Name: マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ シリコンマイクロウェルアレイを用いた閉鎖環境での微生物コミュニティのハイスループット並列解析手法。空間的制約がコミュニティ発達とメンバー構成に与える影響を追跡し、産業・医療・環境分野への応用可能性を示す。

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マイクロウェルアレイは、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局のナノフェーズ材料科学センターのユーザー施設部門のセンターで製作され、特性評価されました。この研究の資金援助は、オークリッジ国立研究所所長の研究開発基金を通じて提供された。著者らはまた、これらの研究で使用されたP.緑膿菌株の供給についてJ. Mougous Laboratory（Washington、Seattle、WA）に感謝したい 。

<ol><li>Zhou, J., Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity%2C+succession%2C+and+environmental+perturbations+in+a+fluidic+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem.</a> Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).</li>
<li>Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+analysis+of+microbial+community+organization+through+combinatorial+labeling+and+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layered+structure+of+bacterial+and+archaeal+communities+and+their+in+situ+activities+in+anaerobic+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+spatial+structure+stabilizes+a+synthetic+multispecies+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).</li>
<li>Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+bacterial+communities+and+their+relationships+with+the+micro-architecture+of+soil%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil.</a> FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).</li>
<li>Grundmann, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scales+of+soil+bacterial+diversity+-+The+size+of+a+clone%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone.</a> FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).</li>
<li>Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Bacterial+Communities+Emerging+from+Different+Sources+under+Identical+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).</li>
<li>Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+Scales+in+Gastrointestinal+Microbial+Ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+regulation+of+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Physicochemical regulation of biofilm formation.</a> MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).</li>
<li>Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+local%3A+technologies+for+exploring+bacterial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).</li>
<li>Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+polymicrobial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of polymicrobial infection.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).</li>
<li>Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+block+copolymer+surfaces+for+control+of+microbe+adhesion+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation.</a> Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).</li>
<li>Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-functionalized+poly%28glycidyl+methacrylate%29-+block+-poly%28vinyldimethyl+azlactone%29+surface+scaffolds+for+high+avidity+microbial+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture.</a> Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).</li>
<li>Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstencils+to+generate+defined%2C+multi-species+patterns+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria.</a> Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).</li>
<li>Zhang, Q., Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+Emergence+of+Bacterial+Antibiotic+Resistance+in+Connected+Microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li>
<li>Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+flagella+explore+microscale+hummocks+and+hollows+to+increase+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).</li>
<li>Zhou, J., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+Leads+to+Alternative+Communities+with+Distinct+Functions+in+a+Bioreactor+Microbial+Community%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community.</a> MBio. 4 (2), 1-8 (2013).</li>
<li>van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chemical+interactions+and+culture+history+on+the+colonization+of+structured+habitats+by+competing+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations.</a> BMC Microbiol. 14 (1), 116(2014).</li>
<li>Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Nanoculture+as+an+Artificial+Microniche%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche.</a> Sci Rep. 6, 30578(2016).</li>
<li>Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Assembly+of+Bacteria+in+Microwell+Arrays+Reveals+the+Importance+of+Confinement+in+Community+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development.</a> PLoS ONE. 11 (5), e0155080(2016).</li>
<li>Hood, R. D., Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Type+VI+Secretion+System+of+Pseudomonas+aeruginosa+Targets+a+Toxin+to+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).</li>
<li>LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+characterization+of+bacterial+interactions+reveals+type+VI+secretion+is+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).</li>
<li>Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+distinct+pathways+guide+effector+export+through+the+type+VI+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system.</a> Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).</li>
<li>Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+Single-Cell+Kinetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> PLoS ONE. 11 (1), e0145081(2016).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16348228">Modeling of the Bacterial Growth Curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/308753041_Development_of_transparent_microwell_arrays_for_optical_monitoring_and_dissection_of_microbial_communities">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03(2016).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

この記事では、マイクロウェルアレイデバイスと、細菌のコミュニティ開発のハイスループットと高含量の生細胞イメージングベースの解析を可能にするための実験プロトコルを紹介しました。ここでのデモの焦点は、接触仲介型VI型分泌が地域社会の発展に及ぼす影響を研究することであったが、広範囲の微生物群集と微生物 - 微生物相互作用の研究に柔軟に対応するように設計された。ここでの研究は、構成員の存在および位置の容易な追跡を可能にする蛍光マーカーを恒常的に発現する細菌の使用にのみ焦点を当てている。しかしながら、化学環境を変化させることによって成長または摂動後に個々のウェルから生物材料をサンプリングする機会は、原則として、コミュニティ組成および遺伝子発現を同定するために使用され得る。 各シリコンデバイスは、さまざまなウェルを備えたマイクロウェルを含む数十のアレイで構成されています2倍、3倍、または4倍の直径のピッチで組織され、3＆3.5μmの深さまでエッチングされる。栄養素と二次代謝産物はアガロース蓋を通して自由に拡散することができるため、マイクロウェル間のシグナル伝達や局所栄養素枯渇がどのように地域社...

