微生物集団に定着表面に空間的分離の監視
2016年10月29日
進化のシナリオで品揃え（空間的分離）の役割は、空間分布の調整を可能にする制御された実験室での単純な微生物系を用いて調べることができます。創始細胞密度を変更することにより、様々な品揃えのレベルは、 枯草菌のコロニーバイオフィルム内の蛍光標識された菌株を使用して可視化することができます。
この手順の全体的な目標は、蛍光顕微鏡を使用して、群れ、スライド、またはバイオフィルム形成中の微生物株の空間分布を観察することです。この方法は、空間的分離が微生物の相互作用にどのように影響するかなど、社会微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、顕微鏡技術とサブセグメント画像分析を使用して、微生物株の適応度と空間分布を簡単に評価できることです。
この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の研究者であるTheresa Holscherです。実験前日に、培養チューブに3ミリリットルのLB培地を加え、枯草菌の冷凍ストックから接種します。この接種を、目的の菌株ごとに別々のチューブで繰り返します。
チューブを摂氏37度の水平振とうインキュベーターに一晩入れます。スウォーミング実験とスライディング実験用のプレートを準備するには、20ミリリットルのテンパリングLBメディウムを90ミリメートルポリスチレンペトリ皿に注ぎます。すぐに皿を閉じ、滅菌フードの片側に置いて少なくとも1時間冷まします。
次に、90mmのシャーレにSG培地の2倍の25ミリリットルの寒天を注ぎ、コロニーバイオフィルム実験用のプレートを調製します。プレートをすぐに閉じ、4個以下のスタックで少なくとも1時間冷まします。まず、LB寒天培地とスライディングプレートを層流フードに置き、蓋を取り外します。
プレートを20分間乾かします。これらの実験では、プレートの湿度が重要です。水分が多すぎるとバクテリアが泳ぐことができますが、長時間乾燥すると群がったり滑ったりするのを防ぎます。
同様に、コロニーバイオフィルムの構造は、培地の乾燥度に依存します。分光光度計を使用して、600ナノメートルでのオーバーナイトスターター培養の光学密度を決定します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブに、緑と赤の蛍光タンパク質産生株を合計200マイクロリットルの密度で正規化した量を混合します。
チューブを3秒間ボルテックスします。マイクロピペットを使用して、層流フード内の乾燥済み90 mm LB寒天プレートの中央に2マイクロリットルの混合培養物を見つけます。プレートを10分間乾燥させます。
最後に、プレートを摂氏37度で直立させてインキュベートし、寒天の表面に結露が溜まるのを防ぎます。まず、2回のSG寒天プレートを層流フードに15分間置き、乾燥させます。次に、緑色と赤色の蛍光タンパク質を産生するバイオフィルム株であるB.subtilis 168スターター培養液をそれぞれ100マイクロリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。
チューブを3秒間ボルテックスします。100マイクロリットルのLB培地でチューブを調製し、混合培養物を使用して、10倍希釈シリーズの接種液を作成します。マイクロピペットを使用して、2マイクロリットルの非希釈混合培養物を2倍のSG寒天プレートにスポットします。
これを10対1、10対2、10対3、10対4の希釈液に接種し、1つの皿に6〜9個のコロニーを成長させることができるように、等間隔でスポットを空けます。プレートを30°Cで直立させて1〜3日間インキュベートします。まず、蛍光検出顕微鏡のイメージングプラットフォームにプレートを置きます。
スライディング実験やスウォーミング実験では、接種の原点であるペトリ皿の中央を可視視野の角に設定して、放射状のコロニー拡大を測定できるようにします。倍率を最高解像度に調整し、90mmプレートの可能な限り大きな領域をイメージングできるようにします。露光時間は、蛍光シグナルの強度に応じて適切に調整してください。
バイオフィルム解析では、視野の中心に目的のコロニーを配置します。コロニー全体を表示できる最高解像度に倍率を設定します。これで、コロニーの測定と分析の準備が整いました。
最後に、テキストプロトコルで説明されているようにデータを分析します。この図は、典型的な2株を同時接種したBacillus subtilisコロニーの成長を示しています。鞭毛虫に依存する集団表面移動である群れは、高度に混合された個体群をもたらします。
このタイムラプス動画では、プレートスプレッドの中央に最初の接種剤を配置しました。薄層の群れがはっきりと観察され、コロニーが発達するにつれて、赤と緑の2つの蛍光株が混ざり合って重なり合って見えます。逆に、スライディング挙動の画像は、異なる標識された蛍光株に対応する明確な成長セクターを示しています。
このビデオは、菌株が機能しているべん毛を欠いているスライド式の共接種コロニーの成長を示しています。これらのコロニーは、分泌されたエキソ多糖類、疎水性、およびサーファクチンの組み合わせを使用して拡散することができます。結果として得られるコロニーは、群れ株と比較して明確な空間的成長の多様性を示します。
バイオフィルム産生コロニーは、細胞密度が始まり、結果として得られるコロニーの空間的品揃えに大きく影響しました。混合集団の細胞密度が高い状態で開始されたコロニーは、空間的な多様性がわずかまたはまったく示されませんでした。対照的に、開始時の細胞密度が低かった場合、透明な緑と赤の蛍光セクターを検出できました。
このビデオを見れば、微生物コロニー中の蛍光標識株の相対的な存在量を決定する方法、空間的偏析を調べる方法、および創始細胞密度の影響を研究する方法について十分に理解できるはずです。
概要
この研究は、蛍光顕微鏡を用いて群遊、滑走、バイオフィルム形成中の微生物株の空間分布を調査します。創始細胞密度を操作することで、Bacillus subtilisコロニーにおける空間分離が微生物間相互作用に与える影響を観察することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 微生物生態学
- 社会微生物学
- 蛍光顕微鏡
背景
- 空間分離は微生物間の相互作用において重要な役割を果たします。
- 蛍光標識された株により、異なる個体群の視覚化が可能になります。
- これらのダイナミクスを理解することで進化のシナリオを知ることができます。
- 微生物の適応性と分布を評価する技術は不可欠です。
研究目的
- 空間分離が微生物間の相互作用にどのように影響するかを観察すること。
- コロニー構造に対する創始細胞密度の影響を評価すること。
- 微生物行動の詳細な分析に蛍光顕微鏡を活用すること。
使用方法
- 実験用のLBおよびSGアガープレートの調製。
- 細菌株の接種と光密度の評価。
- コロニーの成長と挙動を視覚化するための蛍光顕微鏡。
- 株間の空間分布と相互作用パターンの分析。
主な結果
- 群遊行動は株の混合個体群をもたらしました。
- 滑走行動は成長の明確なセクターを示しました。
- 高い初期細胞密度は空間的分類を減少させました。
- 低い初期細胞密度は株の明確な分離を可能にしました。
結論
- 空間分離は微生物間の相互作用に大きな影響を与えます。
- 創始細胞密度はコロニー構造の重要な要因です。
