Name: 特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ微生物コミュニティの動態解析法。フローサイトメトリーとRパッケージを用いて、バイオガスや活性汚泥サンプルから細胞サイクル状態と染色体複製率を定量化し、生態系の時間的変化を迅速かつ低コストでモニタリングする技術です。

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我々 は感謝してプロシージャと純粋培養と活性汚泥コミュニティのデータセットをそれぞれ提供するマイケル ・ ヤーンと Yuting 郭を認めます。我々 はさらに、バイオガスのコミュニティ サンプルの解析にカトリン ・ Mörters を感謝します。この作業によって賄われていた (FNR、プロジェクト バイオガス指紋 Nr。 22008313) Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe バテレ ドイツの中央政府大臣に代わって食料・農業 (BMEL)、中央技術革新プログラム連邦省の中小企業 (ジンバブエ)経済情勢とエネルギー (BMWi) (INAR 夕べ、16KN043222)、ドイツ Bundesstiftung 環 (DBU、プロジェクト オンデマンドからだ・ フォン ・ Phosphatdünger オーストラリア Reststoffen フォン ブラウエライ und Kläranlage 33960/01-32)、教育のためドイツの中央政府大臣のと研究 (BMBF) (FZK 03XP0041G) とヘルムホルツ協会の資金プログラム指向 (POF III R31 トピック 3 バイオ エネルギー)。

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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Stability+Properties+of+Microbial+Communities+Assessed+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry.</a> mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).</li>
<li>Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li>
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<li>Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+flow+cytometry+reveals+microbial+dynamics+influenced+by+concurrent+natural+and+operational+events+in+groundwater+used+for+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 6, 38462(2016).</li>
<li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li>
<li>Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+tool+for+characterization+of+microbial+cultures+by+combining+cytomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Determination+of+Plasmid+Copy+Number+of+Flow-Sorted+Cells+using+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).</li>
<li>Koch, C., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li>
<li>Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li>
<li>Günther, S., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning%3A+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li>
<li>Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326(2017).</li>
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</ol>

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微生物の個体群と群集の解析に成功には、適切にチューニングされた cytometers、セルのパラメーターの適切な選択、サンプリング、測定、データの評価に向けた固定から信頼性の高いワークフローが必要です。選択したセルのパラメーターする必要があります利用可能な励起波長のコンソート。使用し、低濃度に非常に敏感である DAPI をお勧めしますしかし標準の cytometer セットアップで通常構成されていない紫外線レーザーによって励起する必要があります。他の染料は、サイバーなど緑の私、また、汚れ全体集団やコミュニティが一般的に劣っている解決策を提供します。微生物群集の魚プロシージャまたは生存率テストを使用してはお勧めしません。これらのアプローチは、定量化、およびコミュニティの個々 の種への影響は不明であるために、制御を確認することが可能ではありません。彼らに確実にテスト不能、典型的なコミュニティの相当な割合はまだ純粋な文化として利用できない限り。
