から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

ここでは、ショウジョウバエの翼板のサイレンシングされた領域とアンサイレンシングされた領域のA比較RNA転写産物プロファイリングを達成するために適用されるレーザーマイクロダイセクションの詳細な説明を提供します。このアプローチには、生物学的材料として、手動で解剖したショウジョウバエの画像ディスクを主な機器として、レーザーマイクロディセクタが必要です。LI A-L-L-M-D 6, 000 とリアルタイム PCR マシンを使用しています。

BioRad iqを使用しました。必要な5つの小さなツールは、凹面プレート、小さなペイントブラシマイクロダイセクション鉗子、吊り下げ式ドロップスライド昆虫ピン、シリンジ針に取り付けられたもの、ペット膜の小さなプラスチックチューブを備えた金属フレームです。この方法には、次の手順が含まれます。

ステップ1は、GAL four UASシステムを利用して、子孫に局在する特異的な遺伝子サイレンシングをトリガーするために、2つの適切なophトランスジェニック系統を交差させます。ステップ2、解剖フレームを治療します。ステップ3、レーザーマイクロディセクタを設定します。

ステップ4は、遺伝的交配の幼虫の子孫から翼の想像円板を手動で収集することです。ステップ5、GFP標識された虚数ディスクの特定の領域のレーザーマイクロダイセクションを実行します。ステップ6では、椎間板のサイレンシング領域と非固体領域の等価領域の転写プロファイリングにより、目的遺伝子のサイレンシングによって引き起こされる効果を確立することができます。

それを遺伝子Xと呼ぶ in vivo 転写プロファイリングでは、マイクロ解剖領域からのRNAの抽出、手動解剖の精度の制御、R-T-P-C-Rによる2つのサンプルでのGFP発現の評価、推定の発現の定量化が必要になります。2つのサンプル中のサイレンス遺伝子のターゲットを、リアルタイムR-T-P-C-Rまたはマイクロアレイ解析を行うことにより行います。次に、各ステップの詳細について説明します。

最初のステップは、遺伝的な交配です。遺伝的交配にはGALの4つのUASトランスジェニック株が関与しており、幼虫の子孫でサイレンシングされた想像椎間板を取得することに焦点を当てています。Versatile GAL four systemは、RNA干渉による特異的および局所的な遺伝子サイレンシングをトリガーすることを可能にします。

1つの株は、特定の時間的または空間的なパターンでGAL4を発現するドライバー導入遺伝子を交配に導入します。そして、GALの4発現ドメインを可視化できるA-U-A-S-G-F-Pレポーターです。2番目の株は、ヘアピンサイレンシングRNAを発現するUASレスポンダー導入遺伝子を導入し、細胞内で発現すると遺伝子Xを特異的に標的にすることができます。

このRNAは切断されて小さな干渉RNAを生成し、この交配の子孫で選択された遺伝子Xを特異的にサイレンシングすることができます。UASサイレンシング導入遺伝子は、GAL4タンパク質を発現する細胞でのみ転写されるため、X遺伝子の空間的に制限されたサイレンシングが誘導されます。さまざまなアプリケーションの中で、Grailed GAL four ドライバーによってサイレンシングされた翼板内の RNA 転写産物プロファイリングに着目しました。これは、後部コンパートメントで特異的なサイレンシングを指示します。

沈黙領域は、U-A-S-G-F-P導入遺伝子の発現によって特徴付けられます。後部コンパートメントに。2つのイベントが引き起こされます GGFPの発現と遺伝子xのサイレンシング。

ステップ2、RNA活性を阻害するための解剖フレームの処理。フレームスライドと解剖ツールをDEPC水で室温で少なくとも1時間洗浄し、滅菌チャンバーで乾燥させます。RNAの活性を阻害するには、すでにRNAを含まない新品の50mlチューブを使用し、チューブに鉗子を入れたDEPC水、吊り下げ式ドロップスライド、ペットフレームで満たします。

どちらもマイクロダイセクションに必要です。チューブを閉じ、逆さまにしてから、少なくとも1時間反応させます。室温で、1時間後、鉗子でDEPC水を別のチューブに移動します。

スライドが落ちないように、スライドをチューブの内側に保持します。次に、スライドをチューブ内で乾かします。ステップ3、マイクロダイセクトのセットアップ。

まず、必要なすべてのデバイス、蛍光電球、顕微鏡、およびマイクロダイセクション用のソフトウェアの電源を入れます。警告ウィンドウは、レーザーもオンにするように通知します。それを行い、マイクロディスクトのセットアップを完了する間、レーザーをウォームアップさせます。

