走査型透過電子顕微鏡を用いて、液体中にナノサイズのオブジェクトの動的プロセスを学びます
February 5th, 2017
このプロトコルは、ナノスケールの動的プロセスを観察するために使用されるような、水にAuNPsの透過型電子顕微鏡を走査するための液体流試料ホルダの動作を説明します。
液相走査透過型電子顕微鏡の全体的な目標は、厚さが数マイクロメートルまでの液体層に完全に埋め込まれた生体試料中のナノ材料の構造と現象を観察することです。この方法は、液体中のナノ材料の挙動や自然の液体環境における生物学的サンプルの研究など、材料科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、液体中の試料に関するナノスケールの形態学的情報を提供することです。
一般に、この方法に不慣れな人は、試料ホルダーの装填と画像取得が電子顕微鏡で最初に行われるほど簡単ではないため、苦労するでしょう。手順を開始するには、清潔な層流フードで、繊維を含まない組織と純粋なエタノールを使用して、光学顕微鏡スライドガラスを洗浄します。スライドを蓋付きのシャーレのクリーンルームティッシュに置きます。
SiNマイクロチップを操作するには、カーボンコーティングされたピンセットを使用して、マイクロチップの長辺をしっかりとつかみ、SiN膜を常に上に向けておきます。この手法を用いて、スペーサーなしのマイクロチップを5つ、200ナノメートルのスペーサーを含ませたマイクロチップを5つスライドガラス上に置きます。ペトリ皿を閉じ、マイクロチップをヒュームフードに持ってきます。
マイクロチップをHPLCグレードのアセトンのビーカーに入れ、メンブレン面を上にして置きます。ビーカーを2分間静かに回して、マイクロチップをひっくり返さないように注意しながら、保護コーティングを取り除きます。次に、マイクロチップを純粋なエタノールのビーカーにすばやく移します。
ビーカーをアルミホイルで覆います。ビーカーを2分間静かに回転させてコーティングの除去を終了し、閉じたペトリ皿に入れて層流フードに運びます。マイクロチップがピンセットから解放されるときにマイクロチップをひっくり返さないように注意しながら、新しいクリーンルームティッシュにマイクロチップを置きます。
マイクロチップを数分間乾かします。次に、マイクロチップをペトリ皿のスライドガラスに置きます。ペトリ皿を閉じ、マイクロチップをプラズマクリーナーに持っていきます。
スライドガラスとマイクロチップをプラズマクリーナーに入れ、5分間のクリーニングプログラムを実行してSiN膜から炭化水素を除去します。光学顕微鏡を使用して、マイクロチップに破裂した膜や汚れの粒子がないか調べます。損傷したマイクロチップや汚れたマイクロチップは廃棄してください。
層流フードで、マイクロチップを粘着性のある清潔な輸送ボックスに固定します。スペーサーなしで各マイクロチップのSiN膜に3モルクエン酸安定化金ナノ粒子水溶液の1マイクロリットル液滴を塗布し、溶液を乾燥させます。次に、1マイクロリットルの脱イオン水をメンブレンに塗布して、塩分と界面活性剤を洗い流します。
30秒後、濾紙で慎重に水を取り除き、マイクロチップを乾かします。液体フローTEMホルダーの先端を双眼光学顕微鏡の下に置きます。ホルダーの先端からチタン製の蓋を取り外し、アルミホイルのシートの上に置きます。
0.5ミリリットルのHPLCグレードの水が入った1ミリリットルのガラスシリンジでマイクロ流体シリンジポンプを設置します。シリンジをフローシステムに接続し、ポンプを始動します。水がシステムを介して洗い流されるとき、漏れや流れの狭窄がないかラインを確認します。
ポンピングが完了したら、液セルコンパートメントからリンスを取り出し、ホルダーの先端を濾紙で乾かします。ホルダーの先端を光学顕微鏡で点検します。先端をクリーンルームティッシュで乾かし、清潔なPTFEコーティングピンセットでほこりや繊維を取り除きます。
ホルダー先端の蓋、Oリング、ネジを点検し、PTFEコーティングされたピンセットでほこりや繊維を取り除きます。Oリングをホルダーグループに配置します。最初のネジを取り付け、数回回して固定します。
きれいな湾曲したピンセットを使用して、SiNメンブレンを上に向けてホルダーチップのポケットにサンプルマイクロチップを置きます。双眼光学顕微鏡を使用して、マイクロチップが正しく取り付けられていることを確認します。0.3マイクロリットルの純ろ過水をサンプルマイクロチップに置きます。
マイクロチップをピンセットで固定します。次に、湾曲したピンセットを逆さまに保持したスペーサーマイクロチップを手に取ります。ピンセットを慎重に回転させて、マイクロチップの膜が下を向くようにします。
スペーサーマイクロチップをサンプルマイクロチップに置きます。ホルダー先端の下に光反射材を置き、双眼光学顕微鏡でマイクロチップの位置合わせを確認します。ピンセットを使用して、SiNウィンドウの位置がずれている場合はマイクロチップを慎重に調整します。
次に、ピンセットで試料室の蓋をつかみます。蓋を逆さまにし、マイクロチップに触れないように、蓋の裏側をホルダーの先端に置きます。ピンセットを使用して残りのネジを配置し、両方のネジを繰り返し締めます。
