Name: パインウッドセンチュウの交配挙動の観察と定量化、マツノザイセンチュウ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学ぶマツノザイセンチュウの交配挙動観察法。処女成虫を取得し、Bursaphelenchus xylophilusの生殖行動を定量化する手法です。線虫行動生態学研究の基盤となる技術を習得できます。

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Najie朱とLiqun白が、この作品にも同様に貢献しました。この作品は、財政的に公共の福祉における林業科学研究のための特別基金（201204501）と中国の国家自然科学基金（31170604、31270688、および31570638）によってサポートされていました。私たちは英語の書き込みに自分の役立つ提案のために博士Holighausヘリット・博士ダニエルHickfordに感謝します。

ヴァージンアダルト線虫の1買収<ol><li> マツ材線虫の分離株と培養条件 注：B.センチュウ Nxy61はもともと中国の浙江省の寧波領域の病気の馬尾から抽出された隔離。 <ol><li>ポテトデキストロース寒天（PDAを、 材料の表を参照してください）準備成長灰色かび病菌のためのプレート。 </li><li>接種のために、B.シネレアマットから直径10mmの真菌マットの一部をパンチして、新しいPDAプレートの真ん中にそれを置きます。文化暗所で25℃で5日間B.シネレア 。 </li><li>文化暗所で25℃においてB.シネレアを含む準備されたペトリ皿中のマツ材線虫。 </li></ol></li><li> B.センチュウ卵の取得 <ol><li>漏斗の下にクランプされたゴムチューブを配置し、組み立てるためのラックに準備された漏斗を開催Baermannロート装置。漏斗の口の中でろ紙の代わりにガーゼの二つの層を配置します。 </li><li>漏斗のセットアップに真菌培養液を移し、真菌のマットが浸漬さまで水を追加します。 2時間待ってから、線虫は、真菌培養から出てくるろ紙を横断し、Baermannロートの最下部に落ち着くだろう。 </li><li> 15 mLのチューブにチューブの底からの水の滴の最初のカップルを収集し、ゆっくりとチューブにクランプを解放することによって線虫を集めます。 </li><li>室温で2分間、3,000×gで、上記のコレクションを遠心。 </li><li>ピペットで水の上層を削除し、滅菌蒸留（DD）の1mLのH 2 Oでそれを再懸濁</li><li>ピペットを用いて、新しいガラスシャーレ（直径6cm）に上記の再懸濁を移します。線虫が自由に泳ぐことができることを保証するために、ペトリ皿に無菌のdd H 2 Oの3ミリリットルを追加します。 </li><li> GLASで線虫を保ちます暗所で25℃で10分間、ペトリ皿は、S。卵は妊娠した雌によって敷設されます。そのため、それらの糖タンパク質表面の、卵は、ガラスペトリ皿の底に固執します。 </li><li>卵を乱すことなく、慎重に水やワームを削除します。乾燥から卵を防ぐために、すぐにガラスシャーレに無菌のdd H 2 Oの3ミリリットルを追加します。 </li><li>すべての幼虫と成虫を除去し、純粋な卵を得るための手順を繰り返し1.2.8 3倍。ペトリ皿に無菌のdd H 2 Oの余分な2 mLの（合計で5ミリリットル）を追加します。 </li></ol></li><li> 4段目の少年の取得（J4幼虫） <ol><li>ハッチ25℃の暗所で24時間採取した卵は、J2の幼虫を得ることができます。 </li><li> 、15 mLのチューブにピペットでJ2の幼虫を移し2分間、3000×gで遠心分離し、水の上層を除去します。 </li><li>無菌のdd H 2 Oの200μLとJ2の幼虫を再懸濁し、その後に転送B.シネレアを含むPDAプレート。 </li><li>文化暗所で25℃で52時間、J2の幼虫。この時点で、ほとんどのJ2幼虫はJ4幼虫の初期段階へと発展してきます。 </li></ol></li><li> 処女大人の線虫の取得 <ol><li>アルコールバーナーの上に加熱した後、ガラスキャピラリーを描画することによって線虫を拾うための針を準備します。 注：これは、単一の線虫をピックアップするためのツールとして使用することができるように、このキャピラリ針の先端は、通常、直径が50ミクロン、成体線虫の略車体幅である必要があります。 </li><li> Baermannロートを組み立て、ステップ1.2.1で説明したように、2時間の真菌の培養物から線虫を抽出 - 1.2.3。 </li><li>きれいなペトリ皿に水でJ4を転送します。 </li><li> （ 図1実体顕微鏡下で線虫を観察し、間宮と清原8で説明したように、生殖器の形態によって、男性と女性を区別</stronグラム&gt;）。準備されたキャピラリ針を希望する性別の線虫をピックアップし、男性または女性のための適切な真菌培養プレートに移します。 注： - 70％、男性よりも女性が60の雌の割合であります。女性の外陰部は明らかに男性の骨片は異なっています。大人に比べて、初期段階のJ4で骨片や外陰部は小さいですが、彼らはまだ容易に見ると区別することができます。線虫は、常に時には、男性と女性を区別することの困難を増大させ、水、に移動しています。 </li><li>文化暗所で25℃でさらに24時間J4幼虫。 