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私たちは、Pを提供するためにワシントン大学（シアトル、ワシントン州）のMatt Parsekに感謝緑膿菌とE.ストリームソフトウェアへのアクセスを提供するためのカンタベリー大学（ニュージーランド）での大腸菌の菌株とロジャー·ノークス。この作品は、国立衛生研究所からの助成金のR01AI081983、アレルギーと国立感染症研究所によってサポートされていました。共焦点イメージングは​​、ノースウェスタン生物イメージング機能（BIF）で行った。

1.フローセルセットアップおよび接種注：Song らに記載されてダブルインレットマイクロ流体フローセルを使用し、2014年14バイオフィルムを成長させる。。このフローセルは、明確に定義された滑らかな化学的勾配を作成することができる。フローセルの設計は、 図1に示されており、電池の製造は、以前Song らに記載されて流れている。、2014 14。P.を使用してここで詳細に我々の方法を緑膿菌とE.大腸菌は、バイオフィルムを形成するが、他の種にも適切であり得る。我々はPを使用構成的バイオフィルム発生のためのモデル生物として、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する緑膿菌 PAO1- のgfp。さらに、当社は、Eを使用大腸菌DH5αP.と混合種のバイオフィルムを形成するために緑膿菌。P.緑膿菌とE.大腸菌株はLB寒天プレート上で増殖させた。 <ol><li> a側にポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用して、結合したフローセルを準備14に記載されているように、酸素プラズマ処理を介してカバーガラス。フローセルチャンバーの寸法は、0.24ミリメートル（奥行き×幅×長さ）×13ミリメートル×23ミリメートルである。 </li><li>修正されたFAB成長培地15を準備します。 、フローセル内の栄養勾配の下でのバイオフィルムの成長を観察する一つの入口で0.6μMグルコースを培地に変更FAB 15を紹介し、他の入口から任意の炭素源なしFAB培地を導入する。フィルター滅菌し（孔径=0.2μm）でのグルコースストック溶液（60 mM）のFAB培地に​​添加する前に。使用前に、また、サイクル1（121℃、17 psiの液体、15分）を有するFAB培地をオートクレーブ。 </li><li>フローシステムを滅菌する。接種の前に、流路全体（培地ボトル、チューブ、バブルトラップ、フローセル）フローセルの上流​​に位置する（使い捨て滅菌済み）プラスチック三方弁を除いて、サイクル1を用いてオートクレーブ。 （スリーウェイバルブはセルcを注入するために使用されulture、蛍光トレーサー及びマイクロビーズ。）オートクレーブする前に、アルミ箔またはオートクレーブ袋ですべてのチューブおよびコネクタの開口部をカバーし、組み立て中に汚染を避けるために。 </li><li>フローシステムを接続します。注意深くフローセルシステムの構成要素を組み立てる（フローシステムアセンブリのためのビデオを参照）、正確に流量を制御する蠕動ポンプを介してフローセルに増殖培地を提供。 </li><li> P.のコロニーを転送することによって接種のための細胞培養を準備緑膿菌またはE. LBプレートからLBブロスの3ミリリットルに大腸菌および225rpmで、37℃で培養するO / Nを振ること。接種物として最終OD 600 = 0.01に水を滅菌1ミリリットル中にO / N細胞培養物を希釈する。 （培養および汚染を避けるために、層流フード中の細菌を希釈する。） </li><li>各細菌のための同等のOD 600 = 0.01と1ミリリットル中に1：混在種のバイオフィルムを用いた実験では、1の比に2細菌培養を希釈。 </li><li>フローセルを接種する。三方弁からフローセル入口に接種物1mlを注入する。注射後、細菌細胞をカバーガラスに付着させ、1時間の流れを一時停止。 （フローセルが懸濁された細胞は、カバースリップ上に沈降させるためにカバースリップ側を下に置かれていることを確認します。） </li><li> 1時間後、フローを再開し、3日間、各入口0.03 ml /分の一定速度でフローセルに成長培地をポンピングする。 </li></ol> 2.共焦点顕微鏡を用いて栄養グラデーションに応じて、バイオフィルムの開発の特徴付け注：P.