走査型透過電子顕微鏡を用いて、液体中にナノサイズのオブジェクトの動的プロセスを学びます

液相走査透過型電子顕微鏡の全体的な目標は、厚さが数マイクロメートルまでの液体層に完全に埋め込まれた生体試料中のナノ材料の構造と現象を観察することです。この方法は、液体中のナノ材料の挙動や自然の液体環境における生物学的サンプルの研究など、材料科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、液体中の試料に関するナノスケールの形態学的情報を提供することです。

一般に、この方法に不慣れな人は、試料ホルダーの装填と画像取得が電子顕微鏡で最初に行われるほど簡単ではないため、苦労するでしょう。手順を開始するには、清潔な層流フードで、繊維を含まない組織と純粋なエタノールを使用して、光学顕微鏡スライドガラスを洗浄します。スライドを蓋付きのシャーレのクリーンルームティッシュに置きます。

SiNマイクロチップを操作するには、カーボンコーティングされたピンセットを使用して、マイクロチップの長辺をしっかりとつかみ、SiN膜を常に上に向けておきます。この手法を用いて、スペーサーなしのマイクロチップを5つ、200ナノメートルのスペーサーを含ませたマイクロチップを5つスライドガラス上に置きます。ペトリ皿を閉じ、マイクロチップをヒュームフードに持ってきます。

マイクロチップをHPLCグレードのアセトンのビーカーに入れ、メンブレン面を上にして置きます。ビーカーを2分間静かに回して、マイクロチップをひっくり返さないように注意しながら、保護コーティングを取り除きます。次に、マイクロチップを純粋なエタノールのビーカーにすばやく移します。

ビーカーをアルミホイルで覆います。ビーカーを2分間静かに回転させてコーティングの除去を終了し、閉じたペトリ皿に入れて層流フードに運びます。マイクロチップがピンセットから解放されるときにマイクロチップをひっくり返さないように注意しながら、新しいクリーンルームティッシュにマイクロチップを置きます。

マイクロチップを数分間乾かします。次に、マイクロチップをペトリ皿のスライドガラスに置きます。ペトリ皿を閉じ、マイクロチップをプラズマクリーナーに持っていきます。

スライドガラスとマイクロチップをプラズマクリーナーに入れ、5分間のクリーニングプログラムを実行してSiN膜から炭化水素を除去します。光学顕微鏡を使用して、マイクロチップに破裂した膜や汚れの粒子がないか調べます。損傷したマイクロチップや汚れたマイクロチップは廃棄してください。

層流フードで、マイクロチップを粘着性のある清潔な輸送ボックスに固定します。スペーサーなしで各マイクロチップのSiN膜に3モルクエン酸安定化金ナノ粒子水溶液の1マイクロリットル液滴を塗布し、溶液を乾燥させます。次に、1マイクロリットルの脱イオン水をメンブレンに塗布して、塩分と界面活性剤を洗い流します。

30秒後、濾紙で慎重に水を取り除き、マイクロチップを乾かします。液体フローTEMホルダーの先端を双眼光学顕微鏡の下に置きます。ホルダーの先端からチタン製の蓋を取り外し、アルミホイルのシートの上に置きます。

0.5ミリリットルのHPLCグレードの水が入った1ミリリットルのガラスシリンジでマイクロ流体シリンジポンプを設置します。シリンジをフローシステムに接続し、ポンプを始動します。水がシステムを介して洗い流されるとき、漏れや流れの狭窄がないかラインを確認します。

ポンピングが完了したら、液セルコンパートメントからリンスを取り出し、ホルダーの先端を濾紙で乾かします。ホルダーの先端を光学顕微鏡で点検します。先端をクリーンルームティッシュで乾かし、清潔なPTFEコーティングピンセットでほこりや繊維を取り除きます。

ホルダー先端の蓋、Oリング、ネジを点検し、PTFEコーティングされたピンセットでほこりや繊維を取り除きます。Oリングをホルダーグループに配置します。最初のネジを取り付け、数回回して固定します。

きれいな湾曲したピンセットを使用して、SiNメンブレンを上に向けてホルダーチップのポケットにサンプルマイクロチップを置きます。双眼光学顕微鏡を使用して、マイクロチップが正しく取り付けられていることを確認します。0.3マイクロリットルの純ろ過水をサンプルマイクロチップに置きます。