セルの並べ替えと同様、サンプリングと固定の手順、プロトコルで重要な手順が含まれます。サンプリングすることができます特定の純粋培養とフロックに集計またはサンプル マトリックスの粒子に付着する微生物群集の傾向によって複雑になります。これらの凝集体を放散し、フローサイトメトリーによる解析結果の信頼性を保証するためにそれらを導入する前に、サンプル内のセルを区切るが欠かせません。発表準備のプロトコルが単一細胞解析を可能にする最適化されました。最終 50 μ m のろ過は、残留集計セルソーターの 70 μ m ノズルとアナライザーの流れキュベットの目詰まりを防止し測定の前に実行されます。廃水処理プラントからセル フロックは、特に豊富な堅牢であり、システムの機能に不可欠です。汚泥ベース確立されたプロトコルをテストする本格的な排水処理プラントの別のタンクで微生物と、浮遊性を調査しました。集計した消費明らかに細胞集塊形成汚泥と群集組成は安定していた。さらに、浮遊性と汚泥ベースのコミュニティはすべての 3 つのサンプル タンク (図 8、補助ファイル 1-S10) でそれらの間の顕著な類似性を展示しました。これらの結果はホルムアルデヒド、エタノール執着の新鮮な -、ホルムアルデヒド処理 - 比較 16S rDNA 増幅配列による検証した-、および並べ替えられたサンプル10。それにもかかわらず、非常に強力なバイオ フィルム細菌密接に接続されたチェーンの成長などの環境試料に挑戦できない可能性が放散します。土壌サンプルは、ユビキタスの粒子、ヒストグラムに表示によって豊富なセルが見えなくなるとは特に問題があります。このような場合、伝統的な配列方法は適用する必要があります。
すべての新しいサンプル セットの固定の安定性は、結果の妥当性を保証するための実験を設計する前にテスト必要があります。良い固定の安定性には、プールされた染色と 1 日に複数のサンプルの時間ポイントの測定もできます。さらに、レプリケーションの測定と回顧セルソート決定的なタイム ポイントのまとめと実験の最終的な評価の後をできます。純粋培養の固定の安定性は 28 日間で (図 9) を確認しました。敷地内の実験サンプル輸送を含む、固定安定性は (この例では、活性汚泥のコミュニティのため 60 日、バイオガスのコミュニティの補足ファイル 1 S9 の 195 日) で長い期間にわたってテストしてください。
染色は通常問題ではありませんが、バイオ情報評価ツールのアプリケーションを許可する生物学的標準で制御する必要があります。大腸菌BL21 のモックのひずみを使いました (DE3) ASC プロトコルによると執着は、すべて染色バッチで使用するための備蓄します。
DAPI、SYBR グリーンから離れて私がされて正常に適用数年14,23,24,25,26の微生物コミュニティを解決します。SYBR グリーン高および低核酸サブセット (HNA および LNA) にコミュニティを解決することができますオンラインのやり方で生きている細胞を用いたします。DAPI、DNA への結合の詳細し 1 つのサンプル セットに 50 以上のサブコミュニティの区別をできるようにしかし、染色する前に固定の手順が必要です。
セルの並べ替えこのアプローチの顕著な特徴は、特定のサブコミュニティがさらに関心のある場合に適用できます。それも PFA (30 分だけ実行されます) もエタノール処理または10を汚す DAPI が後続 16S 私アンプリコン シーケンスにマイナスの影響を持っていたことを強調する必要があります。固定の潜在的な影響し、ステイニングがサブコミュニティ メタゲノム解析はまだテストする必要があります。
多くのコミュニティ機能とトレンドのダイナミクスに関する情報ことができる並べ替え方法から独立したバイオインフォマティクスのツールは、仮想細胞による細胞レベルのコミュニティ機能を解決および非生物的でこれらの機能を接続を含む場合パラメーター。
最近、新しいバイオインフォマティクス評価ツール、両方のサイバーのためすべての有用な数は私と DAPI アプローチ グリーン、フローサイトメトリーによるコミュニティがパターンを解決するために開発されました。これらの FlowFP27、(flowCHIC20、flowCyBar28), 本研究では、パッケージを使用して新鮮な水社会29設立デコンボリューション モデルとによると自分の生理系統を区別するためのツール特徴30。また、フローサイトメトリーによる多様性が断固とした25をすることができます、オンライン ツール10微生物群集のも安定性が続く今ことができます。
したがって、フローサイトメトリー解析における微生物群集と非生物的パラメーター相関の迅速な評価になったら大きな利点があります。しかし、まだメソッドには制限があります。それは、経験に基づいてゲート設定プロシージャのための flowCyBar ツールを使ってオンライン本当に適用できません。さらに、カスタムメイドで使いやすい流れの cytometers の開発は流れフローサイトメトリー マイクロバイ分析アプローチによる増殖を大きく前進するでしょう。この方向の最初のステップは引き受けられた28です。
