Name: 走査型透過電子顕微鏡を用いて、液体中にナノサイズのオブジェクトの動的プロセスを学びます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶ走査型透過電子顕微鏡を用いた液体中ナノ材料の動的観察法。金ナノ粒子を用いた試料調整から画像取得までのプロトコルを解説し、ナノスケールの動的プロセスを可視化する手法を習得できます。

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INMを通じてE. Arzt氏の支援に感謝します。この研究は、ライプニッツコンペティション2014の支援も一部受けました。

<ol><li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy.</a> Science. 350, 9881-9889 (2015).</li>
<li>de Jonge, N., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+specimens+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of specimens in liquid.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).</li>
<li>Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+single+colloidal+platinum+nanocrystal+growth+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories.</a> Science. 324, 1309-1312 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+growth+of+nanoparticles+from+solution+with+in+situ+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).</li>
<li>Alloyeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+kinetic+and+thermodynamic+effects+on+the+growth+of+gold+nanoplates+by+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).</li>
<li>Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+carbonate+nucleation+driven+by+ion+binding+in+a+biomimetic+matrix+revealed+by+in+situ+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy.</a> Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).</li>
<li>de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macromolecular+complexes+with+in+situ+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1085-1090 (2012).</li>
<li>Dukes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microchip+design+and+application+for+in+situ+transmission+electron+microscopy+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules.</a> Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li>
<li>de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/278397751_Practical_Aspects_of_Transmission_Electron_Microscopy_in_Liquid">Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid.</a> Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).</li>
<li>Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptionally+slow+movement+of+gold+nanoparticles+at+a+solid%3Aliquid+interface+investigated+by+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy.</a> Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).</li>
<li>Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp507400n">Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).</li>
<li>Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+induced+chemistry+of+gold+nanoparticles+in+saline+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution.</a> Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).</li>
<li>Schuh, T., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S163107051300203X">Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids.</a> C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).</li>
<li>Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+chip+system+with+a+microfluidic+channel+for+in+situ+electron+microscopy+of+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids.</a> Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).</li>
<li>Creemer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/5428851/">A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions.</a> J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).</li>
<li>Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microscopy+of+nanoscale+cluster+growth+at+the+solid-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface.</a> Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+cells+and+tissues+under+fully+hydrated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Reimer, L., Kohl, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReimer%2C+L+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+quantitative+liquid+%28scanning%29+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy.</a> Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).</li>
<li>Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+procedures+to+mitigate+electron+beam+induced+artifacts+during+in+situ+fluid+imaging+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials.</a> Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).</li>
<li>Unocic, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+electrochemical+measurements+using+in+situ+ec-S%2FTEM+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices.</a> Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).</li>
<li>Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-matsci-070511-155004">Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale.</a> Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).</li>
<li>Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+microscopy+at+a+spatial+resolution+better+than+15+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm.</a> Nature. 435, 1210-1213 (2005).</li>
<li>Larabell, C. A., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+architecture+with+X-rays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular architecture with X-rays.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).</li>
<li>Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atomic+force+microscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">atomic force microscopy of biological samples.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).</li>
<li>Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+conventional+and+video-speed+scanning+probe+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes.</a> Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).</li>
<li>Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instr%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy in liquid.</a> Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