微生物群は、環境の構造や細胞死、分裂、タンパク質濃度、オルガネラ数、突然変異1に関連する確率論的プロセスのような決定論的要因の両方によって形成される。自然環境の中で、これらの影響がコミュニティの構成と活動に与える個々の影響を解析することは、ほとんど不可能です。自然の構造によって隠され、化学的および生物学的環境に埋もれて、コミュニティのメンバーを特定し、自然環境内で時空間分布をさらに解決することは非常に困難です。それにもかかわらず、最近の努力は、地域の機能に関する空間的組織の重要性を強調し、進行中の研究2,3,4でメンバーの豊富さと組織の両方を考慮する必要性を指摘している。 それ（ 例えば、土壌構造、植物の根、海洋粒子、または腸の微絨毛）、酸素の存在または不存在、およびその存在が、病原性種はすべて、微生物群集の組成、構造、および機能に影響を及ぼす5,6,7,8,9,10,11。それにもかかわらず、これらの要因を捕らえることを怠った伝統的な文化の技法が引き続き普及している。コミュニティ構成（ 例えば、共依存種の存在）、物理的付着、シグナル伝達分子濃度、および直接的細胞 - 細胞接触は、微生物共同体を形成するためのすべての重要な因子であり、c予防的培養条件。これらの特性は、バルク液体培養または寒天プレート上で複製することは困難である。しかし、自然環境の主要な物理的および化学的特徴の複製を可能にするマイクロ流体、マイクロパターン形成、およびナノ製造技術の可能性は、多くの研究者が相互作用を研究する細菌群集を構築することを可能にした12,13,14。自然条件4,15,16,17,18,19,20を模倣する。 このプロトコールは、マイクロウェルアレイデバイスを作製する方法を記載し、そして、機能的にするために使用され得る詳細な実験手順を提供する単一ウェルのウェル内で細菌を増殖させることができます。この研究はまた、蛍光レポータータンパク質を産生するように改変された細菌が、時間の経過とともにウェル内の細菌増殖をモニターするためにどのように使用され得るかを実証する。同様のアレイを以前に提示し、 マイクロウェル中の緑膿菌（ P.緑膿菌）の単一種コロニーの成長を追跡することが可能であることを示した。ウェルサイズと播種密度を調整することにより、何千もの増殖実験の開始条件を並行して変化させることができ、初期接種条件がバクテリアの増殖能力にどのように影響するかを決定することができる21 。現在の研究では、複数のアレイの同時比較を可能にし、より堅牢な実験プロトコールを使用することにより、前の研究に基づいて構築されたわずかに改変されたマイクロウェルアレイのバージョンを使用する。この作品で使用されているアレイには、複数のサブアレイ、または配列ensem3つの異なるピッチ（ すなわち 、ウェル直径の2倍、3倍、および4倍）で配置された、直径15〜100μmの範囲の異なるサイズのウェルを含む。アレイはシリコン内にエッチングされ、シリコン注入アレイに封入された細菌の増殖は、培地注入アガロースゲルで被覆されたカバースリップでアレイを密封することによって可能になる。タイプ6分泌系を研究するために設計されたP.aeruginosa変異体がこのデモンストレーションで使用される。 ここで提示された結果は、マイクロウェルアレイ内のマルチメンバーコミュニティを分析し、化学環境の制御と探索を行っている間、研究者がバイオウムの豊富さと組織をインサイチュで監視できる究極の目標に向かっています。これは、最終的に、コミュニティの発展と継承を支配する「ルール」についての洞察を提供するはずです。