それにより細菌の世代時間の範囲内で高周波の監視と生態学的パラダイムがフローサイト メーター データ5 に適用されることが示されている、微生物生態学、微生物フローサイトメトリーの応用を想定することができます。 ,10。メソッドはスイス連邦共和国の31の必須飲料水コントロールのような自然環境の定期上映のため非常に便利です。それは人間15または動物32マイクロバイ スクリーニングのような医療用の貴重なツールにすることができます。さらに、バイオインフォマティクスの最新動向が微生物の管理下システムのプロセス コントロールに不可欠なセンサーをする微生物フローサイトメトリーを有効にします。微生物群集フローサイトメトリーは、高解像度の特定のコミュニティのサブセットのゲノムの調査を可能にする細胞の選別のスクリーニング ツールを提供します。

微生物は、生きている人間の多くの面で重要な役割を果たします。彼らは惑星の炭素、窒素、リン、硫黄サイクル12,3を分解と同様、廃水処理などの様々 な産業で4生体触媒の合成として法の主要な生物的ドライバー5やバイオ6。彼らは人間の健康および代謝7、8に直接的な影響は人間のマイクロバイを構成します。したがって、構造、関数および即時の環境への応答における微生物の挙動については、完全に理解し、これらのシステムを操作を目指すなら必要です。次世代シークエンシング (NGS) はマイクロバイ構造と機能9を解決する技術の確立です。ただし、解析と NGS データの評価定量的な情報を得られることはできません、まだ高価、時間のかかる、廊下のパフォーマンスでは敷地内の結果を提供すること準備ができているです。いくつかの細菌は、1 h と常に一定の環境の10のコミュニティ構造の変化の原因の下の生成時刻を表示します。次のようなダイナミクス シーケンスのアプローチを使用して最も科学的研究所の金融・労働力容量をオーバーしました。
対照的に、フローサイトメトリーは、時間、労働とコスト効率を維持しながら NGS データと同様にコミュニティ指紋を提供できます。流れフローサイトメトリー技術単一セルのレベルの微生物群集動態線に従うことを紹介します。異なり、NGS、フローサイトメトリーは機能遺伝子系統所属や情報を提供していません、定量的細胞数を提供します。フローサイトメトリーを用いた微生物群集が明瞭な光散乱と蛍光特性 ((FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) がわかるようにセル サイズと細かさでそれぞれ) サブコミュニティに解決できます。提示方法を主に利用してセル サイズ- および DNA 量の特定の細胞の種類と生理 (成長) の状態に関連付けられている関連する情報。DNA 量は、UV-興奮 4', 6-diamidino 2'-phenylindole (DAPI) DNA の AT リッチ領域にバインドし、異なる染色体レベルを解決することができますも染料を使用して定量化されます。DAPI の蛍光と FSC を組み合わせることによって 50 以上のサブコミュニティ区別および監視が可能時間11とともに組成を変えることを。サブコミュニティの豊富なバリエーションが pH と製品価12, グローバル パラメーター、天気13,14などまたは腸や唾液の場合など、マイクロ環境の環境の変化を関連付けることができます。特定の治療15内細菌叢解析。これらの相関関係には、キーのサブコミュニティがコミュニティ全体の代謝ネットワークの特定の機能を担当が明らかにします。キーのサブコミュニティが具体的に昇格または周囲の微小環境を変えることによって抑制したり後続のシーケンス15やプロテオームの調査のための16のためにソートします。
ただし、微生物群集フローサイトメトリー確立されていませんまだ広く流量フローサイトメトリー装置微生物集団あるいはコミュニティを正しく解決することができる数がかなり低いため。さらに、効果的なデータ評価、コミュニティ解析パイプラインの経験の欠如は、マイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入の障壁を提起するかもしれない。これらの問題に取り組むために包括的なワークフローを設けています。一般的な適用性を示すためには、それを 3 模範的なサンプル セット (補足ファイル 1 S1)、すなわち私に示します) バイオ テクノロジー用に定義された明確な媒体 (シュードモナスの putida KT 2440 上で成長して純粋培養 (PC)ブドウ糖)、ii) 明確な媒体 (合成廃水の活性汚泥コミュニティ (ASC)) と iii で複雑な実験コミュニティ) 密な行列 (トウモロコシのサイレージのコミュニティ (BC) バイオガス) の自然環境から複雑なコミュニティ。
それぞれのサンプル セットのプロトコルの選択に影響を与えるいくつかの要因。深い凍結は有毒な化学薬品の使用を好まれる場合がほとんどショック フロスティングのため液体窒素の使用のためのラボ環境に限定。ホルムアルデヒドの安定化とその後エタノール固定により、分注の準備を必要とせず一括サンプリングと長期間にわたって安定する証明されています。タンパク質フロック、ホルムアルデヒド、次は好ましくない信号雑音比を引き起こす可能性がありますので、人間の唾液15などのタンパク質が豊富なサンプルは、問題となるかもしれません。サンプルの乾燥、この比較での手順のほとんどの時間 (合計で約 1 時間) がかかりますが、有毒化学物質なしサイトで実行することができます。それは、チューブ、冷却またはその他の危険注意せず簡単に出荷することで安定したペレットを得られます。さらに、提案された11をされているたくさんの代替の固定方法。新しいサンプル セットを導入するとき、異なるプロトコルの解像度と固定の安定性をテストするを強くお勧めします。