記載されているプロトコルは、動的プロセスの観察を含め、液体中にAuNPsのSTEMを可能にします。ホルダーの組み立てが容易に習得できる技術です。液体流TEMホルダーで作業する場合しかし、いくつかの側面を考慮しなければなりません。例えば、Oリング上のSiマイクロチップや大きな粒子の壊れたエッジは、液晶セルの漏れが生じることがあります。一方、大きな粒子（&gt; 200nmで、 例えば、埃やSiの破片）のSiN膜上には、低イメージング造影または低空間分解能につながる、液晶セルの厚さが増加をもたらす可能性があっても発生することがありこのSiN窓が破壊します。重要なことには、塩または他の化学物質の残留物は、望ましくない方法での実験の結果に影響を及ぼし得ます。したがって、試料調製及びホルダアセンブリの異なるステップを慎重かつ清潔で埃のない環境で行われることが重要です。 液体CEの厚さllが達成可能な解像度だけでなく、得られる画像17のコントラストを決定します。この厚さは、2つのSiマイクロチップの上に配置さのスペーサーを介して調整することができます。試料の寸法に応じて、液晶セルの異なる厚さを実現することができます。全体の真核細胞は、最大5ミクロンの大きなスペーサを必要としながら、AuNPsの研究のために、小さいスペーサー（200-500 nm）を使用することが可能です。液晶セルの厚さは、さらに液晶セルと周囲の真空との圧力差から生じたSiN膜の窓の膨らみによって影響されます。この効果は大きいのSiN膜の窓でより顕著になります。したがって、液晶セルの厚さを最小限にするためには、小のSiN膜の窓を使用することが推奨されます。ケースでは、2つの小さな窓の間の重複を見つけることは困難であり、それらは、異なるベースのマイクロチップを用いて、交差した構成で組み立てることができます。代替構成のラーグエリー膨らみ防止し、試料ローディングに関する柱19が、これらの展示欠点でサポートされているモノリシックマイクロチップ18または膜の窓から構成されています。現在の技術の最も困難な側面の一つは、液体の厚さの正確な制御の欠如です。ここに示されたように、多くの場合、液体は、使用されるスペーサの寸法から予想されるものよりもはるかに厚いです。いくつかのグループは、閉じた液室4、20、21、22を用います。これらのシステムは、液体の厚さは、液体中に気泡を誘導することによって減少させることができるように、空間分解能に関するいくつかの利点を有します。また、このSiN窓は薄い液体層につながる、崩壊するように強制することができます。また、はるかに薄い液体が得られる第三に、他のシンナーのウィンドウの筐体が存在する（ 例えば、グラフェン）23、このプロトコルに記載されているシステムで可能なものより。しかし、これらのシステム内の液体を流すことができません。 任意の高解像度顕微鏡技術に関しては、実験的な側面の数が考慮されなければなりません。最も重要な側面は、液体又は試料と電子ビームとの相互作用です。多くの固体試料24のために達成可能空間分解能を制限する放射線損傷に加えて、液体試料も電子線発生放射線分解産物15、25によって影響されます。これらの製品は、実験に影響を与える可能性があるため、慎重なデータの解釈および実験設計は26不可欠です。顕微鏡の設定は、特定の研究の目的に応じて選択すべきです。 ADF STEMは、WHIの液体セルのより大きな厚さの高い原子番号（Z）のイメージングナノ粒子のためのより強力ですルTEMは、低Z材料に良好なコントラストを与え、典型的には高速ですが、薄い液体層3を必要とします 。