緑膿菌は、構成的に発現したGFPが、Eで画像化することができる混合種のバイオフィルム中の大腸菌は、対比によって画像化されなければならない。 <ol><li>共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムを観察します。代表的な結果を得るには、63Xの目的とした共焦点顕微鏡を使用してバイオフィルムを観察する。イメージング、マークの前にカバーガラス側のグリッドダブルインレットフローセル。 （このグリッドの目的は、実験者がフローセルチャンバ内の撮像領域を見つけることを可能にすることである。） </li><li> 、対比などSTYO 62などの緑色蛍光核酸染色などの細胞透過赤色蛍光核酸染色、10μlのを希釈、原液（1 mM）を990μlの滅菌水にしてから、ゆっくりとシリンジを用いて希釈染みを注入するために、上流側の三方弁からフローセルチャンバー。停滞フローセルを維持し、30分間、暗所で、その後15分間、結合していない汚れを洗い流すためにフローを再開。 </li><li>共焦点イメージングを行います。励起のための488nmアルゴンレーザーとGFP（500から535ナノメートル）と（緑色蛍光核酸染色のため、650〜750 nm）の核酸染色のためのチャネルを収集放出をアクティブにします。明るく清潔なイメージを持っているように、両方のチャネルのためのゲインおよびオフセットを調整します。 XYZと同時撮像モードを選択します。 IDENするZ-コントロールノブを使用して、フィールド内のバイオフィルムの底部と頂部をtify。 3次元画像スタックを取得するための0.5μmからのz段階を設定する。 （画像取得のための4つのラインの平均を使用して、高画質を確保するために）。 </li><li>三つにおける空間フローセル内のバイオフィルムの発達のパターン、画像、バイオフィルムをマッピングする複数の長手方向（x）のフローセル入口に沿って距離が、 図1に示すように、3つの横方向（y）に、課された栄養勾配に対する相対位置。 </li></ol>保守党蛍光トレーサーの注射によって3の特徴付け内部溶質輸送注：そのようなCy5のような保守的な蛍光トレーサー、バイオフィルム内の溶質移動パターンを特徴付けるために使用することができる。 <ol><li>ストック溶液としてミリリットルの10mg /の最終濃度まで水でのCy5（モノ反応性NHSエステル）に溶解する。 -20℃の冷凍庫でCy5の原液を保管してください。 注：Cy5標識が光sensitであるためIVEは、ストアは、希釈し、暗所にCy5のソリューションを注入する。 </li><li>蛍光トレーサーの注射の前に、（63X対物レンズを使用）共焦点顕微鏡を用いて3日間のバイオフィルムの3次元画像スタックを取る。 （バイオフィルムコロニーの広い領域は、色素の輸送での時系列の観測に最適です。）（ 図5（a）に示すように）また、イメージングのための十分に分離したコロニーを有するz平面を選択します。 </li><li>各Cy5の注入実験のために、20μg/ mlのCy5標識の濃度を有する注射溶液を得、滅菌水998μlの中のCy5ストック溶液2μlを希釈する。 </li><li>流れを一時停止し、3方弁を介して注射器を用いて、フローセルの上流​​にCy5の溶液を注入するポンプを停止する。 （これは、注入しながら流路に入るの気泡を防止することが重要である。バブルトラップが戻って注入中に開いたままにすべきである。） </li><li> Cy5の溶液を注入した後、バブルトラップを閉じる三方弁を調整し、再起動するフローセルに注入Cy5のソリューションを提供するポンプ。 </li><li> XYTする共焦点撮像モードを切り替えます。同時撮像モードの下でのCy5とGFPのチャンネルをアクティブにします。定量化のために重要である、信号の飽和を避けるために、（レーザー強度、ゲイン、オフセット）Cy5の強度に共焦点設定を調整します。 （高時間分解能は、染料浸透を可視化することが好ましい。ただし、高速走査は、画像品質を低下させる。）、撮像の時間分解能および画質のバランスをとるために、適切な走査速度とライン平均値を選択する。このプロトコルの4のライン平均0.15 60Hzのフレームレートを使用。 </li><li> （静止0.03ミリリットル/分の流速で）フローセルにCy5標識を提供するためのフローを再開。同時に時系列共焦点イメージングを開始する。 </li><li>放射状に2-Dの円形のバイオフィルムコロニー内のCy5強度を平均化することによりCy5の浸透を定量化する。最初のバイオクラスターのエッジを識別する、平均化するために、クラスタの2-D区間の距離マップを生成する、最後にCy5の強度の平均半径方向のパターンが浸透曲線（ 図6参照）を生成する。 <ol><li>計算上3.8ステップ実現するために、Biospa社（バイオフィルム空間パターン解析）ソフトウェアパッケージ（リクエストに応じて利用可能未発表、ソフトウェアパッケージとマニュアル）、または他の画像解析プログラムを使用しています。 </li><li> Biospa社を使用するには、まずBiospa社に設定した画像をインポートします。その後、バイナリイメージを作るために、GFPおよびCy5チャンネルのための適切なしきい値を選択します。分析/計算メニューで、高度な分析と、その後拡散分析を選択します。クラスタのエッジを定義し、関心領域（ROI）のような1つのクラスタを選択するために、多角形ツールを使用してGFPチャネルを使用。 </li><li>二重拡散分析を実行するために選択されたバイオフィルムのクラスタをクリックします。拡散分析結果を保存し、検量線を用いてCy5の濃度にCy5の強度を較正する。 <ol><li>のCy5 conceにわたってCy5の強度を測定し、Cy5の濃度の較正曲線を生成する共焦点顕微鏡下ntration勾配。 （Cy5の強度と濃度は線形の関係を有する。） </li></ol></li></ol></li></ol> 4.追跡蛍光粒子によって周囲の流れ場の特徴付け注：蛍光ビーズのような蛍光粒子は、バイオフィルムの周りの流れ場を特徴付けるために使用することができる。バイオフィルムの周りの流れ場は、粒子追跡速度測定ソフトウェアを使用して、パーティクルの位置の時系列観測値から算出することができる。ここに示す結果はストリーム2.02ソフトウェアパッケージ16（ソフトウェアのダウンロードとで利用できるユーザーガイドを用いて得られた<a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ）。 <ol><li> 0.2％の最終固形分濃度が0.5 mlの最終容積に滅菌水で蛍光マイクロビーズ（直径約1ミクロン）で希釈する。渦は、マイクロビーズがいることを確認するよく分散されている。 </li><li>ステップ3.3から3.5から手順以下のフローセルに希釈された蛍光マイクロビーズを注入してお届けします。粒子経路の正確なトラッキングを可能にするために、比較的低流量（0.01ミリリットル/本論文では、粒子追跡結果のための時間）を使用します。 </li><li> 1のzスライスにおける粒子の動きを追跡し、時系列画像を撮影するモードをXYT共焦点設定を切り替える。 （1ヘルツのフレームレートは、この論文に示されている代表的な結果を得るために使用した。）を繰り返して、粒子噴射し、画像を別のzの位置における3次元流れ場を生成する。 </li><li>前工程の時系列（上利用可能なソフトウェアのダウンロードとマニュアルのImageJを使用してバックグラウンドの蛍光シグナル（画像セットの最初の取得画像内の信号）を減算することによって共焦点画像<a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/を</a> ）または他のプログラム。 </li><li> ImageJのでは、画像セットの最初の画像を開き、画像セットをインポートします。プロセスの下で/画像のCalculator、画像セットから最初の画像を差し引く。前処理された画像セットを保存します。 </li><li>ストリーム2.02においてフローベクトル、インポート時系列の共焦点画像を算出する。 「オープン·プロセスビュー」の下で、「粒子の識別」を選択し、実行します。粒子を識別するために、適切なしきい値を使用してください。 1ミクロンの粒子の最小値と最大直径のしきい値として0.5と5μmのを使用してください。 </li><li>その後、「オープンプロセスビュー」の下に、粒子のパスを生成するために、「PTV解析パイプライン」を選択して実行。彼らは、粒子の動きを表現するかどうかを確認するために、粒子のパスを確認してください。最後に、選択して、フローベクトルマップを生成する「速度場の作成」を実行します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