セットを分析する 2 つの異なる流れの cytometers を使いました: セルソーターと現場適用5に適して表示されます ii) アプリケーション ベンチのトップ アナライザー i) 洗練された高価な研究が中心します。BC は、PC や ASC はセルソーターで測定されたベンチ トップ アナライザーで測定しました。3 つの模範的なサンプルの分析は、最適化された再現性、サンプルの安定性とワークフローの利便のため必要な異なったプロシージャを設定します。次のプロトコルは 3 つの異なるシステムのセクションを指定します。

<table><tbody><tr><td>Milli-Q System Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltration Cartridge</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp;</td><td>Coherent, Inc., Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc., Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Photomultiplier tubes R928 and R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 software</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &micro;m&nbsp;FluoSpheres</td><td>Molecular Probes、オレゴン州ユージーン(米国)</td><td>F8815</td><td>350/440青色蛍光</td></tr>灯<tr><td>2 &mu;m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes、オレゴン州ユージーン(米国)</td><td>F-8827</td><td>505/515黄緑色蛍光ビーズ&nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 &mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &mu;m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 青色蛍光</td></tr><tr><td>1 &micro;mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes、オレゴン州ユージーン(米国)</td><td>F-13081</td><td>505/515黄緑色蛍光ビーズ&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp;</td><td>シスメックス株式会社(神戸)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,Coherent</td><td>, Inc.(サンタクララ(米国)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 series PMT 浜</td><td>松ホトニクス(浜松市)(日本)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMaxソフトウェア</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml;rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>all optical filters</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>ビルド番号: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>Rコアチーム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

純粋培養の調査と微生物群集の動態のモニタリングは、理解し、自然の生態系と微生物によって駆動される技術的なアプリケーションを制御することが重要です。次世代配列方法は広く、内細菌叢解析を解決する利用が、彼らは、一般的にリソースと時間がかかるほとんど質的情報を提供します。フローサイト マイクロバイそれらの欠点に苦しまないし、相対サブコミュニティ微量含有量と絶対に提供することができます携帯番号ラインで。それは直接の系統情報を提供しないが、分析深さとアプローチをシーケンスの解像度が向上します。医療研究のルーチンの設定とは対照的に、フローサイトメトリーはまだ広くマイクロバイ分析に使用されます。サンプル準備およびデータ解析パイプラインの不足している情報は、よく教科書の流れ cytometry アプリケーションになるマイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入障壁を作成できます。ここでは、純粋培養のための 3 つの包括的なワークフローを提案する、複雑なコミュニティがそれぞれ挑戦的な行列の中で複雑なコミュニティをクリアします。我々 は個々 のサンプリングと固定の手順を記述する、それぞれのサンプルのセットのプロトコルを汚すを最適化します。手の込んだ複雑な研究の中心とフローサイトメトリー解析とアプリケーション集中ベンチ トップ デバイス、プロシージャを並べ替えセルを記述する、データ分析パッケージを提案します。さらに重要な実験的コントロールを提案し、, それぞれのサンプル セットに提示されたワークフローを適用します。

