Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

人工多能性幹（iPS）細胞からTリンパ球の生成は、T細胞ベースの免疫療法のために胚性幹細胞を使用する代替アプローチを提供します。メソッドは、どちらを利用することによってことを示しています

この手順の全体的な目標は、人工多能性幹細胞またはIPS細胞からTリンパ球を作製し、特性評価することです。その後、IPS細胞は、OP nine DL one培養システム上でin vitroで分化させ、その後、ぼろきれ欠損マウスでin vivoで成熟させることができます。あるいは、細胞を遺伝子操作してOT one TCRを過剰発現させ、その後、in vivo開発のために養子として移植することもできます。

6週間のin vivo分化後、マウスに脳波7つの腫瘍細胞を腹腔内注射で挑戦し、IPS由来T細胞の抗原特異性を評価することができます。最終的に、IPS細胞は従来のT細胞と抗原特異的T細胞の両方に分化することができ、後者は動物を腫瘍の侵入から保護することができます。この技術の意味は、がん免疫療法の個別化にまで及びます。

この方法は、患者の血液または皮膚組織の最小量から得られる腫瘍反応性T細胞の多数の生成を可能にします ゼロ日 5回 10 回 4 番目の IPS 細胞を 100 ミリメートル培養皿に confluent OP 9、DL 1 細胞単層を含む 5 日目に 20%FBS アルファ MEM 培地で 5 日目に、 トリプシンの目。次いで、新鮮な100ミリメートル培養皿で30分間インキュベータープレート、20%FBSアルファ、MEM培地およびマウスフラット3リガンドの浮遊細胞の5倍10〜5倍でインキュベートした後、細胞を遠心分離する。8日目にDL One細胞を緩く付着した細胞を静かにピペットで滴下し、細胞を遠心分離し、次にConfluent OP nine DL One細胞でコーティングされた6ウェル培養プレートの1つのウェルに細胞を移し、22日目にさらに2週間、摂氏37度、二酸化炭素5%で細胞をインキュベートします。

分離したIPS細胞を新鮮な培地で、摂氏37度の新しい培養皿で30分間インキュベートします。次に、浮遊細胞の約半分を取り出し、70ミクロンのナイロンストレーナーに通して細胞塊を排除し、得られた単一細胞懸濁液を冷たいPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、細胞を7番目の細胞の1.5倍/ミリリットルでPBSに再懸濁し、IV注入前に細胞を氷上に維持します。

生後4週間のぼろきれ欠乏症のマウスを赤外線の下に置き、尾静脈を拡張します。次に、26.5ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器に200マイクロリットルの細胞懸濁液を充填し、拡張した尾静脈を介して細胞を養子として移植します。養子転院したマウスの安楽死を確認した後、3週間後、組織を機械的に分解した後、リンパ節と脾臓を切除します。

単一細胞懸濁液をCK溶解バッファーで溶解し、得られた単核球を冷PBSで2回洗浄します。次に、細胞表面マーカーを染色した後、ゼロ日目にフローサイトメトリー分析で細胞を評価し、遺伝子JAMAトランスフェクション試薬を使用して、1日目にOT 1 MIDRをOT 1 MIDRで一晩中メッキプレートEパッケージング細胞にトランスフェクションし、2日目に6つのIPS細胞を0.1%ゼラチンに予めコードされた24ウェルプレートの1ウェルにトランスフェクションします。 プラットE細胞からSナチンを含む疑似ウイルスを採取し、遠心分離後に0.4ミクロンのフィルターに通して潜在的な汚染物質を排除します。ポリブレインの存在下で、摂氏32度でGの330倍で1時間細胞を形質導入します。

形質導入手順を繰り返した後、同じ温度で一晩インキュベートします。トリプシンは4日目に形質導入されたIPS細胞を目視し、その後ペレット化した後、細胞は新鮮な培地で細胞を懸濁し、事前にコード化された照射されたsnl 7 6 7フィーダー細胞にそれらを播種します。形質導入細胞がコンフルエンシーに達したら、GFPおよびDSレッドのダブルポジティブ細胞をフローサイトメトリーで選別します。

IPS細胞の養子移植から6週間後、腫瘍チャレンジの50日目に、同じマウスの腹腔に50マイクロリットルのEEG7つのトーマ細胞を注入します。養子縁組された動物の脾臓およびリンパ節からCD8陽性T細胞を選別するために、mil E biotech CD eight positive T cell isolation kitを使用します。単離されたCD8陽性T細胞を、ナイーブなC 57黒色6Jマウスから照射されたSPOCサイズと1対10の比率で混合し、卵子のミルあたり0.5マイクロモルで共培養を40時間パルスします。

その後、フェルデンAをさらに4時間セルに加えます。最後に、ナイーブなC 57 black six JマウスからSP細胞を単離した後、フローサイトメトリー解析によって細胞集団を評価します。細胞懸濁液を2つのグループに分けます。

CFSEの1ミルあたり5マイクロモルでCFSEを標識し、卵ペプチドの1ミルあたり10マイクログラムで細胞をパルスし、1ミルあたり0.5マイクロモルのCFSEで標識されたA-C-F-S-E低グループをパルスし、パルスしません。10の2.5倍を6個目に、CFSEの高細胞と10の2.5倍を6個目に混合し、CFSEの低細胞をPBSに混ぜる。次に、フローサイトメトリーでサイトを分析し、CFSE発現を確認します。

