示差走査熱量測定 - タンパク質抗原の熱安定性および立体配座を評価するための方法

この手順の全体的な目標は、示差走査熱量測定を使用して、工業環境におけるタンパク質の熱安定性と構造的コンフォメーションを評価することです。示差走査熱量測定は、サンプルのモル熱容量を温度の関数として測定し、タンパク質の熱安定性と構造的コンフォメーションの評価に成功しています。この比較的単純な手順は、他の生物物理学的方法の場合のように、構造的なヘリシティや固有の蛍光色素に依存しません。

この手法のもう一つの利点は、タンパク質の三次構造を安定化させる相互作用を破壊するために必要な熱転移温度とエネルギーを直接測定できることです。熱転移温度を展開のエントラルピーと組み合わせて使用すると、生物製剤の製造プロセスのロット間の一貫性を監視するための有用なパラメータとして機能します。この手法の視覚的なデモンストレーションは、新しいユーザーが重要なステップで効果的に支援するためのインタラクティブな媒体として機能します。

まず、示差走査熱量計のスイッチを入れます。次に、システムに窒素を供給します。これにより、細胞内の圧力が上昇し、サンプルの沸騰が抑制されるだけでなく、高温での気泡の形成が防止されます。

セルの構成材料に応じて、セルの損傷を避けるために、製造元の推奨圧力に従って窒素ガス供給の圧力を調整します。すべての洗浄剤リザーバーが必要な量まで満たされていることを確認します。必要な洗浄剤には、細胞を洗浄するための洗剤と、各サンプル分析後に細胞を洗浄するための水が含まれます。

サンプル保持コンパートメントの温度を適切な値、できれば摂氏5度に設定して、実験前にサンプルの完全性を維持します。サンプルをバッファーに対して平衡化して、溶液間の唯一の違いがタンパク質であることを確認することが重要です。したがって、観察された熱容量の違いは、タンパク質に正しく起因する可能性があります。

Lowry法などの適切なタンパク質濃度測定法を使用して、タンパク質サンプルの濃度を決定します。このプロトコルで使用される機器の場合、好ましい作業範囲は、1ミリリットルあたり0.5〜1ミリグラムのタンパク質です。実験の参照として使用するバッファーに対してサンプルを透析します。

サンプルと参照バッファーを真空中で脱気し、ボリュームの不正確さを引き起こす可能性のあるマイクロバブルを取り除きます。層流バイオコンテインメントキャビネットで作業し、マイクロピペットと滅菌チップを使用して、それぞれのバッファー内のサンプルをペアで96ウェルプレートにロードします。最初の2組のウェルにバッファーを充填し、バッファー-バッファースキャンを実行して、サンプル測定前に装置の適合性を確認します。

最後の2対のウェルに水を入れて、ウォータースキャンで細胞を洗浄します。次に、96ウェルプレートをシーリングフィルムで覆います。サンプルの汚染を避けるために、プレートをバイオセーフティキャビネットから取り出す前に、ウェルが適切に密閉されていることを確認してください。

最後に、プレートをサンプル保持コンパートメントに適切な向きで配置します。取得ソフトウェアを使用して、プレートがロードされた順序でサンプル情報を入力します。タンパク質濃度がある場合は入力します。

それ以外の場合は、データ解析の前に解析ソフトウェアに濃度を入力します。各サンプルスキャンの前に洗剤でセルを確実に洗浄するオプションを選択します。洗浄の後には、細胞内に洗剤の残留物が残らないように、複数の水すすぎ手順を行う必要があります。

実験の開始温度を摂氏20度に設定しますが、これはサンプルによって異なります。既知のタンパク質については、あらかじめ決められた開始温度を使用し、未知のサンプルには低い開始温度を適用することができます。次に、実験の最終温度を設定します。

最終温度は、サンプルの予備知識によっても異なる場合があります。次に、実験のスキャンレートを設定します。未知のサンプルを異なるスキャンレートでスキャンして、展開の動力学を評価することをお勧めします。

サンプルを再スキャンして熱遷移の可逆性を調べるように集録ソフトウェアを設定します。タンパク質のアンフォールディングは、2回目のスキャンで得られたエンタルピーが1回目のスキャンのエンタルピー値の80%以上であれば、可逆的であると考えられます。実験後のサーモスタットを摂氏10度に設定して、熱量計セルの完全性を維持します。

実験を実行する前に、実験設定パラメーターが正しいことを確認してください。すべてが整ったら、実験を開始します。実験後、テキストプロトコルで説明されているようにデータ解析を実行します。

解析では、ベースライン減算は手動で実行されます。このステップでの一貫性は、同等の結果を得るために重要です。ここには、バッファースキャンと水スキャンを含む実験実行の代表的な生データが示されています。

分析されているサンプルは、天然の毒素であり、解毒された状態です。サンプルスキャンは、各サンプルの融解温度とエンタルピー値を導き出すために個別に処理されます。ネイティブステートの場合、融解温度は摂氏55.55度で、毒素のエンタルピーは10の3.157倍10〜1モルあたり5カロリーです。

逆に、無害化した状態での毒素の融解温度は摂氏81.21度で、エンタルピーは10の3.656倍10〜1モルあたり5カロリーです。天然状態と無害化状態の毒素の処理済みデータの重ね合わせは、解毒されたサンプルが融解温度値に応じてその天然状態よりも熱的に安定していることを示しています。また、解毒プロセスが毒素の三次構造に構造変化をもたらすことも示しています。

この手順を試みる際には、正確な結果を得るためには細胞とシリンジの透明度が重要であるため、細胞とシリンジの相互汚染を防ぐために、洗剤と水を適切に供給することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、タンパク質の熱安定性とコンフォメーションを評価する方法としての示差走査熱量測定について十分に理解できるはずです。また、結果として生じるサーマルランから意味のある推論を行うこともできます。

この手順に続いて、展開中の二次構造の変化に関する追加の質問に答えるために、円二色性のような他の方法を実行することができます。同じ製品の一連のロットについて収集されたデータは、ワクチン製造のためのタンパク質抗原の構造構造に対するプロセスの変更、製剤、および保管条件の影響を調べるための経験的ベースラインを作成するために使用されています。