Name: エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学ぶマウス胚のエチレングリコール系ガラス化凍結保存法。液体窒素を用いた簡便な操作で90%以上の生存率を達成し、発生毒性を低減。様々なマウス系統への応用が可能な信頼性の高い技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、日本、スポーツ、科学技術、文化、教育省、ナショナルバイオリソースプロジェクトと協力して実施されました。

実験の全体的なスキームを図に示します。 1。 1。試薬の調製<ol><li>以下の表に応じて100mlのガラス瓶に、基本培地を（ここでPB1とも呼ばれる）を確認します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mMの </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800.0 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 0.12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288.1 </td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 203.3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td></td><td> 180.2 </td><td> 5.56 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> Naのピルビン酸</td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td>のCaCl 2、2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td>ペニシリンG </td><td></td><td></td><td> 6.0（約） </td></tr></tbody></table></li><li>フィコール - スクロース（FS）ソリューションを作成します。 <ol><li> 50 mlチューブにPB1ソリューション14mlのために、以下の化学物質を追加。 <table border="1"><tbody><tr><td>フィコール70 </td><td> 6.0グラム</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 3.424グラム</td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0ミリグラム</td></tr></tbody></table></li><li>フィコール70およびPB1溶液中でのショ糖を混ぜて、完全に溶解するまでよく振る。 </li><li>上記の完全な溶解を確認した後、溶液の表面にBSAを追加し、それを根気よく続けるBSAするまで4℃で完全に（&gt; 4時間または一晩）に溶解する。 </li></ol></li><li> 50 mlチューブで平衡化溶液（EFS20）とガラス化液（EFS40）を行います。 <ul><li> EFS20：20％（v / v）のエチレングリコール、24％（w / v）のフィコール、とBSAとPB1の0.4モル/ Lのスクロース</li><li> EFS40：40％（v / v）のエチレングリコール、18％（w / v）のフィコール、とBSAとPB1の0.3モル/ L *スクロース 彼らは6 cryodamageに敏感なので、* BALB / cまたはICR系統の胚は、0.9モル/ Lショ糖にショ糖の濃度を増加させる。 </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20ソリューション </td><td> EFS40ソリューション </td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td> 1ミリリットル</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td> FSのソリューション</td><td> 4ミリリットル</td><td> 3ミリリットル</td></tr></tbody></table></li><li> 0.45μmのfilteを使用してろ過により溶液を滅菌R. 4℃で5ミリリットルポリスチレンチューブとストア内のアリコートを作る℃に彼らは約6ヶ月間使用することができます。 </li><li> 0.75 Mスクロース（TS1）を含む胚融解液の調製<ol><li> PB1のショ糖（ステップ1.1で調製したもの）の7.7 gを溶かし、30 mlに、総容積をもたらす。ショ糖が完全に溶解するまで穏やかに振盪して混合します。 </li><li>表面上に溶液をBSAの90 mgを追加し、完全に溶解するまでそれはスタンドのまま。 </li><li>ろ過により溶液を滅菌する。 </li><li> 4℃で分注し店彼らは約1ヶ月間使用することができます。 </li></ol> 注：TS1はまた市販のM2から調製することができます。 <ol start="6"><li> M2のショ糖の7.7 gを溶かし、30 mlに、総容積をもたらす。 </li><li>ショ糖が完全に溶解するまで穏やかに振盪して混合します。 </li><li>ろ過により溶液を滅菌する。 </li><li> 4℃で分注し店。彼らは約1ヶ月間使用することができます。 </li></ol></li><li> TS2（解凍ソリューション：0.25 Mショ糖）を含む<ol><li>必要に応じて、PB1またはM2の20mlの量で10ml TS1を希釈する。 </li><li> 4℃で分注し店彼らは約1ヶ月間使用することができます。 </li></ol></li></ol> 2。 2セルのマウス胚のガラス化<ol><li> 体外受精の技術で自然交配あるいは従来で2細胞マウス胚を準備します。 </li><li>クライオチューブに分注し50μlのEFS40を。以後、常温でガラス化の手順の残りを実行します。 </li><li> 35ミリメートル以上60ミリメートルのプラスチックペトリ皿の底にEFS20物のアリコートを50μl。 </li><li>培地のみの最小限の量でガラスキャピラリーを使用してEFS20に30胚まで転送する。 2分間タイマーを開始します。 注：ドロップの底の上に置いて胚。これは、胚の効率的な脱水を行います。実体顕微鏡による胚の形態を確認してください。 