バイオフィルムの化学勾配に応じて、周囲の流れの微小環境上のバイオフィルムの成長、および内部輸送の制限に起因するバイオフィルムの不均一性の影響：私たちは三つの重要なバイオフィルムと環境の相互作用を特徴づけるための方法のスイートを実証した。 まず、バイオフィルム発生のために明確に定義された化学勾配を課すことは、新規なマイクロ流体フローセルの使用を示した。フローセル内で明確に定義された化学勾配を生成するために、両方の入口に同じ流量を維持することが重要である。蠕動ポンプはよく同じ速度で成長媒体を提供するために両方の流路のために調整されていることを確認してください。また、バイオフィルムの成長の間の流路内に目詰まりがないことを確認してください。化学勾配が大幅にバイオフィルム内のバイオフィルムの成長と種間の相互作用に影響を与えたのは、このフローセルショーでデュアル種のバイオフィルムの成長の観察。化学勾配に一般的である輸送の制限、化学結合および反応、および微生物の取り込みおよび代謝18-20の組み合わせによるバイオフィルムが成長する環境。このマイクロ流体フローセルは、単一のデ...

細胞外ポリマーマトリックス1で囲まれた細胞凝集物-微生物は、表面およびフォームバイオフィルムに付着する。バイオフィルムは、内部溶質移動の制限と細胞代謝2,3における空間的変化の組み合わせから得られる劇的な空間的不均一性を持っているので、バイオフィルムは、非常に異なる個別の微生物細胞から振る舞う。酸素と栄養素濃度が大幅にバイオフィルムと流体と、さらにバイオフィルム2における内枯渇取得周囲の間の界面に減少する。バイオフィルム呼吸およびタンパク質合成の空間変動もローカライズ酸素および栄養素利用2に対する応答として生じ得る。 水生および土壌環境では、ほとんどの細菌はバイオフィルムに住む。ナチュラルバイオフィルムは、炭素と窒素を循環し、金属4,5の削減などの重要な生物地球化学的処理を行う。臨床的には、バイオフィルム形成はRESPONSです長期の肺と尿感染症の6のためible。バイオフィルム中の細胞はそれらのプランクトン様の対応物6と比較して、抗菌剤に対して極めて高い耐性を有するので、バイオフィルム関連感染症は非常に問題である。バイオフィルムは、多様な設定において重要であるため、研究のかなりの量は、バイオフィルム活性とバイオフィルム中の空間的不均一性と、周囲の微小環境を制御する環境要因を理解することに焦点を当ててきた。 以前の研究では、バイオフィルムの開発が強く環境要因の数によって調節されることを見出した：バイオフィルムは、種々の流動条件下で、異なる形態を開発する。酸素と栄養素の可用性に影響を与えるバイオフィルム形態。と流体力学的せん断応力が表面に浮遊性細胞の付着とバイオフィルム7-9からの細胞の脱離に影響を与えます。また、外部フロー条件は、基板のintの配信に影響を与えるO及びバイオフィルム10内。バイオフィルムの成長はまた、物理的および化学的条件を囲む変える。例えば、バイオフィルムの成長は、酸素と栄養2のローカル枯渇をもたらす。バイオフィルムは、周囲の環境11からの無機および有機化合物を蓄積。とバイオクラスターは流れをそらすと表面摩擦12,13を増やす。バイオフィルムは、非常に複雑な方法でその周囲の環境と相互作用するので、同時にバイオフィルムの特性および環境条件についての情報を得ることが重要であり、学際的なアプローチが包括的にバイオフィルム環境の相互作用を特徴付けるために使用される必要がある。 ここでは、課せられた栄養勾配の下でのモノ種とデュアル種のバイオフィルム内の微生物の増殖に空間パターンを特徴づけるために統合された一連の方法を提示し、局所的な化学的および流体微小環境の結果の変更を観察する。我々モミstは明確な化学勾配下バイオフィルムの成長を観察するための最近開発されたダブルインレットマイクロ流体フローセルの使用を記載している。次に、栄養条件の範囲の下でバイオフィルム中の細菌は、 緑膿菌、大腸菌 、2種の成長を観察するために、このマイクロ流体フローセルの使用を示す。我々は、バイオフィルムコロニーへの蛍光トレーサーの伝播のインサイチュ可視化定量的バイオフィルムにおける溶質輸送のパターンを評価するために使用できる方法を示す。最後に、共焦点顕微鏡下で行う、どのマイクロ粒子追跡速度測定を示し、成長したバイオフィルムの周りに局所的な流れ場を得るために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>ポンプチューブ 0.50&nbsp;mm OVC、オレンジ/イエロー</td><td>ギルソン</td><td>F117934</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>三方向ストップコック スイベル オス ルアーロック付き スイベル オス ルアーロック</td><td>スミスメディカル&nbsp;</td><td>MX9311L</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>シルガード184ソーラーパネルを作るための太陽電池カプセル化</td><td>MLソーラーLLC</td><td></td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>パイレックスミディアムボトル、1&nbsp;L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>C-FLEX チューブ</td><td>コールパーマー</td><td>06422-02</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>1 ml TB シリンジ</td><td>BD</td><td>309659</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>ポリマーチューブ</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>滅菌済み Intramedic ルアースタブアダプター</td><td>クレイ・アダムス</td><td>427564</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>PrecisionGlide ニードル</td><td>BD</td><td>305195</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>HACH</td><td></td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>シリンジフィルター - 滅菌済み (0.2 &mu;m)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>09-719A</td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>MAXQ シェーカー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>フローセルのセットアップと接種</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>リン酸二塩基</td>性無水 <td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>増殖培地</td></tr><tr><td>リン酸一塩基性カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>塩化マグニシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td></td><td>C5670</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>硫酸カルシウム二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>硫酸鉄(II)七水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>マンガン(II)硫酸塩一水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>銅(II) 硫酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛七水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>コバルト(II)硫酸塩七水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>モリブデン酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>成長培地</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>デキストロース Sigma</td><td>Aldrich</td><td>D9434</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>ルリア ベルタニ ブロス</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>TCS SP2 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>蛍光イメージング</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>ライフサイエンス</td><td>S11344</td><td>蛍光イメージング</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>PA15100</td><td>蛍光イメージング</td></tr><tr><td>赤色蛍光 (580/605) FluoSphere</td><td>ライフサイエンス</td><td>F-8801</td><td>蛍光イメージング</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>パックマンラボ</td><td></td><td>画像処理</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>画像処理</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>画像処理</td></tr><tr><td>ストリーム 2.02</td><td>カンテベリー</td><td></td>大学<td>画像処理</td></tr></tbody></table>

