特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー
July 12th, 2018
フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3 つの包括的なワークフローを提案します。
この方法は、例えば、微生物生態学やバイオテクノロジーにおける重要な疑問、例えば、どの生態学的概念が特定の生態系を動かしているかという問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、非常に費用対効果を維持しながら、短間隔サンプリング体制で追従急速なマイクロバイオームダイナミクスを閉じるために使用できることです。この方法は、バイオテクノロジーおよび天然の微生物群集に関する情報を取得するために、また、栄養状態および健康状態のための動物およびヒトのマイクロバイオームに関する情報を取得するために使用できます。
手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であり、SediMeterオペレーターであるFlorian Schattenbergです。バイオガスコミュニティサンプルを乾燥させるには、改造した1ミリリットルのピペットチップを使用して、200マイクロリットルの粘性消化物を1.7ミリリットルのPBSを含む2ミリリットルのチューブに移します。十分に混合した後、チューブを超音波浴に1分間入れて、大きな細胞凝集体を溶解し、植物細胞残渣に付着した細胞を接着します。
超音波処理後、サンプルを十分に混合し、50マイクロメートルの細孔メッシュストレーナーを介して細胞を2ミリリットルのプラスチックチューブにろ過します。濾液を4つの400マイクロリットルのアリコートに分割し、アリコートを2回遠心分離し、上清を完全に廃棄して、微生物サンプルを機械的に可能な限り完全に脱水します。次に、加熱された真空遠心分離機でサンプルを乾燥させて安定したペレットを作成し、光から保護された摂氏4度でペレットを保管します。
活性汚泥サンプルの安定化と固定のために、細胞の4ミリリットルを遠心分離し、ペレットをPBS中の2パーセントホルムアルデヒドの4ミリリットルに再懸濁します。室温で30分後、安定化した細胞サンプルを遠心分離し、ペレットを4ミリリットルの70%エタノールに固置してマイナス20°Cで保存します。0.6ミリリットルの固定細胞懸濁液を1.4ミリリットルのPBSを含むガラス管に混合して移し、十分に混合した後、示されているように10分間超音波処理します。
超音波処理の最後に、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを2ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁します。十分に混合した後、示したように細胞を5分間超音波処理し、新鮮なPBSでOD700ナノメートルを035に調整します。遠心分離により細胞を回収し、0.11モルのクエン酸と4.1ミリモルのtween 20を含む1ミリリットルの透過吸収緩衝液にペレットを再懸濁し、十分に混合しながら室温で20分間インキュベートします。
次に、遠心分離によって細胞を回収し、0.68マイクロモルのDAPIを含む2ミリリットルの染色溶液にペレットを完全に再懸濁し、室温で少なくとも60分間インキュベートし、光から保護します。ビーズキャリブレーションの場合は、リニアキャリブレーション用のビーズミックスをフローサイトメーターにロードし、ノズルとレーザー光学系の位置を操作しながらビーズを連続的に測定して、装置をリニア範囲で事前にキャリブレーションします。ビーズのピークをプリセットキャリブレーションテンプレートに収めることができたら、ログモードに切り替えて、対数キャリブレーションビーズサンプルをロードします。
対数ビーズのピークを事前に設定されたキャリブレーションテンプレートに合わせ、機器のハードウェアを微調整し、光電子増倍管のゲイン設定を使用してビーズの位置に必要な最終調整を行います この手順の最も重要な側面は、実験間の比較を可能にするために一貫した測定を維持することです。したがって、毎日のサイトメーターのキャリブレーションと、生物学的な転倒蓋でのビーズの使用は、ゆっくりとしたサイトロームマイクロバイオーム透析の成功に不可欠です。細胞の準備ができたら、サンプルを混合してろ過し、対数ビーズミックスを細胞に加えます。
次に、サンプルを混合してサイトメーターにロードし、染色された細胞を含め、ノイズとビーズを排除するゲートを作成します。次に、セルゲート内で250, 000個の細胞が検出されるまで、毎秒3, 000イベントの最高速度でサンプルセットを連続して分析します。フローサイトメトリーのデータを解析するには、すべてのサンプルで使用するためのマスターゲートテンプレートを開発します。
まず、フローサイトメトリーの標準ファイルを適切なフローサイトメトリー解析プログラムにロードし、サンプルを連続して処理します。サンプルをロードし、測定値をダブルクリックし、それぞれのドロップダウンメニューからX軸とY軸のパラメータを選択して、前方散乱光とDAPI蛍光プロットを開きます。ポリゴン描画ツールを使用して、以前に生成された測定セルゲートを再現し、ビードとノイズを除外し、それに応じてゲートに名前を付けます。
セルゲートエントリをすべてのサンプルグループリストにドラッグし、セルゲートをダブルクリックしてセルイベントのみを選択的に表示します。楕円形ゲートツールを使用してサンプルに多く存在するサブコミュニティを定義し、それらをプールします。次に、マスター ゲート テンプレートがすべてのサンプルに収まるまで、サブコミュニティの割り当てと後続のサンプルを追加します。
サイドスキャッタースキャン方式でマスターゲートのテンプレートを制御し、互いに近接するサブコミュニティのクラスタリングを解決します。次に、すべてのサブコミュニティをテーブル・エディターに追加し、出力統計を親の頻度に設定します。テーブルエディタを使用して、相対的なサブコミュニティの存在量を適切なスプレッドシートソフトウェアにエクスポートし、サイドバーマニュアルのガイドラインに従ってデータのフォーマットを調整します。