図に示すように脱水胚は、縮小形態を示す。 2A。彼らは十分に脱水されていない場合は、1以上または2分間待つ。 </li><li>約1.5分で、ソリューションののみ最小限のEFS20ドロップから胚を拾う。ステップ2.1で作成したクライオチューブにEFS40にそれらを転送する。注：最良の結果を得るためには、全ての胚が約2分間でEFS40に転送できるように、胚を拾うのタイミングを調整する。 </li><li> 1分間待ちます。 </li><li>液体窒素（LN 2）に直接クライオチューブを置く。 </li></ol> 3。ビトリファイド2セルのマウス胚を融解<ol><li>解凍する前に、回収された胚の胚培養の培地10μlの滴（ステップ3.13を参照）で料理を準備。使用するまでCO 2インキュベーター内でオイルと場所との皿に蓋をする。注：ルーチン胚培養のためのあらゆるメディアがこの実験で使用されるかもしれませんが、我々はそのようなM16媒体として高い浸透圧でメディアをお勧めします。 </li><li> 37℃にTS1を温める</li><li>フェイスマスクとcryoglovesに置く。 LN 2 tを開きます。ANKと胚を含むクライオチューブを取り出す。 </li><li>すぐにチューブの上部を開き、LN 2を捨てる。次のステップで凍結からTS1を防ぐために30秒間待ちます。 </li><li>チューブにTS1（37℃）850μlを加え、溶液が均一に溶解するまで穏やかpipettings（25秒で約10倍）で溶液を混合する1000ulピペットを使用してください。 </li><li>プラスチック製の60ミリメートルペトリ皿（または時計皿）（ 図3A）にチューブのボリューム全体を転送する。注：彼らはステップ3.14でCO 2インキュベーター内に配置されるまで胚を室温（22〜25℃）で処理する必要があります。 </li><li> 3分間タイマーを開始します。 </li><li>胚を含む培地をシャーレの表面（ 図3B）に分散されるまで、TS1で約2分で、ゆっくりと料理を振る。注：これはTS1に転送するときに彼らは表面近くに浮遊しているので、胚が一番下まで行くのに役立つ。 </li><li>目の上にTS2の三​​50μlの滴を入れてE皿（ 図3C）。 </li><li> TS1の3分後、実体顕微鏡による胚の形態を確認して、彼らは少し縮んだすべきである。 TS1で以前の胚の形態（ 図2B）を参照して 、後で（ 図2C）。注：胚がまだ腫れている場合は、3分〜1詳しくは、TS1に保管してください。 </li><li>胚を拾うとTS2の最初のドロップ（ 図3D）に移す。 3分間タイマーを起動します。 </li><li> 3分後、3番目のドロップ（ 図3E）に2番目のドロップに胚を移すと。 </li><li>ステップ3.1で調製した培地に胚を移す。胚は、 図に示すような形状になります。 2D。 </li><li> CO 2インキュベーター内での場所の皿。約10分後、TS2から引き継がれているショ糖を洗い流すための培地の横にあるドロップに胚を移す。 </li><li>胚移植まで、CO2インキュベーターで培養を継続。 注：転送ブリー解凍の日に受取人の女性の卵管にOS。 in vitroでの長い文化は、マウスの一部の菌株における胚の生存率が低下する場合があります。 </li></ol> 4。代表的な結果： 解凍は、表1と表2に示されており、胚の in vivo開発の後で- in vitroで 。このプロトコルの利点は、マウスの異なる系統に解凍し、その広範な適用後の胚の高い生存性があります。 <table border="1"><tbody><tr><td>ひずみ</td><td>チューブの合計数</td><td>ガラス化胚の数</td><td> （番号（％））を回収</td><td>形態的に正常（第（％）） </td><td>胚盤胞への開発（第（％）） </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397（99） </td><td> 394（99） </td><td> 342（87） </td></tr><tr><td> BALB / cAの</td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296（99） </td><td> 282（95） </td><td> 238（84） </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474（99） </td><td> 443（93） </td><td> 398（90） </td></tr></tbody></table> 表1。一般的なマウス系統におけるガラス化融解胚の体外開発で <table border="1"><tbody><tr><td>胚の状態</td><td>受信者女性の数</td><td>転送された胚の数</td><td>着床部位（番号（％）） </td><td>子孫を生きる（第（％）） </td></tr><tr><td>新鮮な</td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141（78.3） </td><td> 110（61.1） </td></tr><tr><td>ガラス固化</td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202（83.5） </td><td> 125（51.7） </td></tr></tbody></table> 表2。C57BL/6Jマウスにおけるガラス化融解後の胚のin vivoで開発中 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。胚の平衡化、ガラス化、融解を含む実験の全体的なスキーム。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2凍結融解の各段階で胚の形態。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。胚の手順を解凍。すべての手順は室温で実施されています。 （）、クライオチューブにTS1（37℃）850μlを加え、プラスチック製の皿にクライオチューブ内の溶液のボリューム全体を転送する。この時点では、胚は、 図1のように腫れて見える。 2B。 （B）、軽く揺することで皿の表面上にソリューションを広げる。 （C）、プラスチック製の皿にTS2の三​​50μlの滴を入れます。 （D）、TS2の最初のドロップに胚を移す。 図に示すように3分後、胚はshurunken見える。 2C。 （E）、それらをシリアル転送残りのTS2の滴にし、培養培地にLY。

