バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

この手順の全体的な目標は、これを行うための統合的な方法を使用して、バイオフィルムと周辺環境との相互作用を特徴付けることです。ダブルインレットマイクロ流体フローセルシステムは、グルコース含有培地とグルコースフリー培地がフローセル全体にポンプで送られ、グルコース勾配を生成するシステムです。バクテリアがシステムに追加され、バイオフィルムが数日かけて発生するのを許されます。

次に、バイオフィルムを3D共焦点顕微鏡でイメージングし、solu輸送を特徴付けます。バイオフィルム内では、蛍光トレーサーをフローシステムに注入し、バイオフィルムコロニー周辺の流れ場を特徴付けるためにタイムラプスイメージングを行い、蛍光マイクロビーズを注入してタイムラプスイメージングを行います。得られたデータの溶質輸送と粒子追跡分析は、1つのデバイス内および1セットの実験で、さまざまな化学環境下でのバイオフィルムプロセスを評価する上で、この方法の有用性を示しています。

この方法の主な利点は、バイオフィルム環境相互作用の複数の側面を同時に評価できることです。ここで報告した方法は、自然環境やバイオフィルム関連感染症におけるバイオフィルム形成に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。層流フードで作業し、ポサPAOのコロニーを1つのGFP端に、LBプレートから大腸菌DH5アルファのコロニーを3ミリリットルのlbブロスを含む別々のチューブに移します。

培養物を摂氏37度で一晩インキュベートし、225 RPMで振とうします。このフローシステムは、フローチャンバー内で2つの溶液を混合することによって形成される明確に定義された化学勾配下でのバイオフィルム成長の観察を容易にするダブルインレットマイクロ流体セルに基づいています。流れ中、横方向に滑らかな濃度勾配が形成されます。

拡散の結果として、濃度プロファイルは入口の近くで急になり、下流でよりリラックスします。実験当日は、フローシステムを丁寧に組み立ててください。まず、チューブをチューブポンプにクランプし、次にチューブの一方の端をグルコースを含む900ミリリットルのFAB培地が入った中型ボトルに取り付け、もう一方の端をバブルトラップに取り付けます。

このプロセスを繰り返して、グルコースを含まない900ミリリットルのファブが入った2番目のミディアムボトルを2番目のバブルトラップに接続します。次に、フローセル入口の直前に三方弁を挿入し、各バブルトラップをフローセルに接続します。最後に、フローセル出口を廃液ボトルに接続します。

フローセルがカバースリップ面を下にして配置され、懸濁したセルがカバースリップに落ち着くようにしてください。フローシステムが組み立てられた後、各入口に対して毎時10ミリリットルの流量で蠕動ポンプをオンにしてシステムを充填し、媒体を用いてファブ媒体を2つの入口に導入し、1つの入口にのみグルコースを設ける。次に、フード内で作業し、2つの細菌培養物を滅菌水1ミリリットルに1対1の比率に希釈し、各細菌に対して同等のOD600を0.01にしてフローセルに接種し、滅菌プラスチックシリンジを使用して、3方向バルブを介して各フローセル入口に500マイクロリットルの接種液を注入します。

注射後、ポンプを停止し、細胞が付着してから1時間後に細菌細胞をカバーガラスに付着させ、各入口でポンプを毎分0.03ミリリットルに設定し、室温でシステムを3日間流し、その間にバイオフィルムがグルコース曝露の勾配下で形成されます。3日経ちました。マーカーと定規を使用して、イメージングの準備として、フローセルのカバーガラス側にグリッドを描きます。

これは、大腸菌を見るための染色に対抗するイメージング領域を見つけるのに役立ちます。まず、カウンターステインは光に敏感であるため、ライトを消して作業エリアを暗くします。シリンジを使用して、希釈した細胞透過性の赤色蛍光核酸染色液1ミリリットルをフローチャンバーの上流の三方弁にゆっくりと注入します。