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

バイオフィルムは、複雑な構造を持ち、重要な空間的不均一性を生成する表面結合微生物群集である。バイオフィルムの開発が強く、周囲の流れおよび栄養環境によって調節される。バイオフィルムの成長はまた、複雑な流れ場と溶質輸送パターンを生成することによって、局所微小環境の不均一性を増大させる。バイオフィルムとそのローカルマイクロ生息地間のバイオフィルムとの相互作用における異質の開発を調査するために、我々は緑膿菌とP.のデュアル種のバイオフィルムのモノ種のバイオフィルムを成長したマイクロ流体フローセル中の栄養勾配下緑膿菌、大腸菌 。我々は、フローセル内の栄養勾配を作成するために成長し、これらの条件下で、バイオフィルム発生を可視化するための詳細なプロトコルを提供する。また私たちは現在、バイオフィルム構造で空間パターンを定量化するための光学的方法の一連のためのプロトコル、フローdistriバイオフィルム上butions、および大量輸送の周りや生物膜コロニー内。これらのメソッドは、バイオフィルムと生息地の異質の共同開発の総合的な調査をサポートしています。

ダブルインレットマイクロ流体フローセルは、フローチャンバー内の2つの溶液を混合することにより形成された、明確に定義された化学勾配下でのバイオフィルムの成長の観察を可能にする。得られた化学勾配が以前の染料注入により観察し、Song ら 14により詳細に特徴付けた。 図1に示すように、滑らかな濃度勾配は、横方向に形成された。濃度プロファイルは、入口付近急であり、拡散による（ 図1）の下流に緩和た。栄養勾配下でのバイオフィルムの発達を観察するために、我々は、唯一の炭素源として1つの入口に添加グルコースで定義された最少増殖培地（FAB培地）を用いた。他のすべての栄養素が均一に分布しながら、フローセルチャンバー中のグルコース濃度勾配を得た。 P.の成長緑膿菌 PAO1バイオフィルムが強くグルコースのローカル配信（ 図2）に相関していた。横グルコース濃度勾配は、入口の近くに急であったように、バイオフィルムのバイオマスは、低グルコース領域に高いグルコース領域からの劇的な減少を...