代わりにADF検出器を使用するBFステムは厚い層27における低Z材料を画像化するのに有利であるため、明視野（BF）検出器は、時々 、画像を液晶セルに使用されます。液晶セルの厚さの増加に伴って、より多くの電流が必要です。しかし、これはまた、放射線分解生成物の濃度を増加させ、放射線損傷を増加させます。また、コントラストの反転は非常に厚い液体（水用&gt; 10μm）のためのADF検出器で観測されることに留意すべきです。 液体の条件は、顕微鏡からホルダーを除去し、サンプルと液体の両方を交換することによって、私たちの実験の間で変更されました。塩濃度を変化させることに加えて、 例えば、一つは、（別の液体中を流れることにより、液体の他の特性を変更することが容易に可能です特定のpHは16を設定するために緩衝液を使用するか、または有機溶液または他の添加剤）を導入することができます。ホルダがまだマイクロ流体システムを通して液体を流すことによって、顕微鏡に挿入されている間に液体を変更することも可能です。しかしながら、この場合には、試料の変化で液体を指し、その時点では不明です。電極を支持するマイクロチップが使用可能であることにも注目すべきであるので、ナノスケールの電気化学実験は、28を行うことができます。 この研究の目的は、水にAuNPsに限定されず、試験片の多種多様なシリカ、酸化チタン、およびポリマーを含む、上述のプロトコルを使用して研究することができます。オブジェクトの動きは、取得中に画像に取り込むことが速すぎる場合には、粘度は、50％グリセロール及び50％水の混合物を使用して一桁低減することができます。 上記の点から、多くの利点は、可能性が、また欠点が明らかになる。 1）任意の実験は、試料全体（被測定物、液体、及びSiN膜）を用いて電子ビームの動的相互作用の影響を受けている;：液相STEMで作業する場合、考慮すべき最も重要な欠点があること2）試料の取り扱いが面倒であり、サンプルまたはマイクロチップは、いくつかのマイクロメートルサイズの粒子を含むため、薄い液体層を達成することはしばしば困難です。 3）液体の厚さは、通常、スペーサーによって設定された意図された厚さから大きく異なります。そして4）空間分解能とコントラストが強く、液体の厚さと観察し、液体中の物体の変化密度の違いに依存します。 現在、十分な方法は、ナノメートルの空間分解能で液体内のオブジェクトの顕微鏡検査のために存在します。アモルファス氷中の電子顕微鏡は、強力な技術で29ですしかし、関与する実験手順は、すべての実験は、氷のサンプルの調製を可能にし、時間分解実験は不可能であり、繊細です。 X線顕微鏡30、31は、原理的には使用することができるが、それは限られた空間分解能を有し、実験室で広く利用可能ではありません。液体中の原子間力顕微鏡は、確立されたが、表面技術、32、33、34、35であるれています。光学顕微鏡は、十分な空間分解能を示しません。現時点では、液体中の電子顕微鏡は、液体中のナノスケールのオブジェクトおよびプロセスの直接顕微鏡検査のための最も強力な技術です。 液相TEMとSTEMはまだルーチン分析技術ではありませんが、まだ開発されています。考慮すべきパラメータの数は相当であり、ofteあります実験結果を再現するn個難しいです。調査中の効果は、電子ビームの結果として生じるプロセスに絡み合っているため、また、定量的なデータを得ることが困難です。ここで説明するプロトコルは、それによって、実験のすべての関連するベース側面を占め、実験プロトコルを標準化することを目指しています。私たちは、このプロトコルは、この新興分野での実験作業のより良い再現性につながることを願っています。

