パインウッドセンチュウの交配挙動の観察と定量化、マツノザイセンチュウ

この手順の全体的な目標は、マツノイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusの交配行動を観察することです。この方法は、線虫の心理学的研究を進めるのに役立ちます。これは特に、マツノキセンチュウの交配行動の遵守を扱います。

この手法の主な利点は、処女の成体を得ることができるため、成体の交配行動を観察するのがはるかに容易になることです。この技術の意味は、線虫が同様のライフサイクル行動を持っているため、純粋に線虫の広範な研究にまで及びます。この方法のデモンストレーションは、発生性線虫の制約が練習を必要とし、初期の第一段階の幼体でオスとメスを正確に区別することが容易ではないため、処女成体線虫の獲得が困難であるため、非常に重要です。

マツノイセンチュウを培養するには、まずジャガイモのデキストロース寒天プレートを準備します。プレートに接種するには、ベトリタス・セナリア・マットから直径10ミリメートルの真菌マットを打ち抜き、新しいPDAプレートの中央に置きます。暗闇の中で25°Cで5日間菌マットを培養します。

5日後、準備したペトリ皿にマツノイセンチュウを加え、暗所で摂氏25度で3日間培養します。真菌から線虫を分離するには、まず収集ツールを準備します。漏斗の下にクランプされたゴムチューブを置き、準備した漏斗をラックに保持して、ベアマン漏斗装置を組み立てます。

次に、漏斗の口にガーゼの代わりに濾紙を2層置きます。次に、菌類の培養物を漏斗のセットアップに移し、菌類のマットが浸るまで水を加えます。2時間後、線虫は真菌培養物から出て、濾紙を横切り、ベアマン漏斗の最下部に落ち着きます。

漏斗の下に15ミリリットルのチューブを配置し、クランプをゆっくりと離して、線虫を含む数滴の水を集めて線虫を収集します。線虫コレクションを室温で2分間、3, 000 Gで遠心分離します。次に、水の上層部をアスパレートし、ワームを1ミリリットルの水に再懸濁します。

線虫の懸濁液を6センチメートルのガラス皿に移し、線虫が自由に泳ぐのを助けるために3ミリリットルの水を加えます。さあ、卵を集めてバージンストックを作りましょう。皿を暗いインキュベーターに移し、妊娠中の女性に10分間卵を産ませます。

それらの糖タンパク質表面のために、卵はガラスにくっつきます。次に、皿に付着した卵を邪魔しないように、ワームで水を慎重に取り除きます。次に、卵が乾くのを防ぐために、皿に3ミリリットルの水をすばやく戻します。

卵を掃除するこのプロセスを少なくとも3回繰り返して、すべての幼虫と成虫を取り除き、純粋な卵を手に入れます。洗浄した純粋な卵のコレクションに、5ミリリットルの水を加え、摂氏25度の暗闇で卵の発育を進めます。卵培養を開始してから24時間後、孵化したJ2幼虫を採取します。

J2幼虫を15ミリリットルのチューブに慎重に移します。次に、コレクションを3, 000 Gで2分間遠心分離します。水の上層を補い、200マイクロリットルの水を追加します。

次に、真菌のマットで調製したPDAプレートでJ2幼虫を培養します。52時間後、J2幼虫のほとんどは初期段階のJ4幼虫に成長します。ベールマン漏斗を組み立て、前述のように真菌培養物から線虫を2時間抽出します。

待っている間に、ワームを摘むための針を準備します。アルコールバーナーで加熱されたガラスキャピラリーからチップを引き出します。先端の直径は約50ミクロンで、これは成虫の線虫の体幅とほぼ同じである必要があります。

2時間後、前述のようにJ4幼虫をきれいなペトリ皿に移します。さて、実体顕微鏡で線虫と性交します。幼虫の約3分の2は通常メスです。

女性の外陰部は明らかに男性の解剖学的構造とは異なりますが、ワームは非常に活発なため、性行為には練習が必要です。このプロトコルの最も重要なステップは、最初の早い段階でオスとメスを正確に区別し、分離することです。そうしないと、彼らが大人になったときに、混ざり合って悪いものが出てきます。

そのため、交配を観察するのが難しくなります。徐々に、ワームを摘み取り、男性または女性のスライド上の水滴に移します。成功を確実にするために、2人の異なる人々が性別の割り当てを再確認する必要があります。

次に、性別のあるワームを含む水滴を適切な真菌培養プレートに移します。次に、処女をさらに24時間培養してから、交尾行動を研究します。マツノイセンチュウの交配行動を観察するには、まず、各ウェルに200マイクロリットルの水を追加して、いくつかの凹型スライドを準備します。

次に、準備された処女の成体を1つ選び、準備したスライドに移します。処女の成虫を井戸の中に1時間置いて、新しい水性環境に適応させます。1時間後、ピペットを使用して、異性の処女の成体を1人ウェルに追加します。

次に、実体顕微鏡で交配挙動を観察し、定量分析のためにその挙動を撮影します。すべての交配プロセスは通常2時間で終了します。30分ごとに、蒸発を補うために50マイクロリットルの水を追加します。

交配選択と性間競争を調査するために、2つの異なる組み合わせの処女線虫をグループ化して観察します。処女成虫の交配成功率は約87%で、無作為に選ばれた成体よりもはるかに高かった。ペアは、4つの異なるフェーズを含む交配プロセス全体を完了するのに平均83分かかりました。

探し、連絡し、交尾し、そして長居する。これらのフェーズ内では、多くの特定の行動パターンが観察されます。1人の女性が複数のオスと出会ったとき、明らかな交配の選択肢がありました。

女性は通常、頭を使って1人の男性、通常は頭、体、尾、生殖器に接触します。その後、メスはオスと交尾するか、すぐにオスを離れて、別のオスに泳ぎました。交配成功率は、異なる線虫の組み合わせについて、最初の接触後に測定した。

また、インターセクシャルな競争も起こりました。1匹の処女の女性が3人の処女の男性と混ざったとき、男性は彼女と交尾する機会を得るために、できるだけ女性に近づいて接触しようとしました。外陰部が占められると、他のオスは激しい体のスイングや引きずりでそれらを分離するために交尾プロセスを妨害しようとしました。

女性のインターセックス競争は、男性のインターセックス競争と多かれ少なかれ似ていると見られました。インターセックス競争のため、異なる組み合わせでの交尾頻度は有意に異なっていました。その開発後、この技術は線虫の行動生態学の探求への道を開きました。

マスターすると、適切に実行されれば、この手順は12日で完了できます。この手順を試みる際には、男性と女性を正確に分離することを覚えておくことが重要です。これは、初期の4段階の幼体で処女の成体を得るためです。