注：すべての線虫は成虫に開発する必要がありますが、彼らは嵌合解除されているので、それらは処女大人とみなされます。 </li><li> Baermannは、ファンネル2を組み立て、ステップ1.2.1で説明したように、2時間の真菌培養物から処女大人を抽出 - 1.2.3、および2つの独立した、きれいなペトリ皿に処女成人男性と女性を転送します。 </li></oL&gt; </li></ol> 2.観察と交尾行動のビデオ録画<ol><li>いくつかの凹面のスライドを準備し、それらの各ウェルに無菌のdd H 2 Oの200μLを追加します。 </li><li>キャピラリ針を用いて調製バージン成人男性やと女性をピックアップし、各凹形スライドの水の中に一つだけの線虫を置きます。 </li><li>彼らは新たな水環境に適応させるために1時間だけでなく内部の処女大人にしてください。 </li><li>ピペットを使用して、別の1つのウェルからそれらのいずれかを転送することにより、処女オスとメスをペア。 </li><li>実体顕微鏡下に凹のスライドで1♀+1♂組み合わせの交尾行動を観察します。 </li><li>バージン成人の接合効率を分析するために、それらの交配成功率（R）を計算し、ランダムに選択された大人のペアのそれとを比較します。交尾を検討複製の総数に比べて観察された複製の割合としてRを計算します。 </li><li&gt;、交配の選択とintrasexual競争を調査グループおよび2つの異なる組み合わせの処女線虫を観察するには、次の1♀+3♂と3♀+1♂。 </li><li>定性および定量分析のためのデータを収集するために、ビデオ顕微鏡を使用して、交尾行動をフィルム。通常、全体の交配プロセスは、彼らは交尾後に離れて移動したときに線虫が瞬間に凹形スライドのウェル内に配置された時点から、2時間以内に完了する。従って、一つの複製、少なくとも2時間、連続的に交配処理を記録します。組合せごとに合計で少なくとも30の反復を完了します。 注：記録プロセスの間の蒸発を補償するウェルに（通常は50μL）2 O毎に0.5時間をより無菌のdd Hを追加します。 </li></ol> 3.データ収集<ol><li>コンピュータの画面上で、慎重にすべての動画と定性的サブ行動を特徴づけます。 </li><li>目を使用して、相手の持続時間を測定しますビデオレコーダーの電子フレーム単位で機能。手動でエンドポイントから開始時間を引きます。 </li><li> 1♀+1♂組み合わせについては、それぞれのビデオ録画を分析し、次のイベントの継続時間を測定します： <ol><li>検索の所要時間を測定します（ つまり、女性と男性は、彼らが遭遇した瞬間に凹形スライドのウェルに導入し、互いに接触しているときからの時間）。 </li><li>接触の持続時間を測定する（ すなわち 、男性が正確に最初の交尾のために女性の外陰部に位置している瞬間の最初の接触からの時間）。 </li><li> （彼は射精後の女性の体から滑り落ちるまで男性が正確に女性の外陰部に位置しているときから、 すなわち時間）交尾の持続時間を測定します。注：一部の線虫を2時間に数回交尾することができます。このような場合には、ラスの端部に第一の交尾から交尾の継続時間を測定します間の時間を含むトン1、。 </li><li>余韻の長さを測定する（ すなわち 、男性と女性の水泳まで互いに離れる交尾後の期間と線虫の体の長さ（通常は1ミリメートル）以上の距離で分離されています）。 </li></ol></li><li>交尾頻度とすべての交尾の期間と異なる組み合わせのそれぞれについて、2時間内のすべてのcopulationsの平均期間をカウントする（ すなわち、1♀+1♂、3♀+1♂、および1♀+3♂）。 </li><li>すぐに任意の休憩なしで行われた第1の接触、後の交尾の成功率など、さまざまな組み合わせのための最初の接点（P）用の交尾成功率を計算します。接触させる段階では、いくつかの連絡先は、実際の交尾の前に観察されることがあります。 <ol><li> 2人の間の距離は、本体の長さ以上である場合には、以上のことを一つの接点を考えます。 1複製、レコードP 100％と交尾iについてsがブレークすることなく、最初に接触した後すぐに観察、または0.00パーセント全く交尾が観察されなかった場合や交尾が、2つ以上の接点の後があった場合。 注：ここで説明する組み合わせごとに30の複製がありました。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
<li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+a+threat+to+European+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Plant+Path%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li>
<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
<li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Nemat%22%5BJournal%5D)">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li>
<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