抵抗に達するまで慎重に締めます。締め付けが強すぎると、窓が壊れやすくなります。システム内を毎分4マイクロリットルの液体の流れを開始し、ホルダーの先端に漏れがないか確認します。
その後、ホルダーを真空ポンプステーションに持って行き、リークチェックを行います。圧力が5分以内に少なくとも10から負の5 mbarに達することを確認します。ホルダーをエンクロージャーに入れます。
そして、ホルダーを電子顕微鏡に持っていきます。顕微鏡をSTEMモードにセットアップします。水を含まない参照サンプルとして、金ナノ粒子でコーティングされた薄い炭素膜を使用して電子ビームの電流密度を測定します。
毎分2マイクロリットル以下の速度で純水の流れを開始します。液体フローTEMホルダーを真空ロードロックに挿入し、排気を開始します。圧力が正常に低下することを確認します。
次に、TEMホルダーを顕微鏡に完全に挿入します。圧力が十分に低くなったら、ビームバルブを開き、ADF検出器を挿入します。顕微鏡を連続取得モードに設定し、サンプルステージをX方向とY方向に移動してSiNウィンドウを見つけます。
コントラストと明るさを調整して、ウィンドウの端がはっきりと見えるようにします。ステージを X 方向と Y 方向に移動して、ウィンドウの角が視野の中心にくるようにします。次に、対物レンズをリセットします。
サンプルステージの垂直位置を調整して、コーナーに粗い焦点を合わせます。ステージを前後に5度傾けて、サンプルがユーセントリック高さにあることを確認します。ウィンドウの角を視野の中央に配置し、ステージの位置をソフトウェアに保存します。
金ナノ粒子が見えるまで、ステージをX方向とY方向に並進します。そして、対物レンズのピントを合わせます。電流密度をメモし、液体セルの厚さを計算します。
ステージをX方向とY方向に平行移動して、少なくとも20個の金ナノ粒子が存在する領域を見つけます。パラメータを設定し、画像を取得します。金ナノ粒子を窒化ケイ素膜に固定化し、液相STEMで画像化します。
純水中では、金ナノ粒子はイメージング中もその形状を維持していました。水からの放射線分解生成物は、個々の金原子を酸化し、最終的にナノ粒子の形状を変える可能性があります。別の実験では、塩化物イオンを液相に導入します。
酸化された金原子が可溶性テトラクロロオーレアを形成すると、金ナノ粒子は実験を通じてゆっくりと溶解しました。水中での金ナノ粒子の動きを調べるために、その後の実験では、ナノ粒子はサンプル膜上に完全に固定化されていませんでした。金ナノ粒子は凝集し、臨界クラスターサイズに達すると視野外に移動しました。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。数週間のトレーニングが必要になります。この手順を試すときは、落ち着いて作業し、真空の気密性と液体の濃さを確認することを忘れないでください。
この技術は、開発後、材料科学、化学、生物学の研究者が、液体中のナノ粒子の成長と移動、液体環境におけるナノスケール材料の構造、および哺乳類細胞におけるタンパク質の機能を研究する道を開きました。このビデオを見た後、試料ホルダーの正しい装填や顕微鏡の調整など、水層に埋め込まれた金ナノ粒子の走査型透過型電子顕微鏡法の実施方法について十分に理解できるはずです。電子顕微鏡で液体を扱う作業は、試料ホルダーが正しく装填されていないと損傷する可能性があることを忘れないでください。
そのため、ロードする前に真空漏れを確認することが重要です。
概要
このプロトコルは、水中のAuNPの走査型透過電子顕微鏡法のための液体フロー標本ホルダーの操作を説明し、ナノスケールの動的プロセスの観察を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 走査型透過電子顕微鏡法
- ナノ材料
- 液相イメージング
背景
- 液相走査型透過電子顕微鏡法により、液体環境下でのナノ材料の観察が可能になります。
- この技術は、標本に関するナノスケールの形態学的情報を提供します。
- 特に、生物学的サンプルをその自然な液体状態で研究するのに有用です。
- 新しいユーザーは、標本の装填とイメージの取得に課題を感じるかもしれません。
研究の目的
- 生物学的サンプルにおけるナノ材料の構造と現象を観察すること。
- 液体中でのナノ材料の挙動を調査すること。
- ナノスケールの動的プロセスの理解を深めること。
使用された方法
- SiNマイクロチップを清掃し、標本の装填の準備をすること。
- マイクロチップに金ナノ粒子溶液を適用すること。
- イメージングのために液体フローTEMホルダーを使用すること。
- 漏れチェックを行い、マイクロチップの適切なアライメントを確保すること。
主な結果
- このプロトコルは、液体環境下でのAuNPの調製とイメージングを成功裏に実証します。
- プロセス中の標本の完全性を確保するための手順を概説します。
- 結果は、動的プロセスを捉えるための液体フローホルダーの有効性を示しています。
結論
- この方法は、液体中におけるナノ材料の挙動に関する貴重な洞察を提供します。
- 生物学的サンプルを研究するための電子顕微鏡法の能力を高めます。
- 将来的には、材料科学の様々な分野に応用が拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