従来の走査型透過電子顕微鏡（STEM）は、分析のための適切な標本、高真空中に配置するのに適し、特に乾燥した固体試料の範囲によって制限されます。しかし、多くの科学技術の質問は、液体環境中のナノスケール材料とプロセスに関するものです。完全に液体中に埋め込まれたサンプルは、現在透過型電子顕微鏡（TEM）およびSTEM 1用試料ホルダーに組み立てられたマイクロ流体チャンバを含む概念を用いてSTEMを用いて研究することができます。それが成長、溶解、およびナノ粒子が2、3、4、5の凝集プロセス、6を含む様々な研究トピックの重要なプロセス、に新たな洞察を提供し、この新たに開発された技術は、ますます人気となっています。のみならず、金属はなく、biominerals 7および生物学的システムは図8、 図9、図 10、 図11を検討することができます。液相STEM用のサンプル負荷と画像取得は、乾燥試料のSTEMよりも異なり、専用の訓練を必要とするプロトコルを伴います。 マイクロ流体システムは、（ 図1A参照）、エネルギー12の200 keVの時の電子ビームのための透明な窒化シリコン（SiN）からの膜ウィンドウをサポートする2つのシリコンマイクロチップで構成されています。寸法のこれらのマイクロチップの取り扱いの詳細については、他の場所で12、13見つけることができます。サンプルは、通常、ナノスケールのオブジェクトが含まれています。本稿では、金ナノ粒子（AuNPs）を観察しました。 AuNPsは、（下向きの電子ビーム走行に関して）トップウィンドウで、またはフロートliquに固定化されていますID。 STEMにおけるナノスケールの空間分解能はAuNPsにわたって電子ビームを走査し、環状暗視野（ADF）検出器9を用いて送信散乱電子を収集することによって得られます。 2マイクロチップは、液体流TEMホルダ1（ホルダSTEM及びTEMの両方のために動作するが、TEMホルダとも呼ばれる）の先端に小さなスロットに配置されています。液体区画は、マイクロチップとの間に形成されるように、マイクロチップの一つは、スペーサーが含まれています。 2マイクロチップの両側にOリング（ 図1B参照 ）、液体室13の真空シールを提供します。 この記事の目的は、興味のあるユーザーは、この新興の新しい技術への容易なアクセスを見つけることができるようにサンプルローディングとデータ収集の基本的な手順を示すことです。特定の会社から入手可能なシステムが使用されるが、このプロトコルは、他の企業のシステムに対して有効です。技術であります液体容器システム13を操作する場合より、従来のTEMとSTEMよりも複雑で、かつ実用的な側面の数が考慮されなければなりません。すべての最も重要なのは、液体区画が正しく、したがって、薄い液体層と真空シールを提供し、組み立てられることを保証することです。したがって、きれいに動作し、液体流TEMホルダの製造および組立中に粉塵の形成を防止するために極めて重要です。具体的には、Oリングと2つのシリコンマイクロチップは、すべての汚染がないことが必要です。マイクロチップの上のほこりの小さな粒子がひどく有用空間分解能の達成を防止することができる組電池の厚さを増加させることができます。何の汚れや損傷が実験後、電子顕微鏡に残されないように真空シールが重要です。このプロトコルは、ロード手順といくつかの必要なテストを説明しています。電子顕微鏡の操作は簡単であり、BUそれは固体試料の顕微鏡に比べていくつかの追加の手順が必要ですtは。液体の厚さの増加に伴って、より多くの電子が吸収され、液体により散乱します。液体の厚さの測定が不可欠です。最後に、プロトコルは、画像が取得され、どのように動的プロセスを研究することができる方法について説明します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig1.jpg"> 図1：走査型透過電子顕微鏡（STEM）のための液体フローセル。 （A）組み立てられた液晶セルの模式図。窒化ケイ素（SiN）から膜の窓を有する2つのシリコンマイクロチップは、2つのOリングとの間に配置されています。液体は、このSiN膜との間に封入されているので、電子顕微鏡の真空から分離されます。サンプルの上に集束電子ビームを走査します。コントラストが散乱電子から得られます。金ナノ粒子（AuNPs）は、このSiN膜で液体内に固定化されているだけでなく、中に移動することができます液体。 （B）のOリングを有する2つのマイクロチップのスタックの概略側面断面図。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>双眼光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M60 CMO</td><td></td></tr><tr><td>球面収差補正器付き走査透過型電子顕微鏡</td><td>日本電子</td><td>ARM200F</td><td></td></tr><tr><td>液体の流れ TEM 試料ホルダー</td><td>DENS Solutions</td><td>オーシャン</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体シリンジポンプ</td><td>ハーバード・サイエンティフィック</td><td>PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ガタン</td><td>Solarus950<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン、ロチソルブ&nbsp;HPLC用プラス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7328.2</td><td></td></tr><tr><td>水、chromasolv Plus for HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、ロチソルブ HPLCグレード</td><td>カール・ロス</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸金コロイド安定化、直径30 nm</td><td>ブリティッシュ・バイオセル</td><td>EM。GC20</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base シリコンマイクロチップ、厚さ 50 nm の窒化ケイ素膜、寸法 20 μ;m x 0.40 mm</td><td>DENSソリューション</td><td>海洋システム</td><td></td></tr><tr><td>用スペーサーシリコンマイクロチップ、厚さ50nmの窒化ケイ素膜、寸法20 & マイクロ;m x 0.40 mm、スペーサーの厚さは200 nm</td><td>DENSの海洋</td><td>システム</td><td></td>のための解決</tr><tr><td>マイクロ流体のピークの管</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック 交換可能な先端 ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESD PVDF(SV)の先端が付いている反磁性、抗酸のステンレス鋼ボディ)</td><td>ideal-tek</td><td>2ASVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>テフロンコーティングされた曲がった鋼鉄ピンセット(「PTFE」が付いているEMS SAコーティング)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78322-7Te</td><td></td></tr><tr><td>テフロンコーティングされた広いくちばし鋼ピンセット (EMS 2A "PTFE" コーティング)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78322-2ATe</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR)</td><td>Hamilton</td><td>81323</td><td></td></tr><tr><td>Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm)</td><td>DuPont</td><td>Sontara MicroPure</td><td></td></tr></tbody></table>