<table><tbody><tr><td>パリレンN</td><td>スペシャルティコーティングシステム</td>ズ <td>CAS番号:1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>パリレンコーター</td><td>スペシャルティコーティングシステムズ</td><td>ラボコター2 パリレン蒸着ユニット PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>WRS 材料</td><td>直径100mm、500-550&mu;m厚さ、プライム、10-20抵抗率、N / Phos<100>、</td><td></td></tr><tr><td>接着促進剤</td><td>Shin-Etsu Microsci</td><td>MicroPrime P20 接着促進剤</td><td></td></tr><tr><td>ポジティブトーンフォトレジスト</td><td>Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Dou 所有)</td><td>Microposit S1818 ポジ フォトレジスト (コード 10018357)</td><td></td></tr><tr><td>Quintel Contact Aligner</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Mask Aligner</td><td></td></tr><tr><td>反応性イオンエッチングツール</td><td>オックスフォード機器</td><td>プラズマラボ システム 100 反応性イオンエッチング</td><td></td></tr><tr><td>R2A ブロス</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>マルチモードプレートリーダー</td><td>パーキン エルマー</td><td>エンスパイア、2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>自動ステージ</td><td>Prior</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>ニコン</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>ステージトップ環境制御チャンバー</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラピュア アガロース</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm No. 1.5 coverslip</td><td>Nexterion</td><td>ハイパフォーマンス#1.5H coverslips</td><td></td></tr><tr><td>蛍光 リファレンス スライド</td><td>Ted Pella</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>物理スタイラス形状測定機</td><td>KLA Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td>lab wipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155</td><td></td></tr><tr><td>commercial software</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルターキューブ</td><td>ニコン</td><td>ニコン FITC (96311), ニコン テキサス レッド (96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

微生物群集の発達は、コミュニティメンバーの空間分布および活動を劇的に変えることができる複雑な決定論的および確率論的因子の組み合わせに依存する。我々は、数千の細菌群を並行して迅速にアセンブルおよび追跡するために使用できるマイクロウェルアレイプラットフォームを開発しました。このプロトコルは、プラットフォームの有用性を強調し、プラットフォーム内の配列のアンサンブル内の単純な2メンバーのコミュニティの開発を光学的に監視するための使用方法を説明します。このデモでは、 緑膿菌の 2つの突然変異体を使用しています。これは、タイプVIの分泌病原性を研究するために開発された一連の突然変異体の一部です。 mCherryまたはGFP遺伝子のいずれかの染色体挿入物は、各マイクロウェル内のコミュニティメンバーの存在および位置をモニターするために使用され得る異なる発光波長を有する蛍光タンパク質の構成的発現を促進する。このプロトコルは、アレイのウェルに細菌の混合物を組み立て、時間経過に伴う各メンバー集団の相対的成長を測定するための経時的蛍光イメージングおよび定量的イメージ分析を使用する。マイクロウェルプラットフォームの播種およびアセンブリ、アレイ内の微生物群集の定量分析に必要なイメージング手順、およびすべて説明した微生物種間の相互作用を明らかにするために使用できる方法。

ここに提示された実験プラットフォームは、細菌群集のハイスループットおよびハイコンテント研究のために設計されています。このデザインにより、さまざまなサイズのウェルで成長する数千のコミュニティを同時に分析することができます。このマイクロウェルアレイ設計により、初期の播種密度、井戸の大きさ、および化学的環境への最終的なコミュニティ組成の依存性を決定することができる。この作品は、マイクロウェルアレイにおける2人のコミュニティの成長を示し、コミュニティの構成と組織を分析する方法を提示します。 ここで使用されているモデルシステムは、P.aeruginosaのタイプVI分泌を研究するためにMousgousラボで設計されました。このシステムは、GFPまたはmCherry蛍光レポーターのいずれかを含むいくつかの突然変異株から構成されています。この研究では、2つの異なる系統を用いた。第1のものは、GFP標識されたΔretS突然変異体であり、これは構成的yは、VI型分泌に関...

