マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

本手法の全体的な目的は、シリコンマイクロウェルアレイを用いて、限定された環境における多種構成の微生物コミュニティを高スループットかつ並列的に解析することです。この技術の主な利点は、産業、医学、環境において重要な、局所的な微生物間相互作用を高スループットかつ高度な並列性でスクリーニングできることです。本手法は、微細なスケールで固有の空間的制約が、コミュニティ形成の決定的および確率的パラメータにどのように影響を与えるのか、また、微生物メンバーの個体数や組織化にどのような主要な影響を及ぼすのかといった、生物医学および微生物生態学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。

まず、マイクロウェルアレイの準備から始めます。最初に、ダイヤモンドスクライバーを使用して、複数のアレイがプリントされたシリコンウェハーから個別のマイクロウェルアレイチップを切り出します。各個別チップには、直径5～100 µmのウェルのサブアレイが、3種類の異なる間隔密度で含まれています。

各チップにおいて、ウェルの完全なモチーフが4回繰り返されています。次に、ピペットチップボックスとPBSを浸したワイプを用いて、加湿チャンバーを作成します。その後、BSA溶液を150 µLずつ各チップに滴下し、ボックス内で室温で1時間インキュベートします。

その間に細菌を準備します。培養液を遠心分離し、2%グリセロールを含む500 µLの新鮮なR2A培地で再懸濁します。次に、600 nmで培養密度を測定し、吸光度（OD）が0.02になるように濃度を調整します。

チップのインキュベーション後、BSA溶液を除去し、チップをPBSで3回洗浄します。洗浄後、窒素ガスでチップを乾燥させ、加湿チャンバーに戻します。次に、乾燥した各チップに150 µLの培養懸濁液を加え、4 °Cで1時間インキュベートします。これにより、細菌がウェルに付着する時間を確保しつつ、混入した可能性のある細胞の分裂を抑制します。

イメージング用にチップを準備するため、まず各チップに対してアガロースコーティングしたカバーガラスを作成します。少量のアガロースを液状にします。カバーガラス1枚につき約5 mLが必要です。次に、カバーガラスの片面をエタノールで洗浄し、洗浄した面を上にしてガラススライドの中央に配置します。

次に、カバーガラスの長辺に沿って厚さ1 mmのPDMSスペーサーを2つ配置し、カバーガラスをずらして1 mm分がスライドガラスから外に出るようにします。次に、カバーガラス全体を完全に覆うのに十分な量のアガロースを注ぎます。その後、2枚目のガラススライドを用いて、アガロースを均一な厚さに平らにします。

同様のスライドアセンブリを数セット並行して準備します。アガロースが凝固し始めたら、アセンブリを4 °Cに移します。15分間冷却した後、カバーガラス周囲の余分なアガロースを取り除きます。

次に、アセンブリをペトリ皿に入れ、4 °Cで保存します。チップを細菌とともにインキュベートした後、チップを1枚ずつ超純水に10秒間浸します。その後、液体の大部分が切れるまで、濡れたチップをティッシュの上に立てて置きます。

次に、ウェルに沈降しなかった細菌を除去します。シリコンチップの長さに合わせてテープを切り、シリコン上のパリレンコートに貼り付けます。その後、テープを剥がしてパリレンコートを除去し、直ちにチップを反転させる準備をしてください。

次に、マイクロウェルがアガロースに接するように、チップをスライドアセンブリの上に配置します。アガロースに接触させた後は、チップを動かしたりずらしたりしないよう十分に注意してください。続いて、アセンブリ全体をステージトップ環境制御チャンバーのスライドホルダーに移し、希望の間隔および10倍の倍率で、その後24時間にわたりタイムラプス画像を撮影します。

一般的で無料で利用可能なソフトウェアを使用して、イメージスタックを処理します。まず、画像シーケンスをインポートします。平均化を行うには、補正用画像またはダークフィールド画像を読み込みます。

次に、バックグラウンド減算を行います。半径の値として135 pixelsなどを指定し、sliding paraboloidを選択します。続いて、これら2つの画像を選択してsubtract操作を行い、平均照明視野画像から平均ダークフィールド画像を差し引いて除去します。

次に、以下のように照明補正を行います。演算を「divide（除算）」に設定し、i1にウェル画像、i2に補正画像、k1に補正画像の平均値を設定し、k2をゼロに設定します。その後、「Create New Window（新しいウィンドウを作成）」をクリックします。

マイクロウェル内の細菌増殖を定量化するには、まずマイクロアレイプラグインを用いて関心領域（ROI）を選択します。マップメニューで「reset grid」をクリックし、行、列、およびウェルの直径を指定します。次に、ROIシェイプメニューから「circle」を選択します。

ROIアレイを画像に合わせて調整するには、ALTキーまたはALT+SHIFTキーを押しながら、マウスで左上のROIを選択して移動させます。ROIのサイズを変更するには、Shiftキーを押しながらROIアレイの右下を選択します。ROI間の間隔を調整するには、Shiftキーを押しながらアレイの上辺または下辺をドラッグします。

ROIアレイが画像のウェルに適合したら、[Measure RT]をクリックします。すると、各画像またはタイムポイントのすべての測定値を含むテーブルが出力され、分析のためにスプレッドシートにコピーできます。2つのPseudomonas aeruginosa株の増殖を比較しました。一方の株は、タイプVI分泌系に関連する毒性エフェクタータンパク質を構成的に発現しています。

もう一方は、機能喪失によりタイプ6の病原性に感受性があります。両者はそれぞれ異なる蛍光タンパク質を発現しています。共培養は、経時的および異なるウェルサイズで検討されました。

細菌を単独および共培養で培養した。20時間の成長過程を30分間隔でイメージングした。イメージングデータに対してソフトウェアによる補正を行った後、定量的な成長軌跡をプロットした。

共培養において、データは増殖に大きな変化がないことを示唆しています。解析を進めるため、各トラジェクトリを、最大シグナル、最大速度、ラグタイムの3つのパラメータを持つ修正ロジスティック関数に適合させました。この解析から、これらの種の共培養が全体の増殖に及ぼす影響は無視でき、増殖曲線に見られるばらつきは、主に環境要因によるものである可能性が高いことが示唆されました。

一度習得すれば、適切に行うことでセットアップをわずか数時間で完了させることができます。この手順を行う際は、チップアセンブリ内で均一なオーガー層を形成するために、最終的な細胞OD値を適切に調整できるよう、細胞を旺盛に増殖させておくことが重要です。また、パリレンの剥離ステップでは細心の注意を払ってください。本手順に続いて、遺伝物質解析を行うことで、「コミュニティ構成や組織化の関数として、各コミュニティ内の遺伝子発現がどのように変化するか」といった問いに取り組むことが可能になります。

Pseudomonas aeruginosa の取り扱いは潜在的な危険を伴うため、本手順の実施中は、手袋、白衣、ゴーグルの着用および適切な無菌操作などの予防策を常に講じてください。