マイクロチップをピンセットで固定します。次に、湾曲したピンセットを逆さまに保持したスペーサーマイクロチップを手に取ります。ピンセットを慎重に回転させて、マイクロチップの膜が下を向くようにします。

スペーサーマイクロチップをサンプルマイクロチップに置きます。ホルダー先端の下に光反射材を置き、双眼光学顕微鏡でマイクロチップの位置合わせを確認します。ピンセットを使用して、SiNウィンドウの位置がずれている場合はマイクロチップを慎重に調整します。

次に、ピンセットで試料室の蓋をつかみます。蓋を逆さまにし、マイクロチップに触れないように、蓋の裏側をホルダーの先端に置きます。ピンセットを使用して残りのネジを配置し、両方のネジを繰り返し締めます。

抵抗に達するまで慎重に締めます。締め付けが強すぎると、窓が壊れやすくなります。システム内を毎分4マイクロリットルの液体の流れを開始し、ホルダーの先端に漏れがないか確認します。

その後、ホルダーを真空ポンプステーションに持って行き、リークチェックを行います。圧力が5分以内に少なくとも10から負の5 mbarに達することを確認します。ホルダーをエンクロージャーに入れます。

そして、ホルダーを電子顕微鏡に持っていきます。顕微鏡をSTEMモードにセットアップします。水を含まない参照サンプルとして、金ナノ粒子でコーティングされた薄い炭素膜を使用して電子ビームの電流密度を測定します。

毎分2マイクロリットル以下の速度で純水の流れを開始します。液体フローTEMホルダーを真空ロードロックに挿入し、排気を開始します。圧力が正常に低下することを確認します。

次に、TEMホルダーを顕微鏡に完全に挿入します。圧力が十分に低くなったら、ビームバルブを開き、ADF検出器を挿入します。顕微鏡を連続取得モードに設定し、サンプルステージをX方向とY方向に移動してSiNウィンドウを見つけます。

コントラストと明るさを調整して、ウィンドウの端がはっきりと見えるようにします。ステージを X 方向と Y 方向に移動して、ウィンドウの角が視野の中心にくるようにします。次に、対物レンズをリセットします。

サンプルステージの垂直位置を調整して、コーナーに粗い焦点を合わせます。ステージを前後に5度傾けて、サンプルがユーセントリック高さにあることを確認します。ウィンドウの角を視野の中央に配置し、ステージの位置をソフトウェアに保存します。

金ナノ粒子が見えるまで、ステージをX方向とY方向に並進します。そして、対物レンズのピントを合わせます。電流密度をメモし、液体セルの厚さを計算します。

ステージをX方向とY方向に平行移動して、少なくとも20個の金ナノ粒子が存在する領域を見つけます。パラメータを設定し、画像を取得します。金ナノ粒子を窒化ケイ素膜に固定化し、液相STEMで画像化します。

純水中では、金ナノ粒子はイメージング中もその形状を維持していました。水からの放射線分解生成物は、個々の金原子を酸化し、最終的にナノ粒子の形状を変える可能性があります。別の実験では、塩化物イオンを液相に導入します。

酸化された金原子が可溶性テトラクロロオーレアを形成すると、金ナノ粒子は実験を通じてゆっくりと溶解しました。水中での金ナノ粒子の動きを調べるために、その後の実験では、ナノ粒子はサンプル膜上に完全に固定化されていませんでした。金ナノ粒子は凝集し、臨界クラスターサイズに達すると視野外に移動しました。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。数週間のトレーニングが必要になります。この手順を試すときは、落ち着いて作業し、真空の気密性と液体の濃さを確認することを忘れないでください。

この技術は、開発後、材料科学、化学、生物学の研究者が、液体中のナノ粒子の成長と移動、液体環境におけるナノスケール材料の構造、および哺乳類細胞におけるタンパク質の機能を研究する道を開きました。このビデオを見た後、試料ホルダーの正しい装填や顕微鏡の調整など、水層に埋め込まれた金ナノ粒子の走査型透過型電子顕微鏡法の実施方法について十分に理解できるはずです。電子顕微鏡で液体を扱う作業は、試料ホルダーが正しく装填されていないと損傷する可能性があることを忘れないでください。

そのため、ロードする前に真空漏れを確認することが重要です。