修正されたMicroSecureガラス化：人間の胚盤胞のための、安全なシンプルで非常に効果的な凍結保存手順

MicroSecure胚ガラス化法の全体的な目標は、ヒト胚に対して、安全、確実、シンプルかつ効果的な無菌閉鎖ガラス固化手順を提供することです。この方法は、ヒト胚のガラス化における品質管理の変数を最小限に抑えるために開発されたため、信頼性と再現性のある成功が保証されます。この手法の主な利点は、生物学者と研究所の間の技術的なばらつきを排除しようとしていることです。

私たちの技術は非常に簡単に実行できるため、研修生にとって最大の課題は、胚を失わずにピペッティングする方法を学ぶことです。私たちの方法の背後にある考え方は、一般的に使用される2つのFDA承認アイテムを適応させることにより、特殊なデバイスの必要性を排除することでした。内部でラベル付けされたアイオノマー収納ストローと滅菌フレキシペット。

この手法の視覚的なデモンストレーションは、その適用を成功させるための基本的なヒントを強調するため、非常に役立ちます。手順を開始する前に、滅菌済みの0.3mlの精液ストローを、プラグのすぐ前にある基本的な卓上インパルスシーラーの電極のテフロン表面に置き、内部シールを作成します。ハンドルを押すと熱が作動し、赤いライトが消えてビープ音が鳴ったらハンドルを離します。

次に、セットアップを完了する前に、コットンプラグを内側のシールに押し付けます。クライオ希釈およびサンプルの胚盤胞ローディングの場合は、インキュベーターから患者培養皿を取り出し、すべての標本の同定を二次ソースで確認します。実体顕微鏡下で、vit tipと呼ばれるガラス化フレキシペットを使用して、対応するクライオ皿の最上段にある個々の保持液滴に胚盤胞を移動します。

次に、フレキシペットに3マイクロリットルのV1溶液を事前に充填し、内容物の半分を最初の胚に分注します。胚を吸引し、それを最初のV1洗浄液滴に移します。次に、胚を液滴の周囲に2〜3回ピペットで移動させ、液滴の外側に残っているピペットの内容物を皿の表面に取り除きます。

次に、胚盤胞を個々のV1保持ドロップに移動し、vitチップに次のV2溶液をプリロードしてから、新しいvitチップで追加の胚をピペッティングします。先ほど示したように、V2およびV3液滴中の胚盤胞をすべて洗浄した後、V3保持液滴の外側のvit先端から残留溶液と気泡を取り除き、最初の胚の周りから先端にきれいなV3溶液を完全に充填します。容量の約1マイクロリットルを排出し、胚盤胞と残りのV3溶液をvitチップに完全に浸します。

次に、チップをピペットから取り外し、滅菌ガーゼパッドを使用して、vitチップの外面から残留V3溶液を乾燥させます。先端の外面を乾燥させることは重要であり、胚喪失の追加のリスクを負うことはありません。次に、最初に先端を事前に密封されたストローの開放端に挿入し、ストローを反転させ、ラベルの端を下にします。

インナープラグの先端を観察します。開放端に1cmの空域を残してから、安全に溶接シールして閉じます。すべてのストローが密封されたら、ステンレス製デュワーフラスコで液体窒素に直接突っ込み、患者の杖に取り付けられた開いたゴブレットにストローを保管します。

クライオ溶液の溶出と希釈には、対応する6ウェル希釈ディッシュを実体顕微鏡ステージの中央に置き、37°Cのショ糖温浴が入った60 mmシャーレを顕微鏡の片側に置きます。次に、温めるストローを分離し、上部のストローシールを液面より上に保持して、サンプルの同一性を確認します。マヨネーズハサミを使用してストローを内部プラグの下に固定し、ビットの先端を液体窒素に浸したままにします。

品質管理の予防措置として、ハサミをデュワーフラスコに数回しっかりと叩き、先端を内側のストロー側壁から外し、ストローをステレオスコープ表面の横または下に水平方向に周囲の空気中に持ち上げます。ストローのラベルのない端をつかみ、内側のプラグでストローを切断します。次に、ストローを温めたバスディッシュの上に持ち上げ、先端が完全に押し出されるまで、ビットの先端を60度の角度でお風呂に注ぎます。

フレキシペットの基部は、皿の側壁の上に置く必要があります。5〜10秒後、ピペットベースをマイクロキャップピペッティングデバイスに移します。5 分間のタイマーを開始します。

顕微鏡を見ながら、人差し指で球根の穴を覆い、球根をそっと絞って、ガラス化した胚盤胞をビタミンの先端からT1洗浄液に放出します。胚盤胞の放出を確認した後、残存するV3溶液と気泡を陽圧で除去し、内容物を未使用の廃棄井の中央に排気します。vitチップをステルバーピペットに移し、残りの4分間、胚を油下で2番目のT1液滴に移します。

インキュベーション中に、フレキシペットに次の溶液をあらかじめ充填し、T2、3、および4の液滴で胚盤胞を3分間隔で希釈します。最後に、T5液滴中の胚盤胞を摂氏37度の表面で5分間平衡化してから、インキュベーターに戻します。Modified Gardner Blastocyst Grading Systemは、完全な胚盤胞を栄養外胚葉細胞のヘルニアが10%未満であると見なしますが、ヘルニアが最大50%の胚盤胞は拡張したと分類されます。

50%を超えるヘルニアを示す胚盤胞は孵化していると見なされます。実証された凍結保存法と加温法を使用して、着床前遺伝子検査の有無にかかわらず、サイクル開始あたりの高レベルの出生が一貫して達成されています。これらの成功はかなり高いですが、事前に選択された正倍数系胚盤胞を使用します。

実際、凍結保存されたサイクルのみで良好な予後患者集団を評価すると、これらの凍結胚移植データは、着床率と生児出生率の両方で全国平均よりも成功率が優れていることを示しています30%以上主に単一の遺伝子試験された真正数体ガラス化胚盤胞を移植することにより、米国で最も高い着床率と生児出生率の一部、 年齢に関係なく、疾病管理センターが報告した他の2つの評判の高い不妊治療クリニックの最近の全国統計、および生殖補助医療協会が発表したデータと比較して達成されています。MicroSecure ガラス固化は、技術的な容易さ、信頼性、およびクライオセキュリティを念頭に置いて開発された新しい無菌手順です。このシンプルで非商業的なガラス化システムは、ガラス化装置に代わる非常に効果的な低コストの代替品を提供します。

MicroSecure法は、その開発以来、99.9%以上の胚回収と95%以上の完全な胚盤胞生存を保証してきました。これにより、過去3年間で、私たちの臨床診療をほぼすべての凍結保存胚移植サイクルに転換することができました。私たちは、アイオノマー精液ストローの綿栓の前にインナーシールを含めるように手順を効果的に変更し、信頼性の高い溶接シールと優れた加温後の結果を生み出しました。

今日の生殖補助医療業界では、さまざまなデバイスシステムが使用されていますが、MicroSecureガラス固化のように、ユーザーのばらつきを本質的に排除し、最適化された安全性を提供するシンプルさと技術的な再現性を提供するデバイスは他にありません。