から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

本資料では、ショウジョウバエの翅原基において、サイレンシングされた領域とサイレンシングされていない領域のRNA転写産物プロファイリングを比較するために適用したレーザーマイクロダイセクションについて詳細に記述します。この手法では、生物学的材料として手動で摘出したショウジョウバエの翅原基を、主要機器としてレーザーマイクロダイセクターを使用します。具体的には、LI A-L-L-M-D 6, 000およびリアルタイムPCR装置を使用しています。

BioRad iqを使用しました。必要な5つの小型器具は、凹面プレート、小型の絵筆、マイクロディセクションピンセット、吊下滴下スライド、そしてシリンゲ針に取り付けられた昆虫用ピン、PET膜付き金属フレーム、小型プラスチックチューブです。本手法は以下の手順で行います。

ステップ1は、GAL4/UASシステムを用いて、後代において局所的かつ特異的な遺伝子サイレンシングを誘導するため、適切な2つのophトランスジェニック系統を交配させる手順です。ステップ2は、解剖用フレームの処理についてです。ステップ3は、レーザーマイクロディセクターのセットアップについてです。

ステップ4では、遺伝的交雑によって得られた幼虫の子代から翅原基盤を manually に回収します。ステップ5では、GFPでラベル化された原基盤の特定領域に対してレーザーマイクロダイセクションを行います。ステップ6では、原基盤のサイレンシング領域と非サイレンシング領域の同等部位について転写プロファイリングを行うことで、目的遺伝子のサイレンシングによって誘発される影響を明らかにすることができます。

遺伝子Xと仮定して、in vivoでの転写プロファイリングには、マイクロダイセクションされた領域からのRNA抽出、手動ダイセクションの正確性の検証、R-T-P-C-Rによる2つのサンプルのGFP発現の評価、およびリアルタイムR-T-P-C-Rまたはマイクロアレイ解析による、これら2つのサンプルにおけるサイレンシング遺伝子の推定標的の発現量の定量化が必要となります。それでは、各ステップの詳細について説明します。

最初のステップは、遺伝学的交配です。この遺伝学的交配では、GAL4 UASトランスジェニック系統を用い、幼虫の次世代において遺伝子サイレンシングが導入された成像盤を得ることを目的とします。汎用性の高いGAL4システムを利用することで、RNA干渉による特異的かつ局所的な遺伝子サイレンシングを誘導することが可能です。

一方の系統により、特定の時間的または空間的パターンでGAL4を発現するドライバー導入遺伝子と、GAL4の発現領域を可視化するためのUAS-GFPレポーターを交配に導入します。もう一方の系統により、細胞内で発現した際に遺伝子Xを特異的に標的とするヘアピンサイレンシングRNAを発現するUASレスポンダー導入遺伝子を導入します。

このRNAは切断されて小干渉RNAを生成し、これにより本交配の後代において選択した遺伝子Xを特異的にサイレンシングすることができます。UASサイレンシング導入遺伝子は、GAL4タンパク質を発現している細胞でのみ転写されるため、X遺伝子の空間的に制限されたサイレンシングが誘導されます。さまざまな応用例の中で、本研究ではGrailed GAL4ドライバーによってサイレンシングされた翅原基におけるRNA転写プロファイルを重点的に解析しました。このドライバーは、後区画における特異的なサイレンシングを誘導します。

サイレンス領域は、U-A-S-G-F-P導入遺伝子の発現によって標識されます。後方コンパートメントにおいて、GGFPの発現と遺伝子xのサイレンシングという2つのイベントが誘発されます。

ステップ2は、RNA活性を抑制するための解剖フレームの処理です。フレームスライドと解剖器具をDEPC処理水で室温で1時間以上洗浄し、滅菌チャンバー内で乾燥させます。RNA活性を抑制するため、あらかじめRNaseフリーの状態にある新品の50 mlチューブにDEPC処理水を満たし、そこにピンセット、吊り下げ滴下スライド、およびペットフレームを入れます。

どちらもマイクロダイセクションに必要です。チューブを密閉し、上下に反転させた後、少なくとも1時間反応させます。室温で1時間経過後、ピンセットを用いてDEPC処理水を別のチューブに移します。

スライドが落下しないようにチューブ内で保持します。その後、チューブ内でスライドを乾燥させます。ステップ3、マイクロダイセクションのセットアップです。

まず、蛍光灯、顕微鏡、およびマイクロダイセクション用ソフトウェアなど、必要なすべての装置の電源を入れます。警告ウィンドウでレーザーの電源を入れるよう指示が表示されますので、電源を入れ、マイクロダイセクションのセットアップを完了させる間にレーザーをウォームアップさせてください。

次に、組織を回収するためのウェルを準備します。Leica LMD 6,000レーザーカット装置では、最大4本のチューブをロードして異なるサンプルを回収することが可能です。今回の目的では、2本のチューブのみを使用します。