行動試験は、化学生態学、神経生物学、分子生物学、遺伝学の基本的な側面です。線虫、特にC.エレガンスは 、広くこれらの分野での研究のために使用されています。 線虫の交尾行動は、以前10-11検討されています。しかし、B.のセンチュウは gonochoristicと雌雄同体C.エレガンスとは異なり、その嵌合プロセスは、異なる行動機能9を有しています。最近では、 マツノザイokinawaensis、B. センチュウの雌雄同体の姉妹種の交尾行動は、12を報告しました。別の実験方法を用いたが、この雌雄同体の種はBに類似したセックスの魅力を示したセンチュウ 、 それらの間の種間の引力が観察されました。この雌雄同体の姉妹種は、 マツノザイの生物学上の更なる調査を実施するためのモデルとして使用される場合があります。 <p cl...

マツノイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickleは、最も破壊的な侵入種の一つであり、パインの木のしおれと最終的な死を引き起こします。この病原性線虫は米国原産であると考えられていますが、中国、日本、韓国、ポルトガルなど、いくつかの国に輸送されました。最近では、スペインでも報告されており、莫大な経済的損失で何百万本もの松を枯らし、森林生産と生態系の安定を脅かしています1-5。
宿主の松の木がマツノザイセンチュウに感染すると、何千万もの子孫が幹内で急速に繁殖します。これは木部の機能不全を引き起こし、その結果、しおれ、最終的には宿主樹6が死に至る。しかし、現在のところ、この病気を効率的に制御する方法はありません。交配行動は、この線虫7の高い繁殖力に重要な役割を果たす可能性があります。そこで、B. xylophilusの交配行動を研究室で調べ、交配を乱し、繁殖力を低下させる効果的な方法を見つけようと試みました。
このプロトコルは、B. xylophilusの処女成虫の入手方法と、ビデオレコーダーと実体顕微鏡を使用して交尾行動を観察し分析する方法の詳細な方法を紹介することを目的としています。このプロトコルは、他の線虫の行動研究の参照としても使用できます。