フローを停止します。フローセルを暗闇で30分間停滞させます。30分経過後。

毎分0.03ミリリットルで流れを再開し、結合していない汚れを15分間洗い流します。次に、流れを止め、63 x 対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用してバイオフィルムを観察します。ここに示すように、バイオフィルムのコロニーが十分に分離されたバイオマスを多く含む視野を見つけます。

次に、適切なチャネルで3D画像スタックをキャプチャして、フローセル画像内のバイオフィルム開発の空間パターンをマッピングし、フローセル入口に沿って3つ以上の縦方向またはX方向の距離にあるバイオフィルム、および課せられた栄養勾配に対して3つの横方向またはY位置でバイオフィルムをマッピングします。バイオフィルム内のsolu輸送パターンを特徴付けるには、フローセルから始めます。バイオフィルムの現像に3日間を費やした後、再び暗闇の中での作業が行われました。

ポンプを停止して流れを一時停止し、バブルトラップを開いて注入圧力を解放します。次に、シリンジを使用して、希釈した 1 ミリリットルの SF トレーサー溶液をフローセルの上流の 3 方向バルブのいずれかに注入します。SF溶液を注入した後、バブルトラップを閉じます。

三方弁を調整し、ポンプを毎分0.03ミリリットルで再起動して、SF溶液をフローセルに供給します。次に、共焦点イメージングモードをフレームレート0.15ヘルツのXYTに切り替えます。色素の浸透を言語化するには、高い時間分解能が好まれますが、高速スキャンは画質を低下させます。

したがって、スキャン速度とライン平均を設定して、イメージングの時間分解能と画質のバランスを取ります。イメージングパラメータを設定したら、ポンプを再起動してフローを再開します。毎分0.03ミリリットルの速度で、sci 5が同時にフローセルに供給されます。

タイムラプス共焦点イメージングを開始します。タイムラプス撮影が完了したら。添付文書の指示に従って拡散分析を行った。

バイオフィルムの周りの流れ場を特徴付けるには、滅菌水中の蛍光1マイクロビーズを最終固形濃度0.2%、最終体積0.5ミリリットルに希釈します。次に、ボルテックスしてマイクロビーズが十分に分散していることを確認し、フローを一時停止してから、希釈した蛍光マイクロビーズをフローセルに注入して送液します。前回と同様に、流量を毎時0.01ミリリットルに変更します。

低流量のため、粒子経路を正確に追跡できます。共焦点設定をXYTモードに切り替え、1つのZスライスで粒子の動きを追跡するようにソフトウェアに指示します。1ヘルツのフレームレートを使用して、以前と同様に時系列画像をキャプチャします。

パーティクル注入手順とイメージを異なるZ位置で繰り返します。イメージングが完了したら、添付のドキュメントの指示に従ってフローベクトルを計算し、グルコース勾配下でのバイオフィルム内の細菌の相互作用を研究します。Posa GFPと大腸菌は、対比染色により二重種のバイオフィルムで分化しました。

cyto 62では、フローチャンバー上の9つのイメージング領域のそれぞれで画像を取得しました。ここに示すオーバーレイでは、posa GFPは緑または黄色に、大腸菌は赤に見えます。ポサはグルコース濃度が高い地域でバイオフィルムバイオマスを支配し、大腸菌はグルコース濃度が低い地域で優勢でした。

したがって、2つの種は異なる生態学的ニッチを占めていました。これらの結果は、複雑な環境でのバイオフィルム発生活性と相互作用の研究におけるダブルインレットマイクロ流体フローセルの有用性を示しています。このビデオを見た後、ダブルインレットマイクロ流体フローセルを使用して化学勾配下でバイオフィルムを成長させる方法と、蛍光粒子またはチェイサーの注入を使用してバイオフィルム開発の環境パラメータを取得する方法についてよく理解しているはずです。

これらの方法は、環境微生物学および臨床微生物学の分野の研究者が、微生物群集とその周辺環境との間の複雑な相互作用を探求する道を開きました。