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

1985年2におけるRallとFahyによるマウス胚のガラス化の最初の報告以来、いくつかの技術的改良が融解後の胚の生存性を高めるために行われています。最も成功した変更の一つは、その低毒性と高い膜透過性の凍結保護剤としてエチレングリコールを使用することによって達成された。このような利点は、私たちは、室温4℃凍結胚を処理することができますが、他のガラス化法は、クーラーの温度で渡す胚を必要とし、常にBALB / cの6を含むマウスのいくつかの株には適用されません。第一エチレングリコールベースの​​ガラス化は、笠井らによって開発されました。 1990年5,7インチオリジナルのメソッドはコンテナとしてプラスチック製のストロー用に最適化されているので、我々は若干の研究室でより簡単にアクセスし、物理的な損害に対してより耐性があるクリオチューブ、のためのプロトコルを変更しました。したがって、ここで説明するガラス化法は、アプリケーション可能性があります研究のモデルとしてマウスを用いた多くの研究室にlicable。同じ方法は、桑実胚と胚盤胞の段階8およびラットの胚9時、マウスの胚にも使用できます。しかし、我々は最近、クリオチューブの質が凍結融解後の胚の生存率に影響を与える可能性があることを発見した。従って、それはガラス化胚（;特定の試薬や機器の表で参照など）の前にその滑らかさのためにクリオチューブの内側表面を調べるために不可欠です。 ガラス化法は、従来の緩慢凍結法に比べて多くの利点がありますが、それらは本質的に輸送の目的に関しての欠点を有している。ガラス固化体胚を° Cがその生存を維持するために、以下の-120で保管されるべきであるとして、ドライシッパーは、一般的にそれらの安全輸送に使用されます。特に国際輸送のために、ドライシッパーは重くてかさばるであり、その往復は高価です。我々は、現在で新しいガラス化法を開発していますそのガラス固化体の胚は少なくとも7日間10分間ドライアイス温度（-80℃程度）で保存することができる。このメソッドは、次の世代のガラス化する必要があります。

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>メルクバイオサイエンス（Calbiochem社） </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>和光純薬</td><td> 058から00986 </td><td></td></tr><tr><td>フィコール70 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>和光純薬</td><td> 041から00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>和光純薬</td><td> 191から01665 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>和光純薬</td><td> 163から03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>和光純薬</td><td> 169から04245 </td><td></td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 · 12H 2 </sUB&gt; O </td><td>和光純薬</td><td> 500から04195 </td><td></td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td>和光純薬</td><td> 135から00165 </td><td></td></tr><tr><td>のCaCl 2 · 2H2O </td><td>和光純薬</td><td> 031から00435 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンG </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P - 4687 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P - 8574 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>和光純薬</td><td> 196から00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16培地</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2培地</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td>クライオチューブ</td><td>住友ベークライト</td><td> MS - 4501 </td><td> &quot;極低温バイアル&quot; </td></tr></table>

エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

マウス胚の凍結保存は、マウスの多くの菌株は遺伝的改変によって生成されており、数は一貫して年々増加しているため、生物医科学をサポートする技術基盤です。その技術開発は、その後1980年代後半2で開発されたガラス化法に続いて、1970年代1で緩慢凍結の方法で起動しています。一般に、後者の技法は、その迅速、シンプル、そして回収された胚の高い生存性に有利である。しかし、含まれる凍結保護剤は、非常に有毒であり、その後の胚発生に影響を及ぼす可能性があります。したがって、技術のソリューションを4に冷却されている場合でも、マウスの特定の系統に適用できませんでした° C胚の処理中に毒性影響を軽減する。理研バイオリソースセンターでは、異なる遺伝的背景と表現型と5000以上のマウス系統では3を維持しているため、我々は、ガラス化TEを最適化して我々は周囲温度4でガラス化して（またはより正確に、液化）融解後の高い胚の生存の利点と、マウスの多くの異なる株から胚を凍結保存することができるとchnique。 ここで、我々が正常に当センターで使用されているマウスの胚のガラス化法を提案する。凍結保存液は、胚を5に毒性を最小限にする代わりにDMSOのエチレングリコールが含まれています。また、それぞれ、フィコールと失透と浸透圧調整の防止のためのショ糖が含まれています。胚は、室温で処理し、5分以内に液体窒素に転送することができます。オリジナルのメソッドはコンテナとしてプラスチック製のストロー用に最適化されているので、我々は若干の研究室でより簡単にアクセスし、物理的な損害に対してより耐性があるクリオチューブ、のためのプロトコルを変更しました。それが重要なステレオなので、我々はまた、詳細にガラス化胚の融解の手順を説明生きたマウスの効率的な回収のためのp。これらの手法は、安全かつ費用効果の高い方法で後で使用するためのマウス系統の保存を必要とする研究者や技術者に参考になる。

マウスの胚のエチレングリコールベースの​​ガラス化法が説明されています。それは、そのシンプルさと低胚毒性の他の方法に有利であるため、近交系や遺伝子改変マウスを含むマウスの多くの株、に広く適用することができます。

マウス胚の凍結保存は、遺伝的にさまざまなマウス系統が作製されてきたことから、生物医学研究を支える技術的基盤となっています。

本手順の全体的な目的は、マウス胚を液体窒素で凍結保存し、その後融解させて生存マウスを回収することである。具体的には、まずマウス胚を平衡化培地に浸し、次にクライオチューブ内のガラス化培地へと移し、その後液体窒素タンクに保存することでこれを達成する。その後、胚を高浸透圧培地で融解し、受容雌に移植するまで培養培地で培養する。最終的に、ガラス化融解後の胚の生存率は90%を超え、胚移植後の出生率は30%から70%の間であることが結果に示されています。本手法の主な利点は、透過性凍結保存剤であるグリコールが、従来の凍結保存剤よりも胚に対する毒性が低いことです。本プロトコルの開始前に、私の研究室の技術者が手順を実演します。自然交配または従来のIVF技術により得られた2細胞期のマウス胚2個を、最終的な保存用にクライオチューブに準備し、胚凍結溶液EF S 40を50 µL加えます。次に、35 mmまたは60 mmのプラスチック製ペトリ皿に、室温のEFS 20を50 µL準備します。ガラスキャピラリーを用いて、最大30個の胚をディッシュに移します。この際、培養液が混入しないように注意してください。また、胚の脱水を防ぐため、液滴の底に配置してください。約60〜90秒後、キャピラリーチューブを用いて脱水された胚を吸い上げます。胚は収縮した形態を呈しています。これらの胚をクライオチューブ内のEFS溶液に移動させ、その際、EFS 20の持ち込みを最小限に抑えます。胚を移した後、液体窒素で凍結させる前に、EFS 40内で1分間静置させます。胚を融解させる前に、M 16培地などの高浸透圧胚培養液を10 µLずつ、培養皿に少なくとも2滴滴下します。次に、滴をシリコンオイルまたはミネラルオイルで完全に覆い、使用時まで二酸化炭素インキュベーター内に皿を保管します。次に、フェイスマスクとクライオグローブを着用した状態で、TS one溶液を37 °Cに温めます。液体窒素タンクから胚を取り出します。速やかにクライオチューブを開け、液体窒素をタンクまたは適切な容器に廃棄します。その後、30秒間待ちます。次に、温めたTS one溶液 850 µLをクライオチューブに加えます。溶液が均一に溶解するように、緩やかにピペッティングを10回ほど繰り返します。その後、全量をプラスチック製の60 mmペトリ皿または時計皿に移します。胚が室温に慣れるまで3分間待ちます。胚は以降の操作の間、室温で保持してください。加温装置は使用しないでください。ステレオ顕微鏡下でディッシュ内の胚を迅速に観察し、このインキュベーション開始時の状態を確認します。約2分間のインキュベーション後、培地がディッシュの表面全体に広がるまでディッシュを軽く揺すり、胚を沈めます。インキュベーションの最後の1分間に、TS two溶液を50 µLずつ3滴、別のディッシュに分注します。3分が経過したら、実体顕微鏡を用いて胚がわずかに収縮したことを確認します。胚がまだ膨潤している場合は、さらに1〜3分間インキュベーションを継続してください。その後、ガラスキャピラリーで胚を回収し、TS twoの最初の滴に移します。3分間待機し、胚を2滴目の液に転写します。続いて3滴目の液に転写します。最後に、インキュベーターに保管していた調製済みの胚培養液皿を取り出し、ガラスキャピラリーを用いて胚を培養液の1滴目に転写します。実体顕微鏡下で観察すると、胚は徐々に正常な形態に回復するはずです。ここで、ディッシュをインキュベーターに戻し、約10分間静置します。その後、TS 2から持ち越されたスクロースを洗い流します。胚を次の培養液のドロップへ移動させます。受容雌のucへ移植されるまで、CO2インキュベーター内で胚の培養を継続します。3つの異なるマウス系統から300〜480個の胚をガラス化保存し、その後回復させたところ、生存率は非常に高い結果となりました。融解後、正常な形態を示した胚の割合は93〜99%であり、それらの胚のうち少なくとも84%が胚盤胞へと成長しました。液体窒素の取り扱いは極めて危険であるため、直接的な接触を避け、短距離での曝露を最小限に抑えるための予防措置を忘れないでください。窒素を取り扱う際は、常にこの手順に従ってください。