次に、サブコミュニティのダイナミクスと相関関係を視覚化するために、Rパッケージをインストールしてロードし、txtファイルを読み込んで正規化します。前方散乱光とDAPI蛍光プロットは、バッチ培養のさまざまなポイントにおける純株培養の細胞周期状態を明らかにします。次に、マスターゲートテンプレートを使用すると、1つ、2つ、または複数の染色体を持つ細胞の割合を定量化でき、たとえば、この代表的な微生物がその染色体を生成時間よりも速く複製する能力が明らかになります。
複雑な微生物群集を経時的に調査する場合、群集シフトのペースと重要性は、ドットプロットシーケンスで簡単に視覚化できます。実験のさまざまな段階における優占的なサブコミュニティは、サイトメトリーバーコードツールを使用して明確に特定できます。このデータを相対的なサブコミュニティの存在量の頻度分布と組み合わせることで、重要な時点での存在量に有意な変化を示すゲートを選択できます。
このデータを非メトリック多次元スケーリングプロットで視覚化すると、コミュニティダイナミクスの理解を深めることができます。バイオガスコミュニティは、攪拌の制限により、空間的な不均一性に直面する可能性があります。例示的なバイオガスコミュニティのサンプルポイントは、空間的なものはほとんど示されませんが、顕著な時間的不均一性を示します。
製品タイターのような非生物的パラメータとの強い正または負の相関関係は、生態系とバイオテクノロジープロセスの理解と最適化に役立ちます。さらに、その後の選別や分析のために、特に関心のあるゲートの同定を容易にします。この手順を確立する際には、新しいサンプルセットごとにさまざまな固定および染色手順を評価して、それらの性能と安定性を評価することをお勧めします。
選別後、アンプリコンシックフェンシング、メタゲノミクス、プロテオミクスなどのさらなるアプローチを適用して、代謝経路の活性状態に関する原始遺伝的所属に関する情報を提供する上位のコミュニティを選択できます。この方法は、微生物生態学者やバイオプロセスエンジニアが、資源を合理的に投資しながら、自然で制御された生態系のマイクロバイオームダイナミクスを追跡する道を開きました。
概要
この記事では、微生物群集動態と純粋培養を調査するためのフローサイトメトリ分析の方法を提示します。単純および複雑な微生物群集の両方からのサンプル採取、処理、およびデータ分析のワークフローを概説します。
主要な研究要素
科学の分野
- 微生物生態学
- バイオテクノロジー
- フローサイトメトリー
背景
- フローサイトメトリーは微生物群集を分析するための強力なツールです。
- この方法により、マイクロバイオームの動態の迅速なモニタリングが可能になります。
- 人間や動物のマイクロバイオームを含む様々なエコシステムに適用できます。
- 微生物動態の理解は、生態学および健康関連の研究にとって重要です。
研究目的
- 微生物群集を分析するための包括的なワークフローを提供すること。
- フローサイトメトリーがマイクロバイオーム動態の研究に効果的であることを示すこと。
- 微生物生態学およびバイオテクノロジーの研究を促進すること。
使用方法
- ピペッティングおよび遠心分離技術を用いたサンプル調製。
- 細胞凝集体の分離のためのソニケーション。
- 染色細胞の分析のためのフローサイトメトリー。
- フローサイトメトリーソフトウェアおよびRパッケージを使用したデータ分析。
主要な結果
- 複雑なサンプルからの微生物細胞の成功的な分離と分析。
- 時間の経過に伴う微生物群集動態の可視化。
- 細胞周期状態および染色体複製率の定量化。
- 一貫したデータ分析のためのマスターゲートテンプレートの開発。
結論
- フローサイトメトリーは微生物群集を研究するための効果的な方法です。
- マイクロバイオーム動態の迅速かつ費用効果の高いモニタリングを可能にします。
- 提供されるワークフローは微生物生態学およびバイオテクノロジーの研究を強化できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Flow cytometry enables rapid, cost-effective monitoring of microbiome dynamics, supporting hypothesis testing in microbial ecology and biotechnology. It provides quantitative subcommunity abundances and absolute cell numbers, enhancing predictive confidence in target validation and translational biomarker discovery. The method bridges discovery and preclinical workflows by delivering reproducible, scalable data for risk-adjusted decision-making in microbiome-targeted interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying microbial subcommunity shifts in response to environmental or compound perturbations.
