Name: Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学ぶiPS細胞からTリンパ球を誘導分化させる方法。OP9-DL1培養系とラグ欠損マウスを用いて、抗原特異的T細胞を産生し、腫瘍免疫療法への応用可能性を評価する技術です。

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我々は、OT1-2A•pMig II構造、博士はファンをサポートするためのIPS-MEF-NG-20D-17細胞株は、博士ダリオVignali（セントジュード小児研究病院）を提供するための博士山中伸弥（京都大学）に感謝本研究の設計を支援するためのカルロスOP9-DL1のセルラインをサポートするためのスニガ-Pflucker（免疫学教室、トロント大学）、博士ケントEブラーナ（薬理学教室医学のペンシルベニア州立大学）。このプロジェクトは、国立がん研究所、Barsumian信頼とメラノーマ研究財団（J.の歌）からのグラント番号K18CA151798の助成のもと、運営されている。

<ol><li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
<li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li>
<li>Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+a+tumor-specific%2C+MHC-unrestricted+T-cell+receptor+expressed+on+effector+cells+of+the+innate+and+the+adaptive+immune+system+through+bone+marrow+transduction+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution.</a> Blood. 105, 4583-4589 (2005).</li>
<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
<li>Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoztug%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Peerani, R., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+stem+cell+therapies+through+synthetic+stem+cell-niche+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering.</a> J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329, 1345-1348 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

<html> ACT-ベースの治療のために、in vivoでの再注入のための反応性の高い銀特異的T細胞の多数の in vitro生成の最適なアプローチです。私たちのin vitro法では、iPS細胞、iPS細胞由来の細胞は、特に4週目、4週間で死亡し、多数のより機能的なT細胞の増加を与えるが。我々は、ノッチからの生存信号がDL1と同様にIL-7とFLt3LがiPS細胞由来の前駆T細胞の生存を維持するのに十分ではありませんによって媒介されるシグナル伝達と結論付け、他の生存因子は、これらの細胞の成熟を調節するために協同組合があります。 TCR遺伝子導入やiPS細胞からのNotchリガンド主に直接T細胞分化のin vitro刺激しかし、iPS細胞由来の抗原特異的T細胞は、まだiPS細胞由来の抗原の適切な番号を取得するために防止する生存期間の延長、することはできませんACT-ベースの免疫療法のための特異的なT細胞。 ve_content &quot;&gt;胸腺におけるTリンパ球の開発は、秩序のプロセスです。CD4とCD8の発現を...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> C57BL/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 000664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J </td><td>ジャクソン研究所</td><td> 002216 </td></tr><tr><td>抗CD3（2C11）抗体</td><td> BD PharMingen社</td><td> 553058 </td></tr><tr><td>抗CD28（37.51）抗体</td><td> BD PharMingen社</td><td> 553295 </td></tr><tr><td>抗CD3（17A2）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 100202 </td></tr><tr><td>抗CD4（GK1.5）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 100417 </td></tr><tr><td>抗CD8（53から6.7）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 100714 </td></tr><tr><td>抗CD25（3C7）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 101912 </td></tr><tr><td>不定冠詞TI-CD44（1M7）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 103012 </td></tr><tr><td>抗CD117（2B8）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 105812 </td></tr><tr><td>抗TCR-β（H57597）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 109220 </td></tr><tr><td>抗IL-2（JES6-5H4）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 503810 </td></tr><tr><td>抗IFN-γ（XMG1.2）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 505822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>ハイクローン</td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td>ブレフェルジン</td><td>シグマ</td><td> B7651 </td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td> 107689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td>統合された科学</td><td> 204130 </td></tr><tr><td> RNAキット&lt;/ TD&gt; <td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNAキット</td><td>キアゲン</td><td> 69504 </td></tr><tr><td> CD8アイソレーションキット</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> ACK溶解緩衝液</td><td>ロンザ</td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td>ぺプロ</td><td> 250-31L </td></tr><tr><td> MIL-7 </td><td>ぺプロ</td><td> 217から17 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC-抗OVA抗体</td><td>ロックランドのImmunochemicals </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td>透過バッファ</td><td> Biolegend </td><td> 421002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A7906 </td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0.4μmのフィルター</td><td>ミリポア</td><td></td></tr><tr><td&gt; Mofloセルソーター</td><td>岳サイトメー</td><td></td></tr><tr><td>ソウルキャリバーフローサイトメーター</td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> LSR IIフローサイトメーター</td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td>マウス制止する</td><td>トリーサイエンティフィック</td><td></td></tr></tbody></table>

tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

抗原特異的CD8 +細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の養子細胞移植（ACT）は、悪性腫瘍の1様々な有望な治療法です。 CTLは、悪性細胞を殺すためにT細胞受容体（TCR）、およびリリース毒素だけでなく、サイトカインと腫瘍抗原を作用することにより悪性腫瘍細胞を認識することができます。これは、これらのCTLは、高い増殖能を持っているより分化した細胞よりもアポトーシスが少ない傾向があると持っているのであまり差別化（ 高反応性と呼ばれる）は、中央メモリのようなCTLは、ACT-ベースの免疫療法に最適な集団であることが知られている恒常性サイトカイン2-7に応答する能力が高い。しかし、患者からこのようなCTLの高い数値を得ることが困難なため、成功したACT-ベースの治療のために反応性の高い銀特異的CTLを生成するための新しいアプローチを見つけることが急務である。 自己再生幹細胞のTCR伝達免疫再構築のための細胞が病気8月10日の治療のための治療可能性を秘めています。しかし、患者から胚性幹細胞（ESCは）を取得するためのアプローチは現実的ではありません。治療目的のための造血幹細胞（HSC）の使用は広くクリニック11-13に適用されていますが、造血幹細胞は、分化と増殖能力が低下していると、造血幹細胞は 、in vitro細胞培養14-16で展開することが困難である。最近のiPS細胞技術と遺伝子送達のためのin vitro系の開発は、すべての外科的アプローチせずに患者からiPS細胞を生成することができる。さらに、ESCのように、iPS細胞は 、in vitro で無限増殖能を有しており、造血細胞に分化することが示されている。このように、iPS細胞は、ESCのまたは造血幹細胞に比べ、ACTベースの免疫療法で使用される大きな可能性を持っています。 ここでは、Tリンパ球を生成するための方法を提示in vitroで 、やiPS細胞からの抗原特異的CTL の in vivoでのプログラミングにおける癌免疫監視を促進するためのiPS細胞からcytes。 Notchリガンドのin vitroでの刺激は、iPS細胞からT細胞分化を駆動し、腫瘍の増殖を防ぐことが生体内で抗原特異的T細胞に分化するiPS細胞のTCR遺伝子導入の結果。したがって、私たちは、iPS細胞からの抗原特異的T細胞の分化を示しています。我々の研究では、ACT-ベースの治療のための抗原特異的CTLを生成するための潜在的に、より効率的なアプローチを提供し、疾患の治療戦略の開発を容易にします。

人工多能性幹（iPS）細胞からTリンパ球の生成は、T細胞ベースの免疫療法のために胚性幹細胞を使用する代替アプローチを提供します。メソッドは、どちらを利用することによってことを示しています<em&gt; in vitroで</em&gt;または<emin vivoでの&gt;</em&gt;誘導システムでは、iPS細胞は従来、抗原特異的Tリンパ球の両方に分化することができます。

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

抗原特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の養子細胞移植（ACT）は、さまざまな悪性腫瘍に対する有望な治療法である1。CTLは...