次の代表的な結果複製の必要性を強調し、3 つのサンプル セットのそれぞれに異なるデータの可視化と解析テクニックを例示します。彼らはそれぞれのセットについて標準的な研究の質問に適したデータ評価パイプラインの結果を表示します。ただし、本技術はで示されているサンプル セットに排他的ではありません。流れの cytometry の生データはで、FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 公に利用可能にしました。以前アップロードした ASC データは ID FR FCM ZYD7 の下で利用です。
生物的および技術的なレプリケートされた撮影、準備、公開プロトコル11によると分析します。PC と ASC から生物の複製は、3 つの並列のフラスコから撮影されました。紀元前の生物の複製は、パイロット プラントで 1 つの場所で 3 つの後続サンプリングとして撮影されました。1 つのサンプルの 3 つの因数が固定、染色、技術の再現性を確保するために分析します。以前公開された手順11によると方法の再現性を評価しました。ゲート当たりの標準偏差 (%) を計算するため、1 つのサンプル セット (補足ファイル 1-S6) のすべてのサンプル ゲート テンプレートの使用。
PC の相対的な豊かさの最大の標準偏差は 3.44% 平均の標準偏差は 2.13% (図 1)。ASC と BC は、相対的存在量の最大の標準偏差では、標準偏差の平均値, 2.13% 0.21% (補足ファイル 1-S8) 間 1.27% 0.88% とあった。
標準的な手順、純系文化を調査するときは成長曲線の遅れ位相、世代時間、特定の条件下で細胞密度を分析するための準備です。我々 は、システム (図 2) のより深い理解を達成するためにフローのフローサイトメトリーによる解析のワークフローとこの手順を組み合わせます。DAPI 対 FSC 蛍光プロットでは、バッチ文化のさまざまな時点で文化の細胞周期の状態を明らかにします。マスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を設立 (c1n)、1 つの細胞の割合を定量化する 2 つ (c2n) と複数の染色体 (cXn、図 2 b)。接種の細胞の支配的な割合は、1 つだけの染色体 (93.7 %0 h) を持っていた。これは指数関数的成長は、ほぼすべての細胞に含まれる 1 つ以上 (4 h、99.6%)、(53.1%) の人口の半分はさらに 2 つ以上の染色体を含んでいた以上の間に大きく変化しました。これは、その生成時よりその染色体を複製するP. putidas 機能を示しています。
フローサイトメトリーによる解析は、微生物群集の進化を監視するため非常に役立っています。それは群集の動態をより多くのリソース集中的な分子法5,10よりはるかに近いを従うことができます。我々 は映画でこれらのダイナ ミックスを強調表示され、時間の経過とともに活性汚泥コミュニティ シフトの概要を得た。各 1 秒のフレームは、サンプル ポイント (補足ファイル 2) の FSC 対 DAPI 蛍光プロットを示しています。0 日目と 4 日目の間の非常に明確なシフトは 7 日後コアの共同体の設立が続いた。21 日目に追加サブコミュニティが思い付いた。サブコミュニティ レベルの微生物動態解析を有効なマスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を設立しました。実験のさまざまな段階で支配的なサブコミュニティは、CyBar ツール (図 3) を使用して明確に特定されました。興味深い (キーの時点でトリガーされる豊富で重要な変更) は、ゲートを選択するために助けたと実行可能な相対サブコミュニティ元素の分布とそれを組み合わせること (以上 5% 相対量) の並べ替え、さらに解析22。
工業規模バイオリアクター アプリケーション動揺制限のための潜在的な不に直面できます。彼らは頻繁にまた非合成基板の質の交替のような操作上のパラメーターを変更するのに公開されます。紀元前は、このようなシステムを表し、動的なプラグ流反応器で異なる場所からサンプリングされました。模範的なサンプル ポイントの DAPI 対 FSC 蛍光プロット (図 4) のみ少し空間が発音的異質性を示します。BC は両方を使用してさらに調べた、高速自動シックなより詳細なマスター ゲート テンプレート ベースの CyBar アプローチ。
自動で高速かつ公平な本来産業設定で現地管理バイオ プロセスのために特に興味深いシックをなります。すべての使用可能なサンプルの生 .fcs データを比較します。これらの比較の 2 つの図 5で表示されます。非類似度計算結果では、時空の不均一性に関する前の観察を確認してください。NMD 作成されたプロット フォーム シックなツールの非類似度行列 (図 6) はさらにこの結果を実証し、それに応じてそれを可視化します。