一方はGFP陽性のサイレンシング組織を、もう一方はGFP陰性の非サイレンシング組織をマイクロピペットで回収します。RNAを保存するため、両方のチューブに20 µLのTRI reagent溶液を注入します。これでマイクロダイセクションの準備が整いました。ステップ4、3齢幼虫からの翅成像盤の手作業による摘出です。

既述の方法で得られた幼虫の後代から翅原基を単離し、他の組織が原基に混入しないように注意します。この目的を達成するためには、原基をまとめて回収する際に一般的に用いられる方法とはかなり異なる解剖アプローチが必要となります。まず、幼虫をリンゲル液で洗浄し、付着している培地を取り除きます。その後、吊り滴子スライドに転送し、口側を下に引いてすぐに頭部を切り離します。

昆虫ピンを使用して、周囲の組織を慎重に切除します。赤色の枠線で囲まれた部分が集めるべき成虫翼原基です。付着した組織を取り除き、速やかに、かつ丁寧に操作してください。単離した各翼原基は、直ちに切片を作成するため、解剖用フレームへ移します。

この手順を、 wing disc の総数が100個に達するまで繰り返します。ステップ5は、GFPで標識された wing disc の特定領域のレーザーマイクロダイセクションです。元の wing disc がメンブレン上に配置されたら、切断に進むことができます。

フレームをホルダーにセットし、ホルダーを電動ステージに固定します。LMD 6, 000を一般的な顕微鏡として使用し、元の翼盤を探します。それに焦点を合わせ、カット範囲を設定します。

ディスクの両側、つまりGFP陽性領域とそれ以外の両方に収まるように楕円形の領域を描きます。GFP陽性部分を回収したいチューブキャップを選択してください。「Start cut」ボタンを押します。

マイクロディセクターは、「move（移動）」および「cut（切断）」機能を選択して事前に設定した速度と出力で組織の切断を行います。選択しなかった組織片が脱落するまで、手動で切断を微調整することが可能です。3Dアニメーションでは、マイクロディセクターによる切断時の様子が示されており、レーザーが組織に集束し、選択した外周に沿って切断が行われる過程がわかります。

切断が完了すると、組織片が選択したチューブキャップの中に入り、そのまま tri Reagent に落ちます。最初の切断後、切断領域を翼円盤の反対側に移動させ、同等の GFP 陰性領域を切断します。新しい切断に進む前に、GFP 陽性組織と GFP 陰性組織を分けて保持するため、必ず別のチューブキャップを選択してください。

自動カット後、「スタートカット」ボタンを押します。2回目のカットを行う前に、3Dアニメーションで示されている通りに手動でカットの微調整を行ってください。電動ステージが、選択したチューブキャップをカット領域の下まで移動させます。

レーザービームを選択した外周に沿って組織に集束させ、切断が完了すると、組織片はTri試薬を含む選択したチューブキャップ内に落下します。十分な量の試料を回収するため、この手順を100個の成虫 wing disc で繰り返しました。サンプルの回収が完了したら、チューブを取り出します。

ここは、ここまでのすべての作業が無駄になりかねない非常に繊細な工程です。十分に注意してください。キャップを逆さまにして閉じ、実験を続行します。

こちらはGFP陽性組織の方です。もう一方はGFP陰性組織の方です。ステップ6、転写プロファイリングを行います。

チューブを遠心分離してキャップから液体を分離させ、TRI reagentを1 mLまで加えます。1つの領域が約5,000 µm²である100箇所の領域から、標準的なTRI reagentプロトコルに従ってRNA抽出を行います。本実験におけるRNAの収量は1.5 µgでした。

ランダムなヘキサヌクレオチドを用いたCD NAを合成するため、Vitrogenのsuperscript threeを使用します。手動での切り出しの正確性は、2つのサンプルにおけるGFP発現をR-T-P-C-Rで確認することで制御しました。定量R-T-P-C-Rを用いたゲル画像に示されている通りです。

我々は、サイレンス遺伝子Xの発現レベルを、遺伝子Xが媒介する調節経路の推定標的となる可能性のある遺伝子の発現レベルとともに評価しました。この図は、遺伝子Xとその推定標的の一つにおける発現レベルの例を示しています。未分化な翅原基の前後コンパートメントにおける基礎発現レベルに基づき、これらを遺伝子Yと呼びます。

選択した遺伝子Xの活性は、サイレンシングにより40%まで減少することが判明しました。対照的に、その推定ターゲットの一つである遺伝子Yは7倍という有意な発現上昇が認められたため、遺伝子Yが遺伝子Xによって負に制御されているという仮説が検証されました。以上のことから、上述の実験的手法は、多様な調節経路における推定ターゲットの検証に有効に適用できると結論付けられます。