この手順の全体的な目的は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）からTリンパ球を生成し、その特性を解析することです。iPS細胞は、OP9-DL1培養系を用いてin vitroで分化させ、その後、Rag欠損マウスを用いてin vivoで成熟させることができます。あるいは、細胞を遺伝子工学的に操作してOT-1 TCRを過剰発現させ、in vivoでの発達のために養子移入させることも可能です。6週間のin vivo分化後、マウスにEEG seven腫瘍細胞を腹腔内投与してチャレンジを行い、iPS細胞由来T細胞の抗原特異性を評価できます。最終的に、iPS細胞は従来型T細胞と抗原特異的T細胞の両方に分化可能であり、後者は腫瘍チャレンジから動物を保護することができます。この手法の意義は、個別の癌免疫療法への応用にまで及びます。この手法により、最小限の患者の血液または皮膚組織から、大量の腫瘍反応性T細胞を生成することが可能です。0日目に、20% FBS含有α-MEM培地を用いて、合流したOP9-DL1細胞の単層を含む100 mm培養皿に5×10⁴個のiPS細胞を播種します。5日目に、トリプシン処理を行います。その後、細胞を新鮮な100 mm培養皿で37℃のインキュベーター内で30分間インキュベートし、遠心分離します。20% FBS含有α-MEM培地およびマウスFlt3リガンドを用い、OP9-DL1細胞の単層を含む新しい100 mm皿に、浮遊細胞のうち5×10⁵個を播種します。8日目に、緩く付着している細胞をピペッティングで優しく回収し、遠心分離した後、合流したOP9-DL1細胞でコートされた6ウェル培養プレートの1ウェルに細胞を移します。細胞を37°C、5% CO₂条件下でさらに2週間インキュベートします。22日目に。分離したiPS細胞を新しい培養皿に入れ、新鮮な培地で37°Cで30分間インキュベートします。次に、浮遊細胞の約半分を取り除き、70 µmのナイロンストレーナーに通して細胞塊を除去し、得られた単一細胞懸濁液を冷PBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、細胞を1.5 × 10⁷ cells/mLの濃度になるようPBSで再懸濁し、静脈内投与まで氷上で保持します。4週齢のrag欠損マウスを赤外線ランプの下に置き、尾静脈を拡張させます。次に、26.5ゲージの針を装着した1mLシリンジに200µLの細胞懸濁液を満たし、拡張させた尾静脈から細胞を養子移入します。3週間後、養子移入したマウスが安楽死したことを確認し、組織を機械的に破砕した後、リンパ節と脾臓を回収します。CK溶出バッファーを用いて単一細胞懸濁液を溶解し、得られた単核球を冷PBSで2回洗浄します。その後、細胞表面マーカーで染色し、0日目にフローサイトメトリー解析で細胞を評価します。1日目に、JAMA遺伝子導入試薬を用いて

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免疫学と感染症

このビデオは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のCD8+...

ウイルス抗原特異的T細胞を用いたB型肝炎ウイルスの複製抑制

このビデオは、腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞(iPSC)由来のCD8αβ+ T細胞を生成するアッセイを示しています。腫瘍抗原特異的iPS細胞は、間質細胞単層上で増殖し、造血前駆細胞(HPC)に分化します。HPCは、分化培地を用いてCD4+...

人工多能性幹細胞からの単一陽性CD8 T細胞の生成

マウス胚性幹細胞は、OP9-DL1共培養システムを使用してin...

T細胞の導出体外マウス胚性幹細胞からの

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。...

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

このプロトコルの目標は、メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を人工多能性幹細胞に再プログラミングするためのプロトコルを示すことです。...

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

ここでは、マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の免疫療法のために、人工多能性幹細胞(iPSC)から機能的な抗原(Ag)特異的制御性T細胞(Tregs)を開発する方法を紹介します。...

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

本稿では、OP9/DLL1共培養系を用いて機能性腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞由来CD8αβ+単陽性T細胞を生成する方法について説明する。...

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

ここに提示されるのは、幹細胞由来ウイルス抗原(Ag)特異的Tリンパ球の養子細胞転写(ACT)を利用してマウスにおけるB型肝炎ウイルス(HBV)複製の効果的な抑制のためのプロトコルである。この手順は、HBV感染の潜在的なACTベースの免疫療法に適合してもよい。...

幹細胞由来ウイルスAg特異的Tリンパ球はマウスにおけるHBV複製を抑制する

学ぶiPS細胞からTリンパ球を誘導分化させる方法。OP9-DL1培養系とラグ欠損マウスを用いて、抗原特異的T細胞を産生し、腫瘍免疫療法への応用可能性を評価する技術です。

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

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