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオ、記事では、高解凍後の生存率とハムスターの卵母細胞を収集し、凍結保存する方法についてステップバイステップのデモンストレーションを提示する。同じ手順でもうまく着床前の発達の異なる段階でマウスの胚を凍結融解に適用することができます。...

コレクションとハムスターの卵母細胞とマウス胚の凍結保存

着床前の胚は、細胞の脱水を引き起こすことが高張凍結保護溶液中に配置した後に凍結保存することができます。平衡化後、氷の結晶形成は、胚を囲む溶液中で誘導される。胚は徐々に保管するための液体窒素中に急落する前に氷点下の気温に冷却されるとさらに脱水が発生します。...

着床前の牛の胚、羊、ヤギの凍結保存

ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。凍結融解精子を持つ二細胞期胚の開発は、このキットの使用で5マウス系統で一貫して改善された。...

I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

このビデオでは、エチレングリコールとジメチルスルホキシドを凍結保護剤として、極低温ストローをキャリアシステムとして使用して、目的の発生段階で採取したウサギ胚のガラス化の手順について説明します。ガラス化胚は生存率が高く、使用まで長期間保存することができます。...

極低温ストローを用いたウサギ胚ガラス化:ウサギ胚を長期保存するための超急速冷却技術

このビデオでは、ガラス化ウサギの胚を解凍する手順と、最適な胚回収のための予防的な測定手順を示しています。...

ウサギ胚融解:胚移植のための凍結保存されたウサギ胚を回収するための加温手順

子宮卵管胚移植は、子宮の転送を実行するときに発生する可能性があり、胚の流出を防止するためのバリアとして子宮卵接合を使用しています。精管切除雄は、胚移植のための偽妊娠レシピエントを得るために必要とされる。両方の技術が議論されている。...

マウスモデルにおける子宮卵管胚移植と精管切除

修正されたMicroSecureガラス化：人間の胚盤胞のための、安全なシンプルで非常に効果的な凍結保存手順

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

タイムラプス形態プロトコル previtrification...

ガラス化と地球温暖化の手順中に胚盤胞の行動の客観的評価のための形態のプロトコル

ここでは、1細胞胚の凍結保存のための改変方法と、遺伝子組換えマウスの効率的な生成のための凍結解凍胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせたプロトコルを提示する。...

遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

ここでは、マウスとヒツジの着床前胚をガラス化するためのスパチュラモンテビデオプロトコルを紹介します。これは、自家製のヘラで構成され、自家製のソリューションを利用しています。胚を濃度を上げる2つの凍結保護溶液で迅速に平衡化し、スパチュラにロードし、液体窒素に浸漬し、最後に0.5mLストローで密封します。...

哺乳類胚のガラス化のためのスパチュラモンテビデオ

学ぶマウス胚のエチレングリコール系ガラス化凍結保存法。液体窒素を用いた簡便な操作で90%以上の生存率を達成し、発生毒性を低減。様々なマウス系統への応用が可能な信頼性の高い技術です。

エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存

さらに動画を探す