- 蛍光顕微鏡は微生物ダイナミクスの研究に効果的です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative monitoring of spatial segregation in surface-colonizing microbial populations enables precise interrogation of microbial social interactions and fitness dynamics. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses and optimizing model system selection in anti-infective and microbiome-targeted R&D. The approach supports predictive confidence in phenotypic screening and informs translational continuity from discovery through preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microbial population dynamics and spatial assortment during surface colonization.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing between swarming, sliding, and biofilm phenotypes.
- Facilitates functional validation of genetic modifications and their impact on microbial fitness.
- Provides quantitative outputs for hypothesis-driven target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, fluorescence-based assays for tracking strain-specific behaviors in mixed populations.
- Delivers standardized, quantitative readouts for spatial distribution and relative abundance of labeled strains.
- Enables scalable preparation of validated microbial systems for downstream screening workflows.
- Supports robust assay development for compound evaluation targeting microbial community interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns model system outputs with disease-relevant microbial behaviors such as biofilm formation and spatial segregation.
- Ensures continuity of mechanistic insights from discovery through preclinical model validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying founder cell density effects on population structure.
- Provides predictive value for translational biomarker development in microbiome and anti-infective programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative, fluorescence-based monitoring of microbial population dynamics and spatial segregation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microbial social interaction and spatial assortment mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Delivers image-based measurements of strain abundance and spatial distribution for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro microbial behaviors to preclinical model outcomes relevant to infection and microbiome modulation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse microbial systems and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial model systems.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of microbial targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective and microbiome-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to fluorescence-capable microscopy platforms and image processing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of strain labeling, inoculation density, and imaging protocols.
- Adaptable to various microbial species and genetic constructs with appropriate validation.
- Dependent on precise control of experimental variables such as founder cell density and agar medium conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Preparation of Media and Starter Cultures
1:54
Co-inoculation of Fluorescently Labeled Strains for Surface Spreading
3:16
Co-inoculation of Fluorescently Labeled Strains for Biofilm Growth
4:32
Colony Imaging Using Fluorescent Microscopy
5:36
Results: Swarming, Sliding, and Biofilm Producing Colonies Display Different Patternsof Spatial Growth
7:12
Conclusion