<table><tbody><tr><td>B. xylophilus 分離株 Nxy61</td><td></td><td></td>中国<td>寧波地域の Pinus massoniana から抽出</td></tr><tr><td>灰色カビ株</td><td></td><td></td><td>中国林業アカデミーから取得</td></tr><tr><td>ベアマン漏斗</td><td>センゴン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鷹のチューブ</td><td>センゴン</td>遠心分離機 センゴン<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterile dd H2O</td><td></td><td></td><td>121°Cの高圧蒸気で滅菌されています。Cで30分間。</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>センゴン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDAミディアム</td><td>Huankaiバイオ。</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーSengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>ライカ</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>倒立実体顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>凹面スライド</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

パインウッドセンチュウの交配挙動の観察と定量化、マツノザイセンチュウ

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

マツ材線虫の交尾行動を観察し、定量化するための方法は、 マツノザイセンチュウは 、実体顕微鏡下で設立されました。 B.センチュウの交配効率を向上させると相手観察の機会を増加させるために、処女大人培養し、調査のために使用されます。卵を、水で線虫を維持し、女性は10分間産卵させることにより得ました。第二段目の少年（J2）は、暗所で25℃で24時間の卵をインキュベートすることによって同期化され、初期のJ4は、別の52時間、灰色カビ、 ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）とJ2を培養することによって得ました。この時点で、ほとんどのJ4線虫は彼らの生殖器の形態を使用して、男性または女性であるとして明確に区別することができました。男性と女性のJ4を回収し、バージン成体線虫を得るために、24時間に2つの異なるペトリ皿中で別々に培養しました。処女男性と処女雌はワットの低下に対になりました凹形スライドのウェル内の小胞体。交尾行動は、実体顕微鏡下でのビデオレコーダーで撮影されました。交配プロセスの全期間は82.8±3.91分（平均±SE）であったと4つの異なる段階に分けることができます、と連絡交尾、と余韻、検索。期間の平均分はそれぞれ、21.8±2.0、±1.9 28.0、25.8±0.7および7.2±0.5でした。イレブンサブ挙動が記載された：、クルージング近づいて、遭遇し、触れる、掛け、位置、取り付け、射精、分離、静止状態、およびローミング。一人の女性が3人の男性または女性3と1人の男性とグループ化されたときに興味深いことに、明らかなイントラ性的競争が観察されました。このプロトコルは、Bセンチュウの交尾行動を調査する中で、だけでなく、他の線虫の行動学的研究のための基準として機能するだけでなく、有用かつ貴重なものです。

バージン成人の交配成功率（R）は、ランダムに選択された成人のものよりも有意に高かった、平均で86.67％であった：13.33±4.65％（F = 1301.71、DF = 1、P = 0.0001）（ 図2）。この知見は、ランダムに選択された大人と比べ処女大人とB.センチュウの交尾行動を観察することが容易であることを示唆しています。 1人の男性が一人の女性とペアになったときに、全体の交配プロセスは、平均で82.8分続きました。全体のプロセスは、4つの異なる位相によって記述することができます、検索接触し、交尾、と余韻。これらの4つのフェーズの継続時間は21.8±2.0分、28.0±1.9分、25.8±0.7分、および7.2±0.5分で、それぞれ（ 図3）でした。最近の刊行物では、我々は、近づいて、encounteriをクルージングと...

マツノザイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusの交配行動を調査するためのプロトコルが提示されます。B. xylophilusの行動特性は、交配過程で説明されています。

