ヒト好中球由来の巨大食細胞の新規亜集団の開発および同定インビトロ

この方法の全体的な目標は、炎症性および抗炎症性免疫応答におけるそれらの役割を調査するために、循環するヒト好中球に由来するin vitro培養巨大食細胞を作製および同定することです。この方法は、ヒト好中球から発生する巨大食細胞の新しい亜集団を取得および同定し、長期的な培養条件を維持するために使用できます。この手法は、巨大食細胞の意義と機能をさらに調査するだけでなく、その活性化と可塑性に関する重要な疑問に答えるために使用できます。

この手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるEva LederとポスドクのOksana Rogovoyです。滅菌頭皮静脈セットを使用して、健康な若いボランティアから少なくとも40ミリリットルの静脈血を採取します。次に、バイオセーフティ層流フードで血液を穏やかに混合します。

全血サンプルの10〜12ミリリットルのアリコートを、2%の熱不活化FCSを含む予め温めたイオンフリーPBSで最終容量24ミリリットルに希釈します。次に、12.ミリリットルのポリスクロース1119を血液サンプルアリコートごとに1本の50ミリリットルの滅菌ポリプロピレン円錐遠心分離チューブの底に加え、続いて12ミリリットルのポリスクロース1077をポリスクロース1119勾配溶液の上に慎重に層状にします。希釈した血液24ミリリットルを密度勾配溶液の個々のチューブに慎重にピペットで移し、遠心分離により細胞を分離します。

結果として生じる2つの不透明な層が観察されるべきです。各チューブの単核細胞層から最大0.5センチメートル上の液体を廃棄します。次に、各サンプルから単核細胞を1つの新しいチューブに移します。

次に、多形核細胞またはPMN層から最大0.5センチメートル上に残っている液体を廃棄し、各サンプルからのPMNを異なる新しいチューブに移します。2%の熱不活化FCSを含む30ミリリットルのPBSの最終容量でPMNを洗浄し、続いて3ミリリットルの滅菌氷冷低張性0.2%塩化ナトリウムで赤血球を溶解します。氷上で30秒後、3ミリリットルの滅菌氷冷1.6%塩化ナトリウムで等張性を回復します。

次に、熱不活化FCSを添加した摂氏37度のRPMI 1640培地を6ミリリットル加え、遠心分離により細胞を回収します。ペレットを4ミリリットルのRPMI 1640に再懸濁し、10%の熱不活化FCSを添加します。計数後、濃度を1.25〜1.5×10〜6 PMN×1ミリリットルの培地に調整し、1ウェルあたり1ミリリットルの細胞を24ウェルプレートの個々のウェルにプレート化する。

次に、プレートを摂氏37度の加湿5%二酸化炭素インキュベーターに置き、培地の半分を新鮮なRPMI 1640培地に3日ごとに10%熱不活化FCSを補充した新鮮なRPMI 1640培地に穏やかに交換して培養物に供給します。好中球は、培養後7日以内に巨大な食細胞に分化します。培養の7日目に、各ウェルから培地の半分を慎重に取り出します。

次に、残りの培地をしっかりとピペットで動かして、軽く付着した巨大な食細胞を取り除きます。各処理群の2〜4ウェルから分離した細胞を個々の15ミリメートル円錐管に移し、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットをチューブあたり100〜120マイクロリットルの培地に再懸濁します。次に、治療グループごとに2〜3個のホルダーに顕微鏡スライド、フィルターカード、漏斗を装備します。

次に、各チューブの全量の細胞を適切なCytospinファンネルに加えます。次に、ホルダーをCytospinにロードし、細胞をスライド上にスピンします。回転させたスライドを10分間乾かします。

次に、水安定性マーカーを使用して細胞の周囲に疎水性バリアを描き、室温の化学フードの下にサンプルを4%パラホルムアルデヒドで固定します。10分後、洗浄ごとに約100マイクロリットルのPBSでスライドを3回簡単にすすぎます。次に、0.5%Triton X-100をPBS溶液で室温で10分間細胞に浸透させ、続いて先ほど示したようにPBSを5回洗浄します。

RPMI 1640培地で10%正常ヤギ血清による非特異的結合を適切な時間ブロックした後、PBS洗浄を1回行います。次に、湿度を維持するためにボックスに少量の水を加え、加湿された暗いチャンバー内で摂氏4度の一晩で、目的の適切な一次抗体を約100マイクロリットルで細胞に標識します。次に、PBS洗浄を1回行い、適切な蛍光標識二次抗体を添加します。

室温で40分間光から保護した後、サンプルを洗浄して余分な抗体を取り除き、サンプルごとに1滴の封入剤とカバースリップでスライドをマウントします。40倍エマージョンオイル対物レンズの下で30〜120分以内に共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡でスライドを分析します。次に、適切なソフトウェアを使用して、細胞面積、蛍光強度、および共局在を計算します。

これらの画像では、培養後7日以内に好中球が巨大な食細胞に成長する様子が観察できます。自己食作用は、好中球培養の90分後という早い時期に明らかになり、蛍光膜染色で細胞径が大幅に拡大し、4日目から7日目までに明らかになります。しかし、好中球培養物にGM-CSFとIL-4を添加すると、細胞は全体的に直径が小さく、樹状細胞様細胞に似た細胞質突起を示します。

培養3日目から4日目および4日目から5日目の巨大食細胞のタイムラプス顕微鏡では、周囲の好中球の残骸や破片を積極的に摂取する運動能力が限られている細胞がまったくないか、軽く付着していることがわかります。この混合単球好中球培養では、活発に這うマクロファージの移動を、同じ培養ウェル内の蛍光標識された巨大食細胞のほぼ静止した動きと比較することができます。巨大食細胞の好中球起源は、好中球マーカーが陽性に発現しないこと、および単球細胞マーカーと樹状細胞マーカーが発現しないことによって確認することができます。

また、巨大食細胞は基底活性酸素種を生成し、酸化バーストによりザイモサンやPMAの刺激に応答します。しかし、単球や好中球とは異なり、酸化された低密度リポタンパク質の刺激に対しては、酸化的なバーストによっても反応します。一度習得すれば、このテクニックは6〜7日で完了することができます。

この手順を試みる際には、好中球培養物に栄養を与えるときに培地の半分を穏やかに交換することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、これらの興味深い細胞の追加機能に関する疑問に答えるために、他の染色技術をin vitroおよびin vivoで行うことができます。この技術は、好中球生物学の分野の研究者が好中球の活性化と可塑性を探求し、ヒトの生理学的および病態生理学的条件でこれらの細胞をin vivoで同定するための道を開く可能性があります。

このビデオを見れば、培養中の巨大食細胞の入手方法と同定方法について十分に理解できるはずです。人間の血液を扱う作業は感染する可能性があり、この手順を実行する際には、手袋を着用し、すべての液体を廃棄し、使い捨ての機器を適切なバイオハザード容器に使用するなどの予防措置が必須であることを忘れないでください。