さらに、マスター ゲート テンプレート (補足ファイル 1-S6) を使用して紀元前の 23 サブコミュニティの相対的な存在量を算出しました。微生物群集の機能の関係を理解する 48 サンプルを 1 年の期間からの相関分析を行った。これはさらなる調査 (4 セルの並べ替え) のための興味の門を識別するために助けることができます。非生物的パラメーターを正または負の強い相関が好き価が理解して生態系やバイオ テクノロジーの手法を最適化する助けることができる製品です。この相関関係 (図 7) に含まれている有機物負荷率は、このような非生物的パラメーターを例証します。G10、G4 G5 強い正の相関関係を展示し、G8 に負の相関がメタン生成アーキアの方にヒントがあります、おそらく、発酵種を含めることができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> 図 1: 純粋培養のフローサイトメトリーによる解析の再現性です。FSC 対 DAPI の蛍光は、誤差 ± 1 標準偏差 (C, D) を表すしてコントロール ビーズ (A, B) とバーの 3 サブコミュニティ微量含有量 [%] のプロットを印刷します。相対的な存在量は、補助ファイル 1 S6 で示されるゲートのテンプレートから決定しました。A、B および C は、4 h で成長曲線の撮影された 3 つの生物学的複製と 3 技術的複製 P1、P2、P3 サンプル A から準備ができていたし、三度、それぞれ測定: M1、M2、M3 で彼らのそれぞれの標準偏差であります。50,000 イベントがセル ゲートに記録されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> 図 2: 成長カーブの時に撮影した純粋培養の細胞周期解析実験 (A) 以上 12 h..FSC 対 DAPI の蛍光は、指数関数的成長段階で DNA 量の変化を示す双方向時間サンプリングのプロットします。この測定シリーズは、ビーズ (補足ファイル 1 S3 を参照) には含まれません。(B).光密度ベースの成長曲線と誤差範囲 ± 1 標準偏差と、サブコミュニティの相対的な存在量を時間をかけて表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> 図 3: 活性汚泥の群集構造 24 日間にわたって進化。(A) flowCyBar 傾向の類似性によって並べられたそれぞれのゲートのひげで視覚化される周波数分布を重ねることで、対応するカラー キー (B) と NMD プロット ウィット R の類似性解析 &lt; 0.001 (C). 基になるプロットが補足のファイル 2 のフィルム順序で表示されます。補足ファイル 1-S6 でゲートのテンプレートを使用して相対的な存在量を求めた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> 図 4: 産業規模で微生物群集構造の空間的で、一時的な不均一性プラグ フローリアクター バイオガス。4 つの微生物群集構造の比較 (A) サンプリング ポート I ~ IV 223 日。(B) 日 384 ポートの 0 日から時間依存の社会構造の変化の比較 II。ノイズは、可視化を強化する遅ればせながら切断されています。250,000 イベントはセル ゲート (補足ファイル 1-S6) で測定した.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> 図 5: フローサイトメトリーによるヒストグラム イメージ比較-シックな。シックなアルゴリズムの原理は、それぞれ時空の不均一性を表す 2 つのサンプルを比較することによって例証されます。(i) シックなイメージは、(FSC 対 DAPI 蛍光) を表示する 2 つのパラメーターを選択した後、.fcs ファイルから作成されます。グレースケール (0-255) のピクセルのイベント カウントをコードします。(セルが含まれる領域を指定した後 ii) シックなサブセットが生成されます (ここで: 200 &lt; &lt; 4000、200 x &lt; &lt; 2200 y)。(iii) XOR 組み合わせイメージがサブセット間のピクセルを比較することによって作成されます。差は 0 に等しく、黒として表示されます。差の最大値は 200 に等しい、白として表示されます。対応する XOR 値は、XOR イメージのすべてのピクセルのグレースケール値を追加することによって計算されます。(iv) オーバーレイの組み合わせイメージがサブセットのピクセルのグレースケール値を追加することによって作成されます。対応するオーバーレイの値は、ゼロにしないし、そのための情報が含まれているオーバーレイ イメージのピクセルを数えることによって計算されます。(v) 非類似度の値は、XOR とオーバーレイの値で除して計算されます。これらは、図 6の NMD のプロットのための基礎です。非類似度の値と両方 NMD のプロットをごくわずか空間- と顕著な一時的なコミュニティ不均質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> 図 6: シックに基づくバイオガスのコミュニティ サンプルの類似性解析します。0 日のサンプルは、歪曲的な分析 (補足ファイル 1 S11) 非常に異なるコミュニティ構造のためこのプロットから除かれました。NMD のプロットは、低空間についての仮定を確認する-より高い間的異質性シックなツールを使用して、図 5で説明します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> 図 7: バイオガス コミュニティ相関分析します。