走査型透過電子顕微鏡を用いて、液体中にナノサイズのオブジェクトの動的プロセスを学びます

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

完全に液体中に埋め込まれたサンプルを透過型電子顕微鏡（TEM）およびSTEM用試料ホルダーに組み立てられたマイクロ流体チャンバーを用いて走査型透過電子顕微鏡（STEM）でナノスケールの空間分解能で調べることができます。マイクロ流体システムは、薄い窒化シリコン（SiN）からの膜ウィンドウをサポートする2つのシリコンマイクロチップで構成されています。この記事では、サンプルローディングとデータ収集の基本的な手順を説明します。すべての最も重要なのは、液体区画が正しく、したがって、薄い液体層と真空シールを提供し、組み立てられることを保証することです。このプロトコルは、正確な組み立てを確実にするために、サンプルローディング時実行するために必要なテストの数を含みます。試料を電子顕微鏡にロードされると、液体の厚さを測定する必要があります。あまりに薄い液体は、気泡が形成されている場合のように、液体が存在しないことを示すかもしれないが、誤ったアセンブリは、あまりにも厚い液体をもたらすことができます。最後に、プロトコル画像が取得され、どのように動的プロセスを研究することができる方法について説明します。 AuNPsを含む試料は、純水および生理食塩水の両方で画像化されます。

