微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

この手順の全体的な目標は、蛍光顕微鏡を使用して、群れ、スライド、またはバイオフィルム形成中の微生物株の空間分布を観察することです。この方法は、空間的分離が微生物の相互作用にどのように影響するかなど、社会微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、顕微鏡技術とサブセグメント画像分析を使用して、微生物株の適応度と空間分布を簡単に評価できることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の研究者であるTheresa Holscherです。実験前日に、培養チューブに3ミリリットルのLB培地を加え、枯草菌の冷凍ストックから接種します。この接種を、目的の菌株ごとに別々のチューブで繰り返します。

チューブを摂氏37度の水平振とうインキュベーターに一晩入れます。スウォーミング実験とスライディング実験用のプレートを準備するには、20ミリリットルのテンパリングLBメディウムを90ミリメートルポリスチレンペトリ皿に注ぎます。すぐに皿を閉じ、滅菌フードの片側に置いて少なくとも1時間冷まします。

次に、90mmのシャーレにSG培地の2倍の25ミリリットルの寒天を注ぎ、コロニーバイオフィルム実験用のプレートを調製します。プレートをすぐに閉じ、4個以下のスタックで少なくとも1時間冷まします。まず、LB寒天培地とスライディングプレートを層流フードに置き、蓋を取り外します。

プレートを20分間乾かします。これらの実験では、プレートの湿度が重要です。水分が多すぎるとバクテリアが泳ぐことができますが、長時間乾燥すると群がったり滑ったりするのを防ぎます。

同様に、コロニーバイオフィルムの構造は、培地の乾燥度に依存します。分光光度計を使用して、600ナノメートルでのオーバーナイトスターター培養の光学密度を決定します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、緑と赤の蛍光タンパク質産生株を合計200マイクロリットルの密度で正規化した量を混合します。

チューブを3秒間ボルテックスします。マイクロピペットを使用して、層流フード内の乾燥済み90 mm LB寒天プレートの中央に2マイクロリットルの混合培養物を見つけます。プレートを10分間乾燥させます。

最後に、プレートを摂氏37度で直立させてインキュベートし、寒天の表面に結露が溜まるのを防ぎます。まず、2回のSG寒天プレートを層流フードに15分間置き、乾燥させます。次に、緑色と赤色の蛍光タンパク質を産生するバイオフィルム株であるB.subtilis 168スターター培養液をそれぞれ100マイクロリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。

チューブを3秒間ボルテックスします。100マイクロリットルのLB培地でチューブを調製し、混合培養物を使用して、10倍希釈シリーズの接種液を作成します。マイクロピペットを使用して、2マイクロリットルの非希釈混合培養物を2倍のSG寒天プレートにスポットします。

これを10対1、10対2、10対3、10対4の希釈液に接種し、1つの皿に6〜9個のコロニーを成長させることができるように、等間隔でスポットを空けます。プレートを30°Cで直立させて1〜3日間インキュベートします。まず、蛍光検出顕微鏡のイメージングプラットフォームにプレートを置きます。

スライディング実験やスウォーミング実験では、接種の原点であるペトリ皿の中央を可視視野の角に設定して、放射状のコロニー拡大を測定できるようにします。倍率を最高解像度に調整し、90mmプレートの可能な限り大きな領域をイメージングできるようにします。露光時間は、蛍光シグナルの強度に応じて適切に調整してください。

バイオフィルム解析では、視野の中心に目的のコロニーを配置します。コロニー全体を表示できる最高解像度に倍率を設定します。これで、コロニーの測定と分析の準備が整いました。

最後に、テキストプロトコルで説明されているようにデータを分析します。この図は、典型的な2株を同時接種したBacillus subtilisコロニーの成長を示しています。鞭毛虫に依存する集団表面移動である群れは、高度に混合された個体群をもたらします。

このタイムラプス動画では、プレートスプレッドの中央に最初の接種剤を配置しました。薄層の群れがはっきりと観察され、コロニーが発達するにつれて、赤と緑の2つの蛍光株が混ざり合って重なり合って見えます。逆に、スライディング挙動の画像は、異なる標識された蛍光株に対応する明確な成長セクターを示しています。

このビデオは、菌株が機能しているべん毛を欠いているスライド式の共接種コロニーの成長を示しています。これらのコロニーは、分泌されたエキソ多糖類、疎水性、およびサーファクチンの組み合わせを使用して拡散することができます。結果として得られるコロニーは、群れ株と比較して明確な空間的成長の多様性を示します。

バイオフィルム産生コロニーは、細胞密度が始まり、結果として得られるコロニーの空間的品揃えに大きく影響しました。混合集団の細胞密度が高い状態で開始されたコロニーは、空間的な多様性がわずかまたはまったく示されませんでした。対照的に、開始時の細胞密度が低かった場合、透明な緑と赤の蛍光セクターを検出できました。

このビデオを見れば、微生物コロニー中の蛍光標識株の相対的な存在量を決定する方法、空間的偏析を調べる方法、および創始細胞密度の影響を研究する方法について十分に理解できるはずです。