目的のマウスへの養子縁組移植の16時間後 腫瘍チャレンジの20日目に腹腔内腫瘍細胞を数えます。18.5ゲージの針と冷たいPBSを備えた10ミリリットルの注射器を使用して、腹腔を洗浄します。腫瘍浸潤細胞を特定するために、回収された腫瘍細胞をカウントします。

腫瘍チャレンジの後期段階で腫瘍を切除し、腫瘍を3つに切ります。最初の腫瘍片をクライオバイアルに入れ、バイアルをドライアイスの上に置きます。すぐに2番目のピースホルムアルデヒドを固定します。

凍結保存された組織切片を風乾した後、3番目のピースをコンディショニングRPMI 1640培地で保存します。固定部分をさらに15分間風乾した後、冷たいアセトンで15分間固定します。洗浄後、スライドをPBSで5分間洗浄します。

スライドを湿ったチャンバーに置き、組織切片を30マイクロリットルの3%B、SA、PBSで30分間覆い、非特異的結合をブロックします。次に、ブロッキングバッファーをブロットオフし、インキュベーションの終了時に、PBS中の3%PSAで希釈したpe抗TCR RVα two抗体とfitzy抗卵子抗体の50 μL混合物で組織切片をインキュベートします。スライドを冷たくPBSで3回洗浄し、最後に切片を水性封入剤でマウントしてから、腫瘍浸潤T細胞のフローサイトメトリー分析のための蛍光顕微鏡検査を行います。

腫瘍を単一細胞懸濁液に押しつぶします。次に、特定の表面マーカーについて細胞を分析します。C、CD、3、およびTCRベータをT細胞のマーカーとして使用して、ノッチリガンドDL1によるIPS細胞の刺激がT細胞に寄与するかどうかを決定し、CD3陽性のTCRrベータ陽性IPS細胞由来細胞に対するCD4およびCD8細胞表面発現を評価しました。

右のドットプロットは、22日目のCDが3つの陽性、TCR、R、β陽性、CDが4つ、陰性CDが8つ、in vitroでIPS細胞から生成されたT細胞が1つ陽性であることを示しています。また、前図から得られたIPS細胞由来の1陽性細胞は、プレートコーティングされた抗CD3抗体と可溶性抗CD28抗体によりin vitroで刺激すると、インターロイキン2とインターフェロンγを産生し、レシピエントマウスに養子移植した後、IPS細胞由来T細胞が機能していることを確認しました。TCR遺伝子導入IPS細胞の大部分は、プールされたリンパ節および脾臓細胞からこれらのドットプロットでインターロイキン2およびインターフェロンγを分泌することによりペプチド刺激に応答したCD8陽性CTLへの分化を受けました。

CD8個の陽性Vベータ5個の陽性T細胞は、TCR形質導入されたが制御形質導入されたIPS細胞では養子導入されなかったマウスで生成されました。CD陽性のVββ5陽性の集団は、細胞内サイトカイン染色が陽性であり、インターロイキン2およびインターフェロンγ産生は、これらのヒストグラムで暗い線で表され、影付きのアイソタイプ対照ヒストグラムと比較して、IPS由来のCTLが機能していることを示しています。これらのデータから、各グラフの右のピークで表されるエプチドでパルス化されたCFSE高細胞と左のピークで表されるCFSE低コントロール細胞が、IPS細胞移植の10週間後またはO OT1CTL移植の1日後にマウスに注入されたことが示されています。

抗原特異的IPS由来のCTLは、抗原刺激に応答し、CFSE高細胞が存在しないことからわかるように、細胞傷害活性を示しました。OTの1つのTCR遺伝子形質導入IPS細胞をC57ブラック6マウスに養子導入し、その後、マウスにEEGでチャレンジし、20日目に7つの腫瘍細胞を腹腔内の腫瘍細胞を列挙した。TCR形質導入IPSを投与されたマウスでは、対照群と比較して腫瘍細胞数が有意に減少したことに注目してください。

最も重要なことは、TCR形質導入IPS細胞の養子導入は、腫瘍組織への過剰反応性CTLの浸潤を引き起こし、TCR形質導入細胞またはOT 1 CTLsで養子導入されたマウスからの腫瘍チャレンジ腫瘍の30〜35日後に回復した腫瘍組織のこのhおよびe染色で見られるように、腫瘍チャレンジから動物を保護したが、モック注入またはコントロールは行われなかった。形質導入された細胞は、ここで赤い矢印で示されているように、炎症細胞によって浸潤されました。赤の卵子特異的Vα2陽性CTLは、緑色の腫瘍組織を発現する卵子に浸潤することがわかりました。

この図では、対照群のマウスの腫瘍は腫瘍浸潤細胞が少ないかまったくありませんでしたが、腫瘍組織からの単一細胞懸濁液は、CD 8陽性集団をゲーティングした後、フローサイトメトリーによってV α 2陽性およびV β 5陽性の発現について分析されました。TCR形質導入IPS細胞を養子として移植したマウスの腫瘍組織は、最高レベルの腫瘍浸潤細胞を示したのに対し、対照を受けたマウスの腫瘍は最高レベルであったことに留意されたい。形質導入されたIPSは、卵子特異的CD8陽性T細胞による浸潤を示さなかった。

このビデオを見れば、IPS細胞から抗原特異的T細胞を生成する方法と、IPS由来のT細胞の機能を評価する方法についてよく理解できるはずです。