液体流TEMホルダは、液体中にAuNPsの挙動を研究するために使用しました。 AuNPsを安定純水でのSiN膜上に固定化し、液相STEM（ 図6）を使用して、ナノスケールの分解能で画像化しました。優れたコントラストが強く散乱金で得られました。それが挿入された液体流TEMホルダーで8 PA / cm 2でに達しながら、乾燥試験サンプルについて測定し、蛍光体スクリーン上の電流密度は、20 PA / cm 2でした。 200nmのスペーサの厚さに基づいて予想されたものよりもはるかに大きい式1、T 水 = 2.4±0.5μmで、使用。それにもかかわらず、厚さがナノメートルの空間分解能でAuNPsのイメージングのための大きすぎません。液体厚さが原因でマイクロチップ上に存在するのSiN膜、マイクロチップの非平坦性、および破片の膨らみにスペーサーによって設定さ200nmよりも厚かったです。 - 水溶液 、H•、H +、•OH E）と電子ビームの相互作用から生じる反応性放射線分解生成物があるが、純水の場合= "1"&gt;ページをther.within、AuNPsは、16を撮像する時にその形状を維持します水はAuNPs 15の形状の変化につながる、単一の金原子を酸化することができます。しかし、液体のフローシステムは、第2の実験において、塩化物イオンを導入するために使用された場合、AuNPsの安定性が変化しました。 -塩化物イオンはtetrachloroaureatの形態のAuCl 4中の酸化金原子を安定化することが可能です。 図7は AuNPsがゆっくりと16以前に報告された結果と類似しSTEMイメージングタイムラプスシリーズ、中に溶解していることを示しています。使用される電子線量率のためには、30nmのサイズのAuNPsを溶解させ〜300秒を要しました。 ウォートでAuNPsの動き rは第三の実験（ 図8）で検討しました。実験の前に、液体流TEMホルダは、塩の痕跡を除去するために洗浄しました。最初の実験とは異なり、代替サンプル調製法は、このSiN膜14にAuNPsの弱い付着を達成するために使用しました。この実験では、AuNP溶液は、シリコンマイクロチップ上に配置し、溶液を乾燥させることなく、液体流TEMホルダに組み付け。このようにして、AuNPsは容易に使用する線量率での撮像時にSiN膜から剥離します。残りのAuNPsが罪のウィンドウに近接して、視野内のままAuNPsのいくつかは、バルク溶液に離れて視界から移動しました。これらAuNPsの動きが観察され、そして最終的にはそれらが凝集しました。しばらくして、これらの凝集物はまた、このSiN膜から剥離し、視野の外と溶液中に移動しました。 ntent「FO：キープtogether.withinページ= "1"&gt; <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig6.jpg"> 図6：純水層の上部に直径AuNPs 30nmの走査型透過電子顕微鏡（STEM）顕微鏡写真。示す画像は、原画像の選択された領域です。画像サイズは、ピクセル滞留時間は19マイクロ秒であり、1,024×1024ピクセルであり、ピクセルサイズは0.73 nmであった、そして倍率400,000Xました。 /nm² -電子線量は、このように7.1×10 4電子ました。液体の厚さが2.4ミクロンに達するように計算したように、蛍光体スクリーン上の測定された電流密度は、8 PA / cm 2でした。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig7.jpg"> 図7：タイムラプスシリーズ生理食塩水でAuNPsのSTEM顕微鏡写真の。 （AD）画像は30秒間隔でSTEM像のタイムラプスシリーズから抽出しました。 AuNPs徐々に塩化物イオンの存在の結果として、液体中に溶解します。ピクセル滞留時間は2マイクロ秒であったタイムラプスシリーズのフレーム時間は1.75秒であった、画素サイズが0.44 nmであった、と倍率は500,000Xました。 /nm² -画像あたりの電子線量は1.2×10 4電子ました。液体の厚さは2.4μmでした。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig8.jpg"> 図8：純水での移動AuNPsのSTEM顕微鏡写真。いくつかは、矢印で選択されるのAuNPs、と（A）のSiN膜。 （B）モーショントラック選択AuNPs（Aを参照）。一部のAuNPsは、撮影の時間の間に視界から離れます。残りのAuNPsは、このSiN膜に沿って横方向に移動し、凝集を開始します。フレーム時間は0.52秒であった、1マイクロ秒をされた重要なクラスタサイズに達すると、彼らは膜から派遣とview.The画素滞留時間のフィールドから離れる、画素サイズが1.8 nmであった、と倍率は120,000Xました。画像あたりの電子線量は3.5×10 2電子あった- /nm²と液体の厚さは2.4μmでした。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、ナノスケールの動的プロセスを観察するために使用されるような、水にAuNPsの透過型電子顕微鏡を走査するための液体流試料ホルダの動作を説明します。