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

この手順の全体的な目標は、マツノイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusの交配行動を観察することです。この方法は、線虫の心理学的研究を進めるのに役立ちます。これは特に、マツノキセンチュウの交配行動の遵守を扱います。この手法の主な利点は、処女の成体を得ることができるため、成体の交配行動を観察するのがはるかに容易になることです。この技術の意味は、線虫が同様のライフサイクル行動を持っているため、純粋に線虫の広範な研究にまで及びます。この方法のデモンストレーションは、発生性線虫の制約が練習を必要とし、初期の第一段階の幼体でオスとメスを正確に区別することが容易ではないため、処女成体線虫の獲得が困難であるため、非常に重要です。マツノイセンチュウを培養するには、まずジャガイモのデキストロース寒天プレートを準備します。プレートに接種するには、ベトリタス・セナリア・マットから直径10ミリメートルの真菌マットを打ち抜き、新しいPDAプレートの中央に置きます。暗闇の中で25°Cで5日間菌マットを培養します。5日後、準備したペトリ皿にマツノイセンチュウを加え、暗所で摂氏25度で3日間培養します。真菌から線虫を分離するには、まず収集ツールを準備します。漏斗の下にクランプされたゴムチューブを置き、準備した漏斗をラックに保持して、ベアマン漏斗装置を組み立てます。次に、漏斗の口にガーゼの代わりに濾紙を2層置きます。次に、菌類の培養物を漏斗のセットアップに移し、菌類のマットが浸るまで水を加えます。2時間後、線虫は真菌培養物から出て、濾紙を横切り、ベアマン漏斗の最下部に落ち着きます。漏斗の下に15ミリリットルのチューブを配置し、クランプをゆっくりと離して、線虫を含む数滴の水を集めて線虫を収集します。線虫コレクションを室温で2分間、3, 000 Gで遠心分離します。次に、水の上層部をアスパレートし、ワームを1ミリリットルの水に再懸濁します。線虫の懸濁液を6センチメートルのガラス皿に移し、線虫が自由に泳ぐのを助けるために3ミリリットルの水を加えます。さあ、卵を集めてバージンストックを作りましょう。皿を暗いインキュベーターに移し、妊娠中の女性に10分間卵を産ませます。それらの糖タンパク質表面のために、卵はガラスにくっつきます。次に、皿に付着した卵を邪魔しないように、ワームで水を慎重に取り除きます。次に、卵が乾くのを防ぐために、皿に3ミリリットルの水をすばやく戻します。卵を掃除するこのプロセスを少なくとも3回繰り返して、すべての幼虫と成虫を取り除き、純粋な卵を手に入れます。洗浄した純粋な卵のコレクションに、5ミリリットルの水を加え、摂氏25度の暗闇で卵の発育を進めます。卵培養を開始してから24時間後、孵化したJ2幼虫を採取します。J2幼虫を15ミリリットルのチューブに慎重に移します。次に、コレクションを3, 000 Gで2分間遠心分離します。水の上層を補い、200マイクロリットルの水を追加します。次に、真菌のマットで調製したPDAプレートでJ2幼虫を培養します。52時間後、J2幼虫のほとんどは初期段階のJ4幼虫に成長します。ベールマン漏斗を組み立て、前述のように真菌培養物から線虫を2時間抽出します。待っている間に、ワームを摘むための針を準備します。アルコールバーナーで加熱されたガラスキャピラリーからチップを引き出します。先端の直径は約50ミクロンで、これは成虫の線虫の体幅とほぼ同じである必要があります。2時間後、前述のようにJ4幼虫をきれいなペトリ皿に移します。さて、実体顕微鏡で線虫と性交します。幼虫の約3分の2は通常メスです。女性の外陰部は明らかに男性の解剖学的構造とは異なりますが、ワームは非常に活発なため、性行為には練習が必要です。このプロトコルの最も重要なステップは、最初の早い段階でオスとメスを正確に区別し、分離することです。そうしないと、彼らが大人になったときに、混ざり合って悪いものが出てきます。そのため、交配を観察するのが難しくなります。徐々に、ワームを摘み取り、男性または女性のスライド上の水滴に移します。成功を確実にするために、2人の異なる人々が性別の割り当てを再確認する必要があります。次に、性別のあるワームを含む水滴を適切な真菌培養プレートに移します。次に、処女をさらに24時間培養してから、交尾行動を研究します。マツノイセンチュウの交配行動を観察するには、まず、各ウェルに200マイクロリットルの水を追加して、いくつかの凹型スライドを準備します。次に、準備された処女の成体を1つ選び、準備したスライドに移します。処女の成虫を井戸の中に1時間置いて、新しい水性環境に適応させます。1時間後、ピペットを使用して、異性の処女の成体を1人ウェルに追加します。次に、実体顕微鏡で交配挙動を観察し、定量分析のためにその挙動を撮影します。すべての交配プロセスは通常2時間で終了します。30分ごとに、蒸発を補うために50マイクロリットルの水を追加します。交配選択と性間競争を調査するために、2つの異なる組み合わせの処女線虫をグループ化して観察します。処女成虫の交配成功率は約87%で、無作為に選ばれた成体よりもはるかに高かった。ペアは、4つの異なるフェーズを含む交配プロセス全体を完了するのに平均83分かかりました。探し、連絡し、交尾し、そして長居する。これらのフェーズ内では、多くの特定の行動パターンが観察されます。1人の女性が複数のオスと出会ったとき、明らかな交配の選択肢がありました。女性は通常、頭を使って1人の男性、通常は頭、体、尾、生殖器に接触します。その後、メスはオスと交尾するか、すぐにオスを離れて、別のオスに泳ぎました。交配成功率は、異なる線虫の組み合わせについて、最初の接触後に測定した。また、インターセクシャルな競争も起こりました。1匹の処女の女性が3人の処女の男性と混ざったとき、男性は彼女と交尾する機会を得るために、できるだけ女性に近づいて接触しようとしました。外陰部が占められると、他のオスは激しい体のスイングや引きずりでそれらを分離するために交尾プロセスを妨害しようとしました。女性のインターセックス競争は、男性のインターセックス競争と多かれ少なかれ似ていると見られました。インターセックス競争のため、異なる組み合わせでの交尾頻度は有意に異なっていました。その開発後、この技術は線虫の行動生態学の探求への道を開きました。この手順をマスターすると、適切に実行されれば、この手順は12日で完了できます。この手順を試みる際には、男性と女性を正確に分離することを覚えておくことが重要です。これは、初期の4段階の幼体で処女の成体を得るためです。