マトリックスはスピアマンの順位係数を算出したし、補足ファイル 1 S6 マスター ゲート テンプレートで決定された 23 のサブコミュニティの相対的な存在量に基づきます。1 年の期間からの 48 のサンプルの有機物負荷率 (OLR) と相関します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> 図 8: 浮遊性 (P) と汚泥の類似性解析による排水中 (S) コミュニティ。プライマリ浄水 (PCL) 活性化汚泥盆地 (AS) と本格的な廃水処理プラント (補足ファイル 1 - s10 ドット プロット) のダイジェ スター タンク (DT) から採取しました。補足ファイル 1 S6 で示されるゲートのテンプレートを使用して相対的な存在量を求めた。これらのサブコミュニティ元素 CyBar (補助ファイル 1-S10) と NMD を作成する flowCyBar ツールを使って解析したプロット (R &lt; 0.01)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> 図 9: 純粋培養の固定安定性。0 h で撮影した成長曲線の実験からのサンプルは、15% のグリセロールの固定後は-80 ° C で 28 日間で格納されていました。FSC 対 DAPI の蛍光は、ビーズが表示されますコントロールして印刷します。計測のシリーズでは、ビーズ (補足ファイル 1 S3) は含まれません。50,000 イベントがセル ゲート (補足ファイル 1-S6) で記録されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足ファイル 1:<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。
2 の補足ファイル:<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。

フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3 つの包括的なワークフローを提案します。

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

この方法は、例えば、微生物生態学やバイオテクノロジーにおける重要な疑問、例えば、どの生態学的概念が特定の生態系を動かしているかという問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、非常に費用対効果を維持しながら、短間隔サンプリング体制で追従急速なマイクロバイオームダイナミクスを閉じるために使用できることです。この方法は、バイオテクノロジーおよび天然の微生物群集に関する情報を取得するために、また、栄養状態および健康状態のための動物およびヒトのマイクロバイオームに関する情報を取得するために使用できます。手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であり、SediMeterオペレーターであるFlorian Schattenbergです。バイオガスコミュニティサンプルを乾燥させるには、改造した1ミリリットルのピペットチップを使用して、200マイクロリットルの粘性消化物を1.7ミリリットルのPBSを含む2ミリリットルのチューブに移します。十分に混合した後、チューブを超音波浴に1分間入れて、大きな細胞凝集体を溶解し、植物細胞残渣に付着した細胞を接着します。超音波処理後、サンプルを十分に混合し、50マイクロメートルの細孔メッシュストレーナーを介して細胞を2ミリリットルのプラスチックチューブにろ過します。濾液を4つの400マイクロリットルのアリコートに分割し、アリコートを2回遠心分離し、上清を完全に廃棄して、微生物サンプルを機械的に可能な限り完全に脱水します。次に、加熱された真空遠心分離機でサンプルを乾燥させて安定したペレットを作成し、光から保護された摂氏4度でペレットを保管します。活性汚泥サンプルの安定化と固定のために、細胞の4ミリリットルを遠心分離し、ペレットをPBS中の2パーセントホルムアルデヒドの4ミリリットルに再懸濁します。室温で30分後、安定化した細胞サンプルを遠心分離し、ペレットを4ミリリットルの70%エタノールに固置してマイナス20°Cで保存します。0.6ミリリットルの固定細胞懸濁液を1.4ミリリットルのPBSを含むガラス管に混合して移し、十分に混合した後、示されているように10分間超音波処理します。超音波処理の最後に、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを2ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁します。十分に混合した後、示したように細胞を5分間超音波処理し、新鮮なPBSでOD700ナノメートルを035に調整します。遠心分離により細胞を回収し、0.11モルのクエン酸と4.1ミリモルのtween 20を含む1ミリリットルの透過吸収緩衝液にペレットを再懸濁し、十分に混合しながら室温で20分間インキュベートします。次に、遠心分離によって細胞を回収し、0.68マイクロモルのDAPIを含む2ミリリットルの染色溶液にペレットを完全に再懸濁し、室温で少なくとも60分間インキュベートし、光から保護します。