微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

この手順の全体的な目的は、蛍光顕微鏡を用いて、スウォーミング、スライディング、またはバイオフィルム形成時における微生物株の空間分布を観察することです。この手法は、空間的な分離が微生物間の相互作用にどのように影響するかなど、社会微生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、顕微鏡技術と部分セグメント画像解析を用いることで、微生物株の適応度と空間分布を容易に評価できることです。

実演を担当するのは、私の研究室の博士研究員であるTheresa Holscherです。実験の前日に、3 mLのLB培地を培養チューブに加え、B.subtilisのフリーザーストックから接種します。目的の菌株ごとに別のチューブを用いて、同様に接種を繰り返します。

チューブを37 °Cの水平振盪インキュベーターに入れ、一晩培養します。スウォーミングおよびスライディング実験用のプレートを準備するため、温度を調整したLB培地 20 mLを90 mmポリスチレン製ペトリ皿に注ぎます。すぐに蓋を閉め、滅菌フードの端に置いて1時間以上冷却します。

次に、25 mLの2倍濃度SG培地を90 mmのペトリ皿に注ぎ、コロニーバイオフィルム実験用のプレートを準備します。すぐに蓋を閉じ、4枚以下のスタックにして少なくとも1時間冷却します。まず、LBアガーのスウォーミングおよびスライディングプレートをラミナーフローフード内に配置し、蓋を取り除きます。

プレートを20分間乾燥させます。これらの実験では、プレートの湿度が極めて重要です。水分が過剰にあると細菌が泳ぎますが、十分に乾燥させることで、スウォーミングやスライディングを防ぐことができます。

同様に、コロニーバイオフィルムの構造は培地の乾燥度によって異なります。分光光度計を用いて、1晩培養したスターター培養液の600 nmにおける吸光度を測定します。1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で、密度を正規化した緑色および赤色の蛍光タンパク質産生株を、合計200 µLになるように混合します。

チューブを3秒間ボルテックスします。マイクロピペットを使用して、混合培養液 2 µLを、ラミナーフローフード内であらかじめ乾燥させた直径90 mmのLB寒天培地プレートの中央にスポットします。プレートを10分間置いて乾燥させます。

最後に、プレートを37 °Cで直立させてインキュベートし、寒天表面に結露が集まるのを防ぎます。まず、2倍SG寒天プレートをラミナーフローフード内に15分間置き、乾燥させます。次に、緑色および赤色蛍光タンパク質を産生するバイオフィルム形成株であるB.subtilis 168のスターター培養液を、それぞれ100 µLずつ1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。

チューブを3秒間ボルテックスします。100 µLのLB培地を入れたチューブを用意し、混合培養液を用いて接種源の10倍希釈系列を作成します。マイクロピペットを用いて、希釈していない混合培養液を2 µL、2倍SG寒天プレート上にスポットします。

この操作を、$10^1$、$10^2$、$10^3$、および$10^4$の希釈液の接種サンプルに対して繰り返し、1枚のプレートに6〜9個のコロニーが形成されるよう、等間隔にスポットします。プレートを直立させた状態で30 °Cで1〜3日間インキュベートします。まず、プレートを蛍光検出顕微鏡のイメージングプラットフォームに設置します。

スライディングおよびスウォーミング実験では、放射状のコロニー拡大を測定できるよう、接種起点となるペトリ皿の中心を視野の隅に設定します。倍率は、90 mmプレートの可能な限り広い領域を撮影できる最高解像度に調整してください。また、蛍光信号の強度に応じて、露光時間を適切に調整します。

バイオフィルム解析を行うには、目的のコロニーを視野の中心に配置します。コロニー全体が見える範囲で、最高解像度の倍率に設定してください。これで、コロニーの測定および解析の準備が完了しました。

最後に、テキストプロトコルに記載されている通りにデータを解析します。この図は、2つの菌株を共接種した典型的なBacillus subtilisコロニーの成長を示しています。鞭毛依存的な集団的表面移動であるスウォーミングにより、高度に混合した集団が形成されます。

このタイムラプスビデオでは、初回の接種物をプレート播種の中央に配置しました。薄い層状のスウォーミング（swarming）が明確に観察され、コロニーが成長するにつれて、赤色と緑色の2つの蛍光株が混ざり合い、重なり合っていることがわかります。対照的に、スライディング（sliding）挙動の画像では、異なるラベルの蛍光株に対応して、明確に分かれた成長セクターが示されています。

このビデオでは、機能的な鞭毛を欠損した菌株による、スライディング共同接種コロニーの成長を示しています。これらのコロニーは、分泌される菌外多糖類、ハイドロフォビン、およびサーファクチンの組み合わせを用いることで、依然として拡大することが可能です。得られたコロニーは、スウォーミング菌株と比較して、明確に異なる空間的な成長配置を示します。

バイオフィルム形成コロニーの開始時の細胞密度は、結果として得られるコロニーの空間的な分取に大きな影響を及ぼしました。混合集団の高い細胞密度で開始したコロニーでは、空間的な分取がほとんど見られないか、あるいは全く見られませんでした。対照的に、開始時の細胞密度が低い場合は、明確な緑色および赤色の蛍光セクターが検出されました。

このビデオを視聴することで、微生物コロニーにおける蛍光標識株の相対存在量の決定方法、空間的分離の検討方法、および創始細胞密度の影響に関する研究手法について、十分な理解を深めることができます。