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生物学

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線虫男性の効率的なカルシウム...

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

仲間を守る行動は、属Tigriopusの潮間帯のカイアシ類で重要な役割を果たしています。ただし、この現象を研究するための方法も記載されていません。ここで述べる方法: 処女Tigriopus動物と彼らの仲間を守る行動の定量的解析 2) の 1) 個々...

Tigriopusカイアシ類と仲間を守る行動の定量分析の個別培養

このプロトコルでは、ant Vollenhovia...

誘導と近親交配アリ、 Vollenhovia Emeryiを使用しての評価

精子は、卵母細胞を受精させるために卵管を正常にナビゲートしなければならない。ここでは、...

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

ここでは、遺伝子機能の研究を容易にするために、 ブルサフェレンコス・キシロフィルス におけるRNA干渉の詳細な浸漬方法を紹介します。...

パインウッド線虫、ブルサフェレンコス・キシロフィルスにおけるRNA干渉の応用

Caenorhabditis elegansにおける揮発性性フェロモン抽出と化学吸引アッセイ

このプロトコルは、Pinus pinasterのin vivoおよびin...

マツノザイセンチュウ Bursaphelenchus xylophilus によるIn vivoおよびIn vitroマツの感染と誘導揮発性物質の単離

本プロトコルは、塩化カリウム(KCl)イオンの浸透圧調節を通じて、Bursaphelenchus...

浸透圧制御による Bursaphelenchus xylophilus の第3段階分散幼体のクリプトビオシスへの侵入誘導

学ぶマツノザイセンチュウの交配挙動観察法。処女成虫を取得し、Bursaphelenchus xylophilusの生殖行動を定量化する手法です。線虫行動生態学研究の基盤となる技術を習得できます。

パインウッドセンチュウの交配挙動の観察と定量化、マツノザイセンチュウ

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