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

液相走査透過型電子顕微鏡の全体的な目標は、厚さが数マイクロメートルまでの液体層に完全に埋め込まれた生体試料中のナノ材料の構造と現象を観察することです。この方法は、液体中のナノ材料の挙動や自然の液体環境における生物学的サンプルの研究など、材料科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、液体中の試料に関するナノスケールの形態学的情報を提供することです。一般に、この方法に不慣れな人は、試料ホルダーの装填と画像取得が電子顕微鏡で最初に行われるほど簡単ではないため、苦労するでしょう。手順を開始するには、清潔な層流フードで、繊維を含まない組織と純粋なエタノールを使用して、光学顕微鏡スライドガラスを洗浄します。スライドを蓋付きのシャーレのクリーンルームティッシュに置きます。SiNマイクロチップを操作するには、カーボンコーティングされたピンセットを使用して、マイクロチップの長辺をしっかりとつかみ、SiN膜を常に上に向けておきます。この手法を用いて、スペーサーなしのマイクロチップを5つ、200ナノメートルのスペーサーを含ませたマイクロチップを5つスライドガラス上に置きます。ペトリ皿を閉じ、マイクロチップをヒュームフードに持ってきます。マイクロチップをHPLCグレードのアセトンのビーカーに入れ、メンブレン面を上にして置きます。ビーカーを2分間静かに回して、マイクロチップをひっくり返さないように注意しながら、保護コーティングを取り除きます。次に、マイクロチップを純粋なエタノールのビーカーにすばやく移します。ビーカーをアルミホイルで覆います。ビーカーを2分間静かに回転させてコーティングの除去を終了し、閉じたペトリ皿に入れて層流フードに運びます。マイクロチップがピンセットから解放されるときにマイクロチップをひっくり返さないように注意しながら、新しいクリーンルームティッシュにマイクロチップを置きます。マイクロチップを数分間乾かします。次に、マイクロチップをペトリ皿のスライドガラスに置きます。ペトリ皿を閉じ、マイクロチップをプラズマクリーナーに持っていきます。スライドガラスとマイクロチップをプラズマクリーナーに入れ、5分間のクリーニングプログラムを実行してSiN膜から炭化水素を除去します。光学顕微鏡を使用して、マイクロチップに破裂した膜や汚れの粒子がないか調べます。損傷したマイクロチップや汚れたマイクロチップは廃棄してください。層流フードで、マイクロチップを粘着性のある清潔な輸送ボックスに固定します。スペーサーなしで各マイクロチップのSiN膜に3モルクエン酸安定化金ナノ粒子水溶液の1マイクロリットル液滴を塗布し、溶液を乾燥させます。次に、1マイクロリットルの脱イオン水をメンブレンに塗布して、塩分と界面活性剤を洗い流します。30秒後、濾紙で慎重に水を取り除き、マイクロチップを乾かします。液体フローTEMホルダーの先端を双眼光学顕微鏡の下に置きます。ホルダーの先端からチタン製の蓋を取り外し、アルミホイルのシートの上に置きます。0.5ミリリットルのHPLCグレードの水が入った1ミリリットルのガラスシリンジでマイクロ流体シリンジポンプを設置します。シリンジをフローシステムに接続し、ポンプを始動します。水がシステムを介して洗い流されるとき、漏れや流れの狭窄がないかラインを確認します。ポンピングが完了したら、液セルコンパートメントからリンスを取り出し、ホルダーの先端を濾紙で乾かします。ホルダーの先端を光学顕微鏡で点検します。先端をクリーンルームティッシュで乾かし、清潔なPTFEコーティングピンセットでほこりや繊維を取り除きます。ホルダー先端の蓋、Oリング、ネジを点検し、PTFEコーティングされたピンセットでほこりや繊維を取り除きます。Oリングをホルダーグループに配置します。最初のネジを取り付け、数回回して固定します。きれいな湾曲したピンセットを使用して、SiNメンブレンを上に向けてホルダーチップのポケットにサンプルマイクロチップを置きます。双眼光学顕微鏡を使用して、マイクロチップが正しく取り付けられていることを確認します。0.3マイクロリットルの純ろ過水をサンプルマイクロチップに置きます。マイクロチップをピンセットで固定します。次に、湾曲したピンセットを逆さまに保持したスペーサーマイクロチップを手に取ります。ピンセットを慎重に回転させて、マイクロチップの膜が下を向くようにします。スペーサーマイクロチップをサンプルマイクロチップに置きます。ホルダー先端の下に光反射材を置き、双眼光学顕微鏡でマイクロチップの位置合わせを確認します。ピンセットを使用して、SiNウィンドウの位置がずれている場合はマイクロチップを慎重に調整します。