- Operational Value: Enables functional target validation through reproducible staining and gating protocols across pure cultures and complex communities.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying mechanistically relevant microbial shifts linked to host health or bioprocess outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by delivering standardized, bead-calibrated flow cytometry outputs.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via daily cytometer calibration and master gate template application.
- Scalability: Facilitates high-throughput screening readiness with capacity to process 250,000 events per sample at 3,000 events/second.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase microbiome dynamics to preclinical validation through longitudinal tracking of subcommunity abundance shifts.
- Biomarker Alignment: Enables identification of gates of special interest for subsequent sorting and multi-omics integration (amplicon sequencing, metagenomics, proteomics).
- Mechanistic De-risking: Quantifies cell cycle states and chromosome replication rates to assess microbial fitness and metabolic activity under test conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling continuous microbiome monitoring across workflow stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving microbial community dynamics and identifying drivers of ecosystem shifts.
- Screening: Delivers assay readiness through optimized fixation, permeabilization, and staining protocols for diverse sample matrices.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (relative subcommunity frequencies, absolute cell counts) enabling cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via correlation of microbial shifts with abiotic parameters and health/nutrition outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability through master gate templates and bead-based calibration ensuring cross-experiment comparability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability enabled by bead calibration and master gate templates.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in microbiome-targeted programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable microbiome dynamics and correlation with process or health outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation, staining optimization, and multivariate data analysis.
- Dependent on instrumentation capable of fluorescence detection (DAPI) and bead-based linear/logarithmic calibration.
- Necessitates cross-team standardization of sampling, fixation, and gating protocols for reproducible results.
- Requires adaptation of permeabilization and staining buffers across model systems (pure cultures, sludge, digestate).
- Limited by inability to deliver direct phylogenetic information, necessitating complementary sequencing for taxonomic resolution.
