レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeqのための実験デザイン：トウモロコシ葉の開発の分析からの教訓

この方法の全体的な目標は、特定の細胞または細胞ドメインにおける転写産物の蓄積を定量化し、変異型サンプルと野生型サンプルの異なるドメイン間または同等のドメイン間で比較できるようにすることです。この方法は、臓器ドメインがどのように特定されるか、特定の突然変異が遺伝子発現にどのように影響するかなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、転写産物の蓄積を、手で解剖するには小さすぎる、細かく定義されたドメインで定量化できることです。

この手順を開始する前に、標準的な条件下でトウモロコシの苗のフラットを生後2週間まで育てます。横方向のセクションのシュートアピスを解剖するには、まず土壌線のすぐ下にある苗を切除します。次に、かみそりの刃を使用して、1つまたは2つの成熟した葉に囲まれた落ち着いた楕円形が見えるまで、茎の付け根から薄いスライスを取り除きます。

ベースから約10ミリメートル上に別のカットを行います。この10ミリメートルのセグメントには、若い葉の原基にシュートの頂端分裂組織が含まれています。10mmのセグメントを回して、ベースが上を向くようにします。

横軸に平行に2つのカットを行い、厚さ2〜3ミリメートルの組織のスライドを取得します。外側の2つの部分を破棄し、固定と埋め込みのために中央のスライスを保持します。ティッシュスライスを約10ミリリットルの農家が氷の上のガラスバイアルに固定します。

すべてのサンプルを解剖した後、真空を適用して気泡を取り除き、固定液の浸透を助けます。掃除機を10分間保持してから、ゆっくりと掃除機を離します。固定液を交換し、摂氏4度で一晩、穏やかに振とうしながらインキュベートします。

翌日、テキストプロトコルに記載されているように、埋め込み用の組織の処理を続けます。パラフィンブロックを鋳造するには、組織包埋ステーションのホットプレートに包埋型を置き、鉗子を使用して、切断面を下に向けて組織サンプルを包埋型に移します。埋め込みリングを金型の上部に置きます。

各型に溶かしたパラフィンを補充します。パラフィンが固まるまで、金型をコールドプレートに移します。パラフィンブロックをシリカゲルを入れた密閉容器に4°Cで保管します。

切片は標準的な手順に従ってミクロトーム上のパラフィンブロックから切り取り、シュート頂端分裂組織を含む中央切片をマウント用に選択します。切片をスライドに取り付けるには、RNaseを含まないスライドまたは焼きたてのスライドを摂氏42度のスライドウォーマーに置きます。各スライドを覆うように50%エタノール溶液を数滴塗布します。

スライド上に切片をそっと置き、切片が膨張するまでエタノール溶液上に浮かせます。次に、スライドを傾け、使い捨てのトランスファーピペットで吸引して余分なエタノール溶液を取り除きます。糸くずの出ないワイプを使用して、追加のエタノール溶液を吸い取ります。

スライドを摂氏42度で数時間または一晩乾燥させます。スライドが乾いたら、シリカゲルを4°Cで入れた密閉容器に保管します。マイクロダイセクションの日にスライドを脱パラフィンします。

3つのガラスCoplinジャー、100%キシレンの約50ミリリットルを含む2つのジャーと100%エタノールの約50ミリリットルを含む1つのジャーを準備します。スライドをキシレン1に2分間、キシレンに2つ2分間、100%エタノールに1分間浸漬します。糸くずの出ないワイプでスライドを水気を切り、室温で風乾します。

この手順を開始するには、スライドをレーザーマイクロダイセクション顕微鏡のステージに固定します。RNasic実験におけるレーザーマイクロダイセクションの成功の重要な要素は、形態学的マーカーと分子マーカーを使用してマイクロダイセクション用の正確なドメインを選択することです。5X対物レンズを使用してスライドを調べ、シュート頂端分裂組織頂点を中心基準点として、各スライドの最も中央値の5つのセクションを特定します。

次に、10Xまたは20Xの対物レンズを使用して、各セクションのプラストクロン7葉原基上の小川の位置を特定します。小綱は、葉の原基の同軸面から突き出た隆起として見えます。レーザーマイクロダイセクションソフトウェアの描画ツールを使用して、この位置に印を付けます。

フリーハンド描画アイコンを選択し、カーソルを適切な位置に移動し、マウスをクリックしてドラッグします。次のステップは、定規と長方形の描画ツールを使用して、各セクションの小川をサンプルとして中心とする高さ100マイクロメートルの長方形を測定することです。定規ツールを使用するには、定規アイコンを選択し、測定する領域の一方の端にカーソルを移動し、クリックしてドラッグし、領域を測定します。

定規の長さが画面に表示されます。定規ツールを使用して、小川を中心とした100マイクロメートルのセグメントを測定します。長方形を描くには、直線描画ツールを選択し、4本の直線を描きます。

同様に、小矩形の上下50マイクロメートルに配置された100マイクロメートルの長方形を測定します。これらはブレードとシースのサンプルになります。レーザーカット機能を使用して、選択したドメインの輪郭に沿って組織切片を切断し、組織の長方形をスライドからチューブの蓋に推進するカタパルト機能を使用して、測定された長方形をマイクロダイセングします。

リグル、ブレード、シースのサンプルを別々のチューブに集めます。同じ手順を使用して、プラストクロンの7つの葉の原基からブレード、リグル、およびシースアダキシャル表皮サンプルをマイクロダイセクションします。最後に、マイクロディスセッションした組織にRNA抽出バッファーを適用し、原稿に記載されているように、RNA抽出、RNA増幅、ライブラリ構築、シーケンシング、およびバイオインフォマティクス解析を進めます。

転写産物の蓄積を分析し、ブレード、リグル、およびシース領域のすべての細胞層を分析したところ、2,359の差次的に発現する遺伝子が見つかりました。同軸性表皮ブレード、小綱、および鞘領域では、3,128の差次的に発現する遺伝子が見つかりました。レーザーマイクロダイセクション、RLM、RNAシーケンシング、およびin situハイブリダイゼーション解析により、これらの代表的な遺伝子が示すように一貫した結果が得られました。

左の漫画はすべての細胞層のLMを示しており、右の漫画は同軸表皮のLMのみを示しています。画像の矢印は、出現している小川を示しています。リグレス1の転写産物の蓄積は、すべての細胞層と表皮LMの両方のリグルで有意に高かった.狭い鞘1つは、すべての細胞層LMと同軸表皮LMの両方のリグル領域で有意にアップレギュレーションされ、出現するリグルの先端に特異的に蓄積します。

機能不明の遺伝子は、小竿表皮LMですべての層LMよりも平均リカウントが高かった.この転写産物は表皮細胞に最も強く蓄積します。4番目の遺伝子であるZm PIN1aは、すべての細胞層の分析で有意に差的に発現していませんでしたが、表皮のみの分析では小川で有意にアップレギュレーションされました。血管組織でのその高い発現は、すべての細胞層が収集されたときに表皮での転写産物の蓄積の違いを混乱させた可能性があります。

この手順を試みる際には、マイクロダイセクションと比較する細胞ドメインの選択と、マイクロダイセクションの精度が実験の成功に不可欠であることを覚えておくことが重要です。