今、それは組織を収集するための井戸を準備する時です。切る。ライカLMD 6, 000レーザーカット装置は、最大4本のチューブを装填して異なるサンプルを収集することができます。私たちの目的のためには、2本のチューブだけが必要です。

1つは、GFP陽性の沈黙組織を採取し、もう1つはマイクロペックでGFP陰性組織を採取する。両方のチューブキャップに20マイクロリットルのトライ試薬溶液を充填して、RNAを保存します。これで、マイクロディスクトを使用する準備が整いました ステップ4、joof幼虫の翼イメージングディスクの手による解剖。

前述のように得られた幼虫の子孫から翼の椎間板を分離し、他の組織が椎間板を汚染していないことを確認しますこの目標を達成するために、私は解剖アプローチが一般的にすべての元の椎間板の大部分を収集するために使用されるものとはかなり異なります。まず、幼虫をリンガー液で洗い、付着した媒体を取り除きます。次に、それを吊り下げ式ドロップスライドに移し、すぐに口を引き下げて頭を切り取ります。

昆虫ピンを使用して、他の組織を慎重に解剖します。赤い枠線は、収集する仮想の翼円盤を示しています。ディスクを付着した組織から素早く、そして優しく分離された各ウィングディスクを解剖フレームに移し、すぐに切断します。

この手順は、翼ディスクの総数が100個に達するまで繰り返す必要があります。ステップ5、GFP標識翼ディスクの特定の領域のレーザーマイクロダイセクション。元のウィングディスクがメンブレンに付着したら、カットを進めることができます。

フレームをホルダーに取り付け、ホルダーを電動ステージに固定します。LMD 6, 000を一般的な顕微鏡として使用して、オリジナルのウィングディスクを探してください。それに焦点を合わせ、カットを設定します。

ディスクの両側に収まる楕円形の領域を描きます、GFPポジともう一方。GFP陽性部分を採取したいチューブキャップを選択します。カット開始ボタンを押します。

マイクロディセクタは、移動と切断の機能を選択することにより、前に設定した速度と力で組織を切断することを進めます。選択されていないティッシュピースが落下するまで、カットを手動で微調整できます。3Dアニメーションは、マイクロディセクタカットの下で何が起こるかを示しています レーザー 存在は組織に焦点を合わせ、選択した周囲に沿ってカットを行います。

切断が完了すると、組織片は選択したチューブキャップに落ち、その結果、トライ試薬に落ちます。最初のカットの後、ウィングディスクの反対側にあるカット領域を動かして、同等のGFPネガティブ領域をカットします。新しいカットに進む前に、GFP陽性組織とGFP陰性組織を分離するために、必ず別のチューブキャップを選択してください。

自動カット後、カット開始ボタンを押してください。2 番目のカットの前に 3D アニメーションで示されているように、手動でカットを調整するに進みます。電動ステージは、選択したチューブキャップをカットエリアの下に移動します。

レーザービームは、選択した周囲に沿って切断された組織に焦点を合わせ、切断が完了すると、組織片はTri試薬を含む選択したチューブキャップに落ちます。十分な材料を集めるために、私たちは100枚の想像上の翼の円盤でこの手順を繰り返しました。サンプルを採取したら、チューブをアンロードします。

これは、これまでに行ったすべての作業を失う可能性のあるデリケートなステップです。ですから注意してください。キャップを逆さまにして閉め、実験を進めます。

これはGFP陽性組織を持つものです。これはGFP陰性組織を持つもう1つのものです。ステップ6、トランスクリプションプロファイリング。

チューブを回転させてキャップから液体を取り出し、最大1ミリリットルのトライ試薬を追加します。標準的なtry試薬プロトコルに従って、それぞれ約5、000マイクロメートルの100の領域からRNA抽出を行います。私たちの収量は1.5マイクログラムのRNAでした。

上付き文字3をin vitrogenで使用して、CD NAとランダムヘキサを合成します。手動解剖の精度は、R-T-P-C-Rによる2つのサンプルのGFP発現をチェックすることによって制御されました。定量的R-T-P-C-Rを用いたゲルに示されているように。

サイレンス遺伝子Xの発現レベルを、遺伝子X媒介性調節経路の推定標的の発現レベルとともに評価しました。この図は、遺伝子Xの発現レベルとその推定標的の1つの例を示しています。それらを、非固体の翼板の前部後部コンパートメントにおける基礎発現レベルに関して遺伝子Yと呼ぶ。

選択された遺伝子Xの活性は、サイレンシング時に40%に減少したことがわかりました。対照的に、その推定標的の1つである遺伝子Yは、7倍に有意にアップレギュレーションされていることがわかり、遺伝子Xによって負に制御されているという仮説を検証することになりました。