微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

本手法の全体的な目的は、シリコンマイクロウェルアレイを用いて、限定された環境における多種構成の微生物コミュニティを高スループットかつ並列的に解析することです。この技術の主な利点は、産業、医学、環境において重要な、局所的な微生物間相互作用を高スループットかつ高度な並列性でスクリーニングできることです。本手法は、微細なスケールで固有の空間的制約が、コミュニティ形成の決定的および確率的パラメータにどのように影響を与えるのか、また、微生物メンバーの個体数や組織化にどのような主要な影響を及ぼすのかといった、生物医学および微生物生態学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。まず、マイクロウェルアレイの準備から始めます。最初に、ダイヤモンドスクライバーを使用して、複数のアレイがプリントされたシリコンウェハーから個別のマイクロウェルアレイチップを切り出します。各個別チップには、直径5～100 µmのウェルのサブアレイが、3種類の異なる間隔密度で含まれています。各チップにおいて、ウェルの完全なモチーフが4回繰り返されています。次に、ピペットチップボックスとPBSを浸したワイプを用いて、加湿チャンバーを作成します。その後、BSA溶液を150 µLずつ各チップに滴下し、ボックス内で室温で1時間インキュベートします。その間に細菌を準備します。培養液を遠心分離し、2%グリセロールを含む500 µLの新鮮なR2A培地で再懸濁します。次に、600 nmで培養密度を測定し、吸光度（OD）が0.02になるように濃度を調整します。チップのインキュベーション後、BSA溶液を除去し、チップをPBSで3回洗浄します。洗浄後、窒素ガスでチップを乾燥させ、加湿チャンバーに戻します。次に、乾燥した各チップに150 µLの培養懸濁液を加え、4 °Cで1時間インキュベートします。これにより、細菌がウェルに付着する時間を確保しつつ、混入した可能性のある細胞の分裂を抑制します。イメージング用にチップを準備するため、まず各チップに対してアガロースコーティングしたカバーガラスを作成します。少量のアガロースを液状にします。カバーガラス1枚につき約5 mLが必要です。次に、カバーガラスの片面をエタノールで洗浄し、洗浄した面を上にしてガラススライドの中央に配置します。次に、カバーガラスの長辺に沿って厚さ1 mmのPDMSスペーサーを2つ配置し、カバーガラスをずらして1 mm分がスライドガラスから外に出るようにします。次に、カバーガラス全体を完全に覆うのに十分な量のアガロースを注ぎます。その後、2枚目のガラススライドを用いて、アガロースを均一な厚さに平らにします。同様のスライドアセンブリを数セット並行して準備します。アガロースが凝固し始めたら、アセンブリを4 °Cに移します。15分間冷却した後、カバーガラス周囲の余分なアガロースを取り除きます。次に、アセンブリをペトリ皿に入れ、4 °Cで保存します。チップを細菌とともにインキュベートした後、チップを1枚ずつ超純水に10秒間浸します。その後、液体の大部分が切れるまで、濡れたチップをティッシュの上に立てて置きます。次に、ウェルに沈降しなかった細菌を除去します。シリコンチップの長さに合わせてテープを切り、シリコン上のパリレンコートに貼り付けます。その後、テープを剥がしてパリレンコートを除去し、直ちにチップを反転させる準備をしてください。次に、マイクロウェルがアガロースに接するように、チップをスライドアセンブリの上に配置します。アガロースに接触させた後は、チップを動かしたりずらしたりしないよう十分に注意してください。続いて、アセンブリ全体をステージトップ環境制御チャンバーのスライドホルダーに移し、希望の間隔および10倍の倍率で、その後24時間にわたりタイムラプス画像を撮影します。一般的で無料で利用可能なソフトウェアを使用して、イメージスタックを処理します。まず、画像シーケンスをインポートします。平均化を行うには、補正用画像またはダークフィールド画像を読み込みます。次に、バックグラウンド減算を行います。半径の値として135 pixelsなどを指定し、sliding paraboloidを選択します。続いて、これら2つの画像を選択してsubtract操作を行い、平均照明視野画像から平均ダークフィールド画像を差し引いて除去します。次に、以下のように照明補正を行います。演算を「divide（除算）」に設定し、i1にウェル画像、i2に補正画像、k1に補正画像の平均値を設定し、k2をゼロに設定します。その後、「Create New Window（新しいウィンドウを作成）」をクリックします。マイクロウェル内の細菌増殖を定量化するには、まずマイクロアレイプラグインを用いて関心領域（ROI）を選択します。マップメニューで「reset grid」をクリックし、行、列、およびウェルの直径を指定します。次に、ROIシェイプメニューから「circle」を選択します。ROIアレイを画像に合わせて調整するには、ALTキーまたはALT+SHIFTキーを押しながら、マウスで左上のROIを選択して移動させます。ROIのサイズを変更するには、Shiftキーを押しながらROIアレイの右下を選択します。ROI間の間隔を調整するには、Shiftキーを押しながらアレイの上辺または下辺をドラッグします。ROIアレイが画像のウェルに適合したら、[Measure RT]をクリックします。すると、各画像またはタイムポイントのすべての測定値を含むテーブルが出力され、分析のためにスプレッドシートにコピーできます。2つのPseudomonas aeruginosa株の増殖を比較しました。一方の株は、タイプVI分泌系に関連する毒性エフェクタータンパク質を構成的に発現しています。もう一方は、機能喪失によりタイプ6の病原性に感受性があります。両者はそれぞれ異なる蛍光タンパク質を発現しています。共培養は、経時的および異なるウェルサイズで検討されました。細菌を単独および共培養で培養した。20時間の成長過程を30分間隔でイメージングした。イメージングデータに対してソフトウェアによる補正を行った後、定量的な成長軌跡をプロットした。共培養において、データは増殖に大きな変化がないことを示唆しています。解析を進めるため、各トラジェクトリを、最大シグナル、最大速度、ラグタイムの3つのパラメータを持つ修正ロジスティック関数に適合させました。この解析から、これらの種の共培養が全体の増殖に及ぼす影響は無視でき、増殖曲線に見られるばらつきは、主に環境要因によるものである可能性が高いことが示唆されました。一度習得すれば、適切に行うことでセットアップをわずか数時間で完了させることができます。この手順を行う際は、チップアセンブリ内で均一なオーガー層を形成するために、最終的な細胞OD値を適切に調整できるよう、細胞を旺盛に増殖させておくことが重要です。また、パリレンの剥離ステップでは細心の注意を払ってください。本手順に続いて、遺伝物質解析を行うことで、「コミュニティ構成や組織化の関数として、各コミュニティ内の遺伝子発現がどのように変化するか」といった問いに取り組むことが可能になります。Pseudomonas aeruginosa の取り扱いは潜在的な危険を伴うため、本手順の実施中は、手袋、白衣、ゴーグルの着用および適切な無菌操作などの予防策を常に講じてください。

