瘍を摘出し、その後、腫瘍を3つに切断します。1つ目の腫瘍片をクライオバイアルに入れ、バイアルをドライアイス上に置きます。2つ目の腫瘍片は、直ちにホルムアルデヒドで固定します。

凍結保存された組織切片を風乾させた後、条件付け済みのRPMI 1640培地で3枚目の切片を保存します。固定した切片をさらに15分間風乾させた後、冷アセトン中で15分間固定します。その後、PBSで5分間スライドを洗浄します。

スライドを湿室に入れ、組織切片に3% B, SAおよびPBSを30 µL滴下し、非特異的結合をブロックするために30分間静置します。次に、ブロッキングバッファーを吸い取り、3% PSA含有PBSで希釈したpe anti TCR RV alpha two抗体とfitzy anti ova抗体の混合液50 µLを組織切片に滴下し、湿室にて2時間インキュベートします。インキュベーション終了後、スライドを冷PBSで3回洗浄し、最後に水溶性封入剤で切片を封入し、腫瘍浸潤T細胞のフローサイトメトリー解析のための蛍光顕微鏡観察を行います。

腫瘍を押し潰して単一細胞懸濁液にします。次に、細胞の特異的表面マーカーを解析します。T細胞のマーカーとしてCD3およびTCR βを用い、NotchリガンドDL1によるiPS細胞の刺激がT細胞の分化に寄与するかどうかを判定するため、CD3陽性TCR β陽性のiPS細胞由来細胞におけるCD4およびCD8の細胞表面発現を評価しました。

右側のドットプロットは、in vitroでiPS細胞から生成された22日目のCD3陽性TCR$\beta$陽性CD4陰性CD8陽性のシングルポジティブT細胞を示しています。さらに、前図のiPS細胞由来シングルポジティブ細胞は、プレートコートしたanti-CD3および可溶性anti-CD28抗体でin vitro刺激した際にインターロイキン2およびインターフェロン$\gamma$を産生し、これにより、レシピエントマウスへの養子移入後もiPS細胞由来T細胞が機能していることが確認されました。TCR遺伝子を導入したiPS細胞の大部分はCD8陽性CTLへと分化し、プールしたリンパ節および脾臓細胞を用いたこれらのドットプロットにおいて、ペプチド刺激に対しインターロイキン2およびインターフェロン$\gamma$を分泌することでin vitroで応答しました。

TCRを導入したiPS細胞を適応転移させたマウスでは、コントロール導入細胞を転移させたマウスとは異なり、CD8陽性Vβ5陽性T細胞が生成されました。これらのヒストグラムにおいて、シェーディングされたアイソタイプコントロールのヒストグラムと比較して、太線で示されるCD8陽性Vβ5陽性集団は、インターロイキン2およびインターフェロンγ産生の細胞内サイトカイン染色で陽性となり、iPS細胞由来のCTLが機能的であることが示されました。これらのデータは、iPS細胞転移の10週後、またはOT-I CTL転移の1日後にマウスに注入された、エプチドでパルスしたCFSE high細胞（各グラフの右側のピーク）およびCFSE lowコントロール細胞（左側のピーク）を示しています。

抗原特異的IPS細胞由来CTLは、抗原刺激に反応し、ここに見られるCFSE高発現細胞の消失が示す通り、細胞毒性活性を有していました。OT-I TCR遺伝子を導入したIPS細胞をC57BL/6マウスに養生的に移植し、その後、EEG7腫瘍細胞をチャレンジしました。20日目に腹腔内の腫瘍細胞数を計測しました。コントロール群と比較して、TCR導入IPS細胞を投与したマウスにおいて、腫瘍細胞数が有意に減少していることに注目してください。

最も重要な点として、TCR導入iPS細胞の養生的移植により、過剰反応性のCTLが腫瘍組織へと浸潤し、腫瘍抗原投与後の動物を保護したことが、腫瘍抗原投与から30〜35日後に回収した腫瘍組織のH&E染色で確認されました。これはTCR導入細胞またはOT-I CTLを養生的に移植したマウスの腫瘍で認められましたが、擬似注入群（mock injected）またはコントロール群では認められませんでした。赤色の矢印で示されるように、導入細胞には炎症性細胞が浸潤していました。また、赤色で示されるOva特異的Vα2陽性CTLが、緑色で示されるOva発現腫瘍組織に浸潤していることが分かりました。

この図において、対照群のマウスの腫瘍では腫瘍浸潤細胞が少ないか、あるいは認められませんでしたが、腫瘍組織から調製した単一細胞懸濁液を用いて、CD8陽性集団をゲートした後にVα2陽性およびVβ5陽性の発現をフローサイトメトリーで解析しました。TCR導入iPS細胞を養子移行したマウスの腫瘍組織では、腫瘍浸潤細胞のレベルが最も高かった一方で、対照の導入iPS細胞を投与したマウスの腫瘍では、ova特異的CD8陽性T細胞の浸潤は認められなかったことに注意してください。

このビデオを視聴することで、iPS細胞から抗原特異的T細胞を生成する方法と、iPS細胞由来T細胞の機能を評価する方法について十分に理解することができます。