バイオフィルムは、周囲の環境と複雑な相互作用を持っています。バイオフィルムと環境の相互作用を包括的に研究するために、バイオフィルム開発のための不均一な化学環境を作り出すための一連の方法、局所的な流速の定量化、およびバイオフィルムコロニー内および周囲の物質輸送を分析するための一連の方法を紹介します。

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

本手順の全体的な目的は、統合的な手法を用いて、バイオフィルムと周囲環境との相互作用を特性評価することである。グルコース含有培地とグルコース不含培地をフローセル内でポンプ輸送し、グルコース濃度勾配を形成するダブルインレット・マイクロ流体フローセルシステムを構築する。システムに細菌を添加し、数日間にわたってバイオフィルムを形成させる。次に、3D共焦点顕微鏡を用いてバイオフィルムをイメージングし、溶質輸送を特性評価します。バイオフィルム内において、蛍光トレーサーをフローシステムに注入し、タイムラプスイメージングを行うことでバイオフィルムコロニー周囲の流れ場を特性評価します。また、蛍光マイクロビーズを注入し、タイムラプスイメージングを行います。得られたデータの溶質輸送および粒子追跡解析により、単一のデバイスおよび一連の実験において、さまざまな化学環境下でのバイオフィルムプロセスを評価する本手法の有用性が示されます。これらの手法の主な利点は、バイオフィルムの環境相互作用における複数の側面を同時に評価できることです。ここで報告する手法は、自然環境におけるバイオフィルム形成や、バイオフィルムに関連する感染症に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。ラミナーフローフード内で、LBプレートからP. aeruginosa PAO1-GFPのコロニー1個とE. coli DH5αのコロニー1個を、それぞれ3 mLのLBブロスを含む別々のチューブに転移させます。培養物を37°Cで225 RPMで振盪しながら一晩インキュベートします。このフローシステムは、2つの溶液をフローチャンバー内で混合することで形成される明確な化学勾配下でのバイオフィルム成長の観察を可能にする、ダブルインレットマイクロ流体セルに基づいています。フロー中には、横方向に緩やかな濃度勾配が形成されます。拡散の結果、濃度プロファイルは入口付近で急峻になり、下流に向かって緩やかになります。実験当日、フローシステムを慎重に組み立てます。まず、チューブをペリスタルティックポンプに固定し、次にチューブの一端をグルコース含有FAB培地900 millilitersが入った培地ボトルに、もう一端をバブルトラップに接続します。この手順を繰り返し、グルコース不含のfabを900 milliliters含む2本目の培地ボトルを2つ目のバブルトラップに接続します。次に、フローセルの入口直前に三方コックを挿入し、各バブルトラップをフローセルに接続します。最後に、フローセルの出口を廃棄ボトルに接続します。浮遊細胞をカバーガラス上に沈降させるため、フローセルはカバーガラス側を下にして配置してください。フローシステムを組み立てた後、ペリスタルティックポンプを起動し、各インレットに 10 milliliters per hour の流量で培地を流してシステムを満たします。培地を2つのインレットに導入しますが、グルコースは一方のインレットにのみ供給します。次に、クリーンベンチ内で、2つの細菌培養液を滅菌水 1 milliliter で1:1の比率に希釈し、各細菌の OD 600 が 0.01 になるように調整します。フローセルに接種するため、滅菌プラスチックシリンジを使用して、3方コックを介して接種液 500 microliters をフローセルの各インレットに注入します。注入後、ポンプを停止し、細菌細胞をカバーガラスに1時間付着させます。細胞が付着した後、ポンプを各インレットにつき0.03 milliliters per minuteに設定し、室温で3日間流し、グルコース曝露の勾配下でバイオフィルムを形成させます。3日が経過した後、イメージングの準備として、マーカーと定規を使用してフローセルのカバーガラス側に格子線を描きます。これにより、E. coliを観察するための対比染色のイメージング領域の特定が容易になります。まず、対比染料は光感受性であるため、照明を消して作業エリアを暗くします。シリンジを使用して、希釈した細胞透過性赤色蛍光核酸染料 1 mL を、フローチャンバーの上流にある三方バルブにゆっくりと注入します。