マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。

この方法の全体的な目標は、シリコンマイクロウェルアレイを使用して、閉鎖された環境におけるマルチメンバー微生物群集のハイスループット並列分析です。この手法の主な利点は、業界、医療、環境にとって重要な微細に局在する微生物相互作用のハイスループットで高度に並行スクリーニングできることです。この方法は、生物医学および微生物生態学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。たとえば、微細スケールに固有の空間的制約がコミュニティ開発の決定論的および確率的パラメーターをどのように推進するのか、そしてそれらが微生物のメンバーの存在量と組織にどのような主要な影響を与えるのか?

まず、マイクロウェルアレイの準備から始めます。まず、ダイヤモンドスクライブを使用して複数のアレイで印刷されたシリコンウェーハから個々のマイクロウェルアレイチップを切断します。個々のチップには、直径が5〜100ミクロンのウェルのサブアレイが含まれており、3つの異なる間隔密度があります。

各チップでは、ウェルの完全なモチーフも4回繰り返されます。次に、ピペットチップボックスとPBS浸しワイプを使用して加湿チャンバーを作成します。次に、150マイクロリットルのBSA溶液を各チップに塗布し、ボックス内のチップを室温で1時間インキュベートします。

その間にバクテリアを準備します。培養物をスピンダウンし、2%グリセロールを含む500マイクロリットルの新鮮なR2A培地に再懸濁します。次に、600ナノメートルで培養密度を測定し、濃度を光学密度0.02に調整します。

チップのインキュベーション後、BSA溶液を取り出し、チップをPBSで3回すすぎます。すすぎ後、チップを窒素ガスで乾燥させ、加湿チャンバーに戻します。次に、各乾燥チップに150マイクロリットルの培養懸濁液を加え、チップを摂氏4度で1時間インキュベートします。これにより、細菌がウェルに付着する時間がありますが、可能性のある汚染物質の細胞分裂は遅くなります。

イメージング用のチップを準備するには、まずチップごとにアガロースコーティングされたカバースリップを作成します。少量のアガロースを液化し、各カバースリップに約5ミリリットルが必要です。次に、カバースリップの片面をエタノールで洗い、洗った面を上にしてスライドガラスの中央に置きます。

次に、厚さ 1 mm の PDMS スペーサーを 2 つ、カバー スリップの長辺に沿って配置し、カバー スリップをずらして、スライドから 1 mm 垂れ下がるようにします。次に、カバースリップに十分なアガロースを注ぎ、完全に覆います。次に、2番目のスライドガラスを使用して、アガロースを均一な厚さに平らにします。

このようなスライドアセンブリをいくつか並行して準備します。アガロースが固まり始めたら、アセンブリを摂氏4度に移します。15分間冷却した後、カバースリップの周りの余分なアガロースを切り取ります。

次に、アセンブリをペトリ皿に入れ、摂氏4度で保管します。チップがバクテリアとインキュベートされた後、チップを超純水に1つずつ10秒間浸します。次に、濡れたチップをティッシュの上の端に置き、液体のほとんどが排出されるまで

次に、ウェルに定着しなかったバクテリアを取り除きます。シリコンチップの長さだけテープをカットし、シリコンのパリレンコートに接着します。次に、テープをはがしてパリレンコートをはがし、すぐにチップを反転させる準備をします。

次に、チップをスライドアセンブリに配置し、マイクロウェルがアガロースと接触するようにします。アガロースに接触したチップを動かしたりずらしたりしないように十分注意してください。次に、アセンブリ全体をステージトップ環境制御チャンバーのスライドホルダーに移し、次の24時間にわたって目的の間隔で10倍の倍率でタイムラプス画像を取得します。

画像スタックは、無料で入手できる従来のソフトウェアを使用して処理します。まず、画像シーケンスをインポートします。平均化するには、補正画像または暗視野画像を読み込みます。

次に、バックグラウンドの減算を実行します。135 ピクセルなどの半径値を指定し、スライディング放物面を選択します。次に、平均照明フィールド画像から平均暗視野画像を削除するには、2 つの画像を選択し、減算演算を使用します。

次に、次のように照明補正を適用します。演算を除算に設定し、i1をウェル画像に、i2を補正画像に、k1を補正画像平均に、k2をゼロに設定します。次に、[新しいウィンドウの作成]をクリックします。

マイクロウェルでの細菌増殖を定量化するには、まずマイクロアレイプラグインで関心領域を選択します。マップメニューで、[グリッドのリセット]をクリックし、行、列、ウェルの直径を指定します。次に、ROI 形状メニューから circle を選択します。

ROI 配列をイメージに合わせて調整するには、Alt キーまたは Alt + Shift キーを押しながらマウスで左上の ROI を選択することで、ROI 配列を移動できます。ROIのサイズを変更するには、Shiftキーを押しながらROI配列の右下を選択します。ROI 間の間隔を調整するには、Shift キーを押しながら配列の上側または下側をドラッグします。

ROI 配列が画像のウェルに収まったら、[RT の測定] をクリックします。次に、各画像または時点のすべての測定値を含むテーブルが出力され、分析のためにスプレッドシートにコピーできます。緑膿菌の2つの株の生育を比較した。1つの株は、6型分泌物に関連する毒性エフェクタータンパク質を構成的に発現します。

もう1つは、機能の喪失により6型病因にかかりやすいです。どちらも異なる蛍光タンパク質を発現します。共培養は、縦断的に、異なるウェルサイズで研究されました。

細菌は個別に培養し、共培養として培養しました。20時間の成長を30分間隔で画像化しました。画像データに対してソフトウェア補正を行った後、定量的な成長軌道をプロットしました。

共文化では、データは成長にあまり大きな変化を示唆していません。解析を進めるために、各軌跡は、最大信号、最大レート、および遅延時間の 3 つのパラメーターを持つ修正されたロジスティック関数に適合されました。この分析は、これらの種の共培養が全体的な成長にほとんど影響を与えず、成長曲線に見られる変動性は環境要因によるものである可能性が最も高いことを示唆しています。

一度マスターすれば、適切に実行されれば、セットアップはわずか数時間で実行できます。この手順を試みる際には、最終細胞のOD値を適切に調整し、チップアセンブリに均一なオーガー層を持つために、しっかりと成長する細胞を持つこと、およびパリレンの剥離ステップ中に注意することが重要です。この手順に従うと、各コミュニティ内の遺伝子発現がコミュニティの構成と組織の関数としてどのように変化するかなどの問題を遺伝物質分析によって解決できます。

緑膿菌での作業は潜在的に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、手袋、ジャケット、ゴーグル、適切な無菌技術などの予防措置を常に使用する必要があることを忘れないでください。