assembly-tracking-microbial-community-development-within-microwell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

オンチップ光重合技術を用いた高分子マイクロアレイの形成の説明。原子間力顕微鏡、水接触角の測定値を使用して高スループット表面特性、飛行二次イオン質量分析法と細胞接着アッセイのX線光電子分光法と時間も記載されている。...

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

細胞機能上の微小環境の分子組成の影響についての洞察を得るためのコンビナトリアル機能的スクリーニング方法が記載されている。この方法は、細胞接着および機能解析をサポートしていることを定義したコンビナトリアル微小環境の配列を生成するために、既存のマイクロアレイベースの技術を活用しています。...

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

出典: Fattahi, N., et al.細菌のスクリーニング,選択及び単離のための光分解性ヒドロゲル界面J. Vis.

マイクロウェルアレイ内の細菌コロニーの光分解性ヒドロゲルベースの単離

出典: Pioli、R.、 et al.、 シーケンシャルキャピラリティアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング。 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオでは、カーボンフリー懸濁液と制御されたフローを使用して、マイクロ流体トラップで単一の蛍光タグ付き 大腸菌(大腸菌)...

マイクロ流体パターニングと蛍光に基づく単一細胞細菌増殖の追跡

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis.

マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

は、接着細胞と微細構造基質との間の機械的相互作用を定量化するためのプロトコルです。これらの相互作用は、遊走、増殖、分化、アポトーシスなどの重要な細胞挙動と密接に関連しています。このプロトコルには、MechProfilerと呼ばれるオープンソースの画像解析ソフトウェアが用意されており、各マイクロポストの関与する力を決定できます。...

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

ここでは、高効率のシングルセルの単離と長期のクローン培養を可能にする新しいマイクロウェル設計コンセプトを利用したマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を分離および培養するためのプロトコルを紹介します。...

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。...

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs)...

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

マイクロ流体プラットフォーム内の毛細管現象支援アセンブリを用いて、細菌やコロイドなどの液体中に浮遊するマイクロサイズの物体をポリジメチルシロキサン基板上の所定のアレイにパターニングする技術を提示する。...

シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)は、複雑な微生物群集の培養を可能にするハイスループットでカスタマイズ可能な連続フロー培養システムであり、マイクロバイオームのダイナミクス、治療的相互作用、および環境要因に対する微生物の反応を研究するための並行実験をサポートします。...

ミニバイオリアクターアレイ(MBRA)の組み立てと使用のためのプロトコルの更新

学ぶ シリコンマイクロウェルアレイを用いた閉鎖環境での微生物コミュニティのハイスループット並列解析手法。空間的制約がコミュニティ発達とメンバー構成に与える影響を追跡し、産業・医療・環境分野への応用可能性を示す。

マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

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