フローを停止します。フローセルを暗所で30分間静置します。30分が経過した後。流量を0.03 milliliters per minuteに戻し、未結合の染料を15分間洗い流します。その後、フローを停止し、63 x対物レンズを用いて共焦点顕微鏡でバイオフィルムを観察します。ここで示すように、バイオフィルムのコロニーが十分に分離しており、かつ十分な量のバイオマスを含む視野を探してください。次に、適切なチャネルで3D画像スタックを撮影し、フローセル画像内におけるバイオフィルム形成の空間パターンのマッピングを行います。具体的には、フローセルの入口から縦方向（X方向）に3カ所以上の距離、および設定した栄養勾配に対して横方向（Y方向）に3カ所の位置でバイオフィルムを撮影します。バイオフィルム内の溶質輸送パターンを特性評価するためには、まずフローセルから開始します。バイオフィルム形成から3日後、ここでも遮光条件下で作業を行います。ポンプを停止して流量を一時停止させ、バブルトラップを開いて注入圧を解放します。次に、シリンジを用いて、希釈したsci-fiトレーサー溶液 1 mLを、フローセルの上流にある3方活栓のいずれかに注入します。sci-fi溶液の注入後、バブルトラップを閉じます。3方コックを調整し、ポンプを0.03 milliliters per minuteで再始動させて、sci-fi溶液をフローセルに注入します。次に、共焦点イメージングモードをXYTに切り替え、フレームレートを0.15 hertzに設定します。染料の浸透を視覚化するには高い時間分解能が望ましいですが、高速スキャンは画質を低下させます。したがって、イメージングの時間分解能と画質のバランスをとるように、走査速度とライン平均を設定します。イメージングパラメータの設定が完了したら、ポンプを再起動してフローを再開させます。0.03 milliliters per minute の速度で、sci five がフローセルに同時に導入されます。タイムラプス共焦点イメージングを開始します。タイムラプスイメージングの完了後、付属文書の指示に従って拡散分析を行います。バイオフィルム周囲の流れ場を特性評価するため、蛍光1 µmマイクロビーズを滅菌水で希釈し、最終的な固形分濃度を0.2%、最終容量を0.5 mLにします。次に、ボルテックスミキサーでマイクロビーズを十分に分散させ、流れを停止させてから、希釈した蛍光マイクロビーズをフローセルに注入・導入します。前述と同様に、流速を0.01 mL/hに変更します。低流速にすることで、粒子の経路を正確に追跡することが可能になります。共焦点顕微鏡の設定をXYTモードに切り替え、ソフトウェアで1つのZスライスにおける粒子の動きを追跡するように設定します。前述と同様に、フレームレートを1 Hzとしてタイムシリーズ画像をキャプチャします。粒子注入の手順を繰り返し、異なるZ位置でイメージングを行います。イメージング完了後、付属ドキュメントの手順に従って流速ベクトルを算出し、グルコース濃度勾配下でのバイオフィルム内における細菌間相互作用を解析します。2種の細菌による混合種バイオフィルムでは、対比染色を用いてPosa GFPとE coliを区別しました。Cyto 62を用いて、フローチャンバー上の9つのイメージング領域それぞれの画像を撮影しました。ここに示すオーバーレイ画像では、posa GFPが緑色または黄色に、e coliが赤色に表示されています。グルコース濃度が高い領域ではposaがバイオフィルム生物量の大部分を占め、グルコース濃度が低い領域ではe coliが大部分を占めました。このように、2つの種は異なる生態学的ニッチを占めていました。これらの結果は、複雑な環境におけるバイオフィルムの形成活性および相互作用を研究する上で、ダブルインレット・マイクロ流体フローセルの有用性を実証しています。このビデオを視聴することで、化学勾配条件下でバイオフィルムを培養するためのダブルインレット・マイクロ流体フローセルの使用方法と、形成後の蛍光粒子またはチェイサーの注入によるバイオフィルム形成のための環境パラメータの取得方法について、十分に理解できたはずです。これらの手法は、環境微生物学および臨床微生物学の分野の研究者が、微生物コミュニティとそれを取り巻く環境との間の複雑な相互作用を探索するための道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、バイオフィルム形成を調べるために、シンプルな半定量方法を提供...

しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

出典: ミケル・グエノック、C. ら共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いたフィラメント性菌類コロニー上の細菌バイオフィルムの定性的多スケール解析の新手法。 J. Vis. Exp.

バイオフィルム形成のための菌類-細菌共培養の確立

バイオフィルム内の3つの細胞および細胞外成分の同時定量と比較のためのプロトコルが提示されます。この方法論には、共焦点レーザー走査型顕微鏡、バイオフィルム構造解析および視覚化ソフトウェア、および統計解析ソフトウェアの使用が含まれます。...

バイオフィルムの細胞内および細胞外成分の同時定量(英語)

この方法の論文の目的は、典型的にはヒト歯肉縁上の歯垢内で識別種を含む多種バイオフィルムの開発のための微小流体システムの使用を説明することである。バイオフィルムのアーキテクチャ、バイオフィルムの生存率、および文化に依存またはカルチャに依存しない解析が強調表示されるための収穫バイオフィルムへのアプローチを記述するための方法。...

ハイスループットの使用<em&gt;インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために&gt;マイクロ流体システム

進化のシナリオで品揃え（空間的分離）の役割は、空間分布の調整を可能にする制御された実験室での単純な微生物系を用いて調べることができます。創始細胞密度を変更することにより、様々な品揃えのレベルは、 枯草菌のコロニーバイオフィルム内の蛍光標識された菌株を使用して可視化することができます。...

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

このプロトコルは、成長し、質的に、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡により真菌の菌糸上の細菌のバイオフィルムを分析するための新しい方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

視覚的クラスタ リングと組み合わせてフローサイトメトリー水生バイオ フィルムを研究するための使いやすい高速メソッドを提供しています。バイオ フィルムの特性評価、バイオ フィルムのコミュニティ構造の変化の検出とバイオ...

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

微生物バイオフィルムは、相間で複雑なアーキテクチャを形成し、高度にスケール依存する空間パターンに発展します。ここでは、3D光コヘレンス断層撮影(OCT)データセットの自動取得のための実験システム(ハードおよびソフトウェア)を紹介する。このツールセットは、空間と時間におけるバイオフィルム形態形成の非侵襲的かつ多スケールの特性を可能にする。...

大規模な空間スケールでバイオフィルムの形態形成を解明する自動化された3D光コヘレンス断層撮影

緑膿菌のバイオフィルム構造に対する抗菌薬による変化は、嚢胞性線維症および慢性肺感染症の患者から培養された臨床分離株によって異なります。共焦点顕微鏡法に続いて、COMSTATソフトウェアを使用して、個々の分離株のバイオフィルム構造(表面積、厚さ、バイオマスなど)の変動を定量化し、抗感染剤の有効性を評価できます。...

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

ここでは、さまざまな根圏土壌から相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを確立するための迅速かつ標準化された手順を紹介します。これは、複雑な根圏土壌微生物叢を調査し、シミュレートするために設計された独自のプロトコルです。...

根圏土壌からの多種バイオフィルム群集構築へのアプローチ

学ぶバイオフィルムと環境の相互作用を特徴付ける方法。二重入口マイクロ流体フローセルシステムを構築し、グルコース勾配を生成して細菌を培養し、3D共焦点顕微鏡で可視化します。蛍光トレーサーとマイクロビーズを用いて溶質輸送と流れ場を解析し、バイオフィルムの生態学的挙動を評価できます。

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

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