次に、ピンセットで試料室の蓋をつかみます。蓋を逆さまにし、マイクロチップに触れないように、蓋の裏側をホルダーの先端に置きます。ピンセットを使用して残りのネジを配置し、両方のネジを繰り返し締めます。抵抗に達するまで慎重に締めます。締め付けが強すぎると、窓が壊れやすくなります。システム内を毎分4マイクロリットルの液体の流れを開始し、ホルダーの先端に漏れがないか確認します。その後、ホルダーを真空ポンプステーションに持って行き、リークチェックを行います。圧力が5分以内に少なくとも10から負の5 mbarに達することを確認します。ホルダーをエンクロージャーに入れます。そして、ホルダーを電子顕微鏡に持っていきます。顕微鏡をSTEMモードにセットアップします。水を含まない参照サンプルとして、金ナノ粒子でコーティングされた薄い炭素膜を使用して電子ビームの電流密度を測定します。毎分2マイクロリットル以下の速度で純水の流れを開始します。液体フローTEMホルダーを真空ロードロックに挿入し、排気を開始します。圧力が正常に低下することを確認します。次に、TEMホルダーを顕微鏡に完全に挿入します。圧力が十分に低くなったら、ビームバルブを開き、ADF検出器を挿入します。顕微鏡を連続取得モードに設定し、サンプルステージをX方向とY方向に移動してSiNウィンドウを見つけます。コントラストと明るさを調整して、ウィンドウの端がはっきりと見えるようにします。ステージを X 方向と Y 方向に移動して、ウィンドウの角が視野の中心にくるようにします。次に、対物レンズをリセットします。サンプルステージの垂直位置を調整して、コーナーに粗い焦点を合わせます。ステージを前後に5度傾けて、サンプルがユーセントリック高さにあることを確認します。ウィンドウの角を視野の中央に配置し、ステージの位置をソフトウェアに保存します。金ナノ粒子が見えるまで、ステージをX方向とY方向に並進します。そして、対物レンズのピントを合わせます。電流密度をメモし、液体セルの厚さを計算します。ステージをX方向とY方向に平行移動して、少なくとも20個の金ナノ粒子が存在する領域を見つけます。パラメータを設定し、画像を取得します。金ナノ粒子を窒化ケイ素膜に固定化し、液相STEMで画像化します。純水中では、金ナノ粒子はイメージング中もその形状を維持していました。水からの放射線分解生成物は、個々の金原子を酸化し、最終的にナノ粒子の形状を変える可能性があります。別の実験では、塩化物イオンを液相に導入します。酸化された金原子が可溶性テトラクロロオーレアを形成すると、金ナノ粒子は実験を通じてゆっくりと溶解しました。水中での金ナノ粒子の動きを調べるために、その後の実験では、ナノ粒子はサンプル膜上に完全に固定化されていませんでした。金ナノ粒子は凝集し、臨界クラスターサイズに達すると視野外に移動しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。数週間のトレーニングが必要になります。この手順を試すときは、落ち着いて作業し、真空の気密性と液体の濃さを確認することを忘れないでください。この技術は、開発後、材料科学、化学、生物学の研究者が、液体中のナノ粒子の成長と移動、液体環境におけるナノスケール材料の構造、および哺乳類細胞におけるタンパク質の機能を研究する道を開きました。このビデオを見た後、試料ホルダーの正しい装填や顕微鏡の調整など、水層に埋め込まれた金ナノ粒子の走査型透過型電子顕微鏡法の実施方法について十分に理解できるはずです。電子顕微鏡で液体を扱う作業は、試料ホルダーが正しく装填されていないと損傷する可能性があることを忘れないでください。そのため、ロードする前に真空漏れを確認することが重要です。

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ここでは、マシンビジョンソフトウェアを利用してTEMイメージング中の動的プロセスを安定化させると同時に、各画像のメタデータの複数のストリームをナビゲート可能なタイムラインにインデックス化するプロトコルを紹介します。このプラットフォームが、実験の過程で電子線量の自動キャリブレーションとマッピングをどのように可能にするかを示します。...

透過型電子顕微鏡ワークフロー、結果分析、データ管理へのマシンビジョンアプローチ

学ぶ走査型透過電子顕微鏡を用いた液体中ナノ材料の動的観察法。金ナノ粒子を用いた試料調整から画像取得までのプロトコルを解説し、ナノスケールの動的プロセスを可視化する手法を習得できます。

走査型透過電子顕微鏡を用いて、液体中にナノサイズのオブジェクトの動的プロセスを学びます

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