ビーズキャリブレーションの場合は、リニアキャリブレーション用のビーズミックスをフローサイトメーターにロードし、ノズルとレーザー光学系の位置を操作しながらビーズを連続的に測定して、装置をリニア範囲で事前にキャリブレーションします。ビーズのピークをプリセットキャリブレーションテンプレートに収めることができたら、ログモードに切り替えて、対数キャリブレーションビーズサンプルをロードします。対数ビーズのピークを事前に設定されたキャリブレーションテンプレートに合わせ、機器のハードウェアを微調整し、光電子増倍管のゲイン設定を使用してビーズの位置に必要な最終調整を行います この手順の最も重要な側面は、実験間の比較を可能にするために一貫した測定を維持することです。したがって、毎日のサイトメーターのキャリブレーションと、生物学的な転倒蓋でのビーズの使用は、ゆっくりとしたサイトロームマイクロバイオーム透析の成功に不可欠です。細胞の準備ができたら、サンプルを混合してろ過し、対数ビーズミックスを細胞に加えます。次に、サンプルを混合してサイトメーターにロードし、染色された細胞を含め、ノイズとビーズを排除するゲートを作成します。次に、セルゲート内で250, 000個の細胞が検出されるまで、毎秒3, 000イベントの最高速度でサンプルセットを連続して分析します。フローサイトメトリーのデータを解析するには、すべてのサンプルで使用するためのマスターゲートテンプレートを開発します。まず、フローサイトメトリーの標準ファイルを適切なフローサイトメトリー解析プログラムにロードし、サンプルを連続して処理します。サンプルをロードし、測定値をダブルクリックし、それぞれのドロップダウンメニューからX軸とY軸のパラメータを選択して、前方散乱光とDAPI蛍光プロットを開きます。ポリゴン描画ツールを使用して、以前に生成された測定セルゲートを再現し、ビードとノイズを除外し、それに応じてゲートに名前を付けます。セルゲートエントリをすべてのサンプルグループリストにドラッグし、セルゲートをダブルクリックしてセルイベントのみを選択的に表示します。楕円形ゲートツールを使用してサンプルに多く存在するサブコミュニティを定義し、それらをプールします。次に、マスター ゲート テンプレートがすべてのサンプルに収まるまで、サブコミュニティの割り当てと後続のサンプルを追加します。サイドスキャッタースキャン方式でマスターゲートのテンプレートを制御し、互いに近接するサブコミュニティのクラスタリングを解決します。次に、すべてのサブコミュニティをテーブル・エディターに追加し、出力統計を親の頻度に設定します。テーブルエディタを使用して、相対的なサブコミュニティの存在量を適切なスプレッドシートソフトウェアにエクスポートし、サイドバーマニュアルのガイドラインに従ってデータのフォーマットを調整します。次に、サブコミュニティのダイナミクスと相関関係を視覚化するために、Rパッケージをインストールしてロードし、txtファイルを読み込んで正規化します。前方散乱光とDAPI蛍光プロットは、バッチ培養のさまざまなポイントにおける純株培養の細胞周期状態を明らかにします。次に、マスターゲートテンプレートを使用すると、1つ、2つ、または複数の染色体を持つ細胞の割合を定量化でき、たとえば、この代表的な微生物がその染色体を生成時間よりも速く複製する能力が明らかになります。複雑な微生物群集を経時的に調査する場合、群集シフトのペースと重要性は、ドットプロットシーケンスで簡単に視覚化できます。実験のさまざまな段階における優占的なサブコミュニティは、サイトメトリーバーコードツールを使用して明確に特定できます。このデータを相対的なサブコミュニティの存在量の頻度分布と組み合わせることで、重要な時点での存在量に有意な変化を示すゲートを選択できます。このデータを非メトリック多次元スケーリングプロットで視覚化すると、コミュニティダイナミクスの理解を深めることができます。バイオガスコミュニティは、攪拌の制限により、空間的な不均一性に直面する可能性があります。例示的なバイオガスコミュニティのサンプルポイントは、空間的なものはほとんど示されませんが、顕著な時間的不均一性を示します。製品タイターのような非生物的パラメータとの強い正または負の相関関係は、生態系とバイオテクノロジープロセスの理解と最適化に役立ちます。さらに、その後の選別や分析のために、特に関心のあるゲートの同定を容易にします。この手順を確立する際には、新しいサンプルセットごとにさまざまな固定および染色手順を評価して、それらの性能と安定性を評価することをお勧めします。選別後、アンプリコンシックフェンシング、メタゲノミクス、プロテオミクスなどのさらなるアプローチを適用して、代謝経路の活性状態に関する原始遺伝的所属に関する情報を提供する上位のコミュニティを選択できます。この方法は、微生物生態学者やバイオプロセスエンジニアが、資源を合理的に投資しながら、自然で制御された生態系のマイクロバイオームダイナミクスを追跡する道を開きました。

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野生生物からの蠕虫の収集と同定

学ぶ微生物コミュニティの動態解析法。フローサイトメトリーとRパッケージを用いて、バイオガスや活性汚泥サンプルから細胞サイクル状態と染色体複製率を定量化し、生態系の時間的変化を迅速かつ低コストでモニタリングする技術です。

特徴マイクロバイダイナミクス-フローサイトメトリーベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

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