エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存

この手順の全体的な目標は、マウスの胚を液体窒素で凍結保存し、生きたマウスの回収のためにそれらを解凍することです。これは、まずマウス胚を平衡化培地に浸し、クライオチューブ内のガラス化培地に移し、次に液体窒素タンクに入れることによって達成されます。その後の胚は、高浸透圧培地で解凍し、レシピエントの雌に移されるまで培養培地でインキュベートすることができます。

最終的に、結果は、ガラス固化融解後の胚の90%以上の生存率と、胚移植後の出生率が30〜70%であることを示しています。この技術の主な利点は、透過性の凍結保護剤グリコールが従来の凍結保護剤よりも胚に対する毒性が低いことです。手順のデモンストレーションは、このプロトコルを開始する前に、私の研究室の技術者になります。

自然交配または従来のIVF技術によって得られた培養物中の2つの細胞マウス胚をクライオチューブに調製し、最終的に保存するために、50マイクロリットルの胚凍結溶液EF S 40を加えます。次に、35ミリメートルまたは60ミリメートルのプラスチックペトリ皿を50マイクロリットルの室温で準備します。EFSの20。

ガラスキャピラリーを使用して、最大30個の胚を皿に移植します。培地を移さないように注意してください。また、胚の脱水を確実にするために、それらを滴の底に置きます。

約60〜90秒後、毛細管を使用して脱水胚を引き上げます。縮んだ形態で。これらの胚をクライオチューブ内のEFS溶液に移し、EFS 20をできるだけ少なく移します。

胚が移植されたら、EFS 40に1分間沈殿させてから、液体窒素で凍結します。胚を解凍する前に、M16培地などの10マイクロリットルの高浸透圧胚培養培地を少なくとも2滴培養皿に入れます。次に、液滴をシリコンまたは鉱油で完全に覆い、使用するまで皿を二酸化炭素インキュベーターに入れます。

次に、フェイスマスクとクライオ手袋を着用しながら、TS one溶液を摂氏37度に温めます。液体窒素タンクから胚を取り出します。次に、クライオチューブをすばやく開き、液体窒素をタンクまたは適切な容器に捨てます。

その後、30秒待ちます。次に、850マイクロリットルの温かいTS 1溶液をクライオチューブに加えます。溶液を約10回静かに吸い上げて落胆させ、均一に溶解させます。

次に、ボリューム全体をプラスチック製の60mmシャーレに移します。または、胚が室温に平衡化するのを3分間待つのをガラスで観察し、残りの手順でそこにとどまる必要があります。ウォーミングデバイスは使用しないでください。

実体顕微鏡で皿の中の胚をすばやく調べて、このインキュベーションの開始時に胚がどのように見えるかを把握します。約2分間のインキュベーション後、培地が皿の表面に広がるまで皿を静かに振って胚を沈めます。インキュベーションの最後の1分で、皿にTS 2溶液の3つの別々の50マイクロリットル滴を排出します。

3分が過ぎたら、実体顕微鏡を使用して、胚がわずかに縮小したことを確認します。胚がまだ腫れている場合は、さらに1〜3分間インキュベーションを続けます。次に、ガラスキャピラリーで胚を拾い上げ、TS 2の最初のドロップに移します。

3分待ってから、胚を2番目のドロップに移します。続いて3番目のドロップが続きます。最後に、インキュベーターに保存された準備された胚培地皿を取り出し、ガラスキャピラリーを使用して胚を培地の最初の滴に移します。

ステレオスコープで調べると、胚はゆっくりと正常な形態を回復するはずです。次に、皿をインキュベーターに約10分間戻します。その後、TS2から持ち越されたショ糖を洗い流します。

胚を次の培養液に移します。CO2インキュベーターで胚を培養し続け、受容者の女性のUCに移します。3つの異なるマウス系統の胚をガラス化し、300〜480個の胚を回収した後、生存率は非常に高かった。

融解後、正常な形態を示す胚の割合は93〜99%であり、それらの胚の少なくとも84%が芽球嚢胞に発展しました。漏れる窒素を扱う作業は非常に危険であり、直接接触を避け、漏れへの短距離の曝露を最小限に抑えるための予防措置であることを忘れないでください。窒素は、この手順を実行して常に摂取する必要があります。