細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

このセルマイクロアレイプラットフォームの全般的な目的は、微小環境のコンテキストの関数として、細胞分化と牽引力の両方の測定値を相関させることです。この手法は、組織工学分野における重要な疑問への回答に役立ち、幹細胞生物学の基礎的な研究と分化プロトコルの最適化の両方を可能にします。この技術の主な利点には、スループットの高さ、生化学的および生物物理学的キューを変化させられる能力、そして免疫蛍光染色と牽引力顕微鏡法（TFM）の両方によるエンドポイント読み取りが挙げられます。

本手法は肝前駆細胞の分化を理解するために用いられていますが、他の動脈細胞種や組織コンテキストにも容易に適用可能です。この手法を視覚的に実演することは極めて重要です。なぜなら、実験の成功は、アレイ作成プロトコルを高品質なハイドロゲル基材および牽引力顕微鏡法（TFM）の両方と統合させることに依存するためです。TFMを用いて細胞と基材の相互作用をライブ評価するために、シラン化された35 mmガラス底ペトリ皿上に蛍光ビーズ含有ポリアクリルアミドハイドロゲルを作製するには、まずテキストプロトコルに記載されているように溶液中でガラス基材を準備します。

シラン化処理済みの35 mmガラス底ペトリ皿をガラス製乾燥トレイに配置し、各皿の中心に9対1のプレポリマービーズ・光開始剤溶液を20 µLピペッティングします。気泡が入らないように注意しながら、各皿を12 mmの円形カバーガラスでそっと覆います。蛍光ビーズをハイドロゲルの表面に分散させるため、皿を反転させ、室温で20分間放置します。

ディッシュを倒立させたまま、365ナノメートルのUVAを10分間照射します。必要に応じて重合時間を最適化してください。次に、ハイドロゲルを1モーラーのHEPES緩衝液に浸し、室温の暗所で一晩静置します。

カミソリを用いて、重合したハイドロゲルを傷つけないように注意しながら、カバーガラスを慎重に剥がします。ホットプレートを用いて50 °Cで、ハイドロゲルが乾燥するまで脱水します。ハイドロゲルは、室温・遮光条件下で3か月間保存可能です。

テキストプロトコルに従って、バイオ分子のプリント用およびソースプレート用のバッファーを調製します。テキストプロトコルに従って洗浄済みピンを装着した後、マイクロアレイ装置を準備し、メーカー提供のソフトウェアを使用してプログラムを設定します。次に、加湿装置の電源を入れます。

設定値を相対湿度65%に調整し、レオメーターの設定値に達するまで待機します。ソースプレートを適切なアダプターに設置します。次に、脱水したハイドロゲル基材を適切なアダプターに設置します。

ソースプレートのレイアウト、アレイ設計、および希望のフォーマットを正確に反映させるようにプログラムのパラメータを調整します。アレイの作製を開始します。湿度が65%相対湿度以下に低下していないか、およびピンに目詰まりがないかを、少なくとも1時間に1回は確認してください。

湿度が予期せず低下した場合は、アレイ作成を一時停止し、加湿器への給水および関連チューブ内の結露の除去を行ってください。ピンに目詰まりがある場合は、アレイ作成を一時停止してピンを洗浄するか、あらかじめ洗浄済みのピンと交換してください。プログラムが完了したら、作製したアレイをスライドボックスまたはアルミホイルで覆ったマイクロプレートに入れて保管してください。

アレイを室温、相対湿度65%で一晩放置します。我々の経験では、最も一般的な問題はアレイの作製に関連しています。蛍光標識分子、一般的なタンパク質染色、および免疫蛍光染色を用いて、作製したアレイの技術的な品質と堅牢性を確認することを推奨します。

作製翌日に、アレイ化した35 mmペトリ皿を3 mLの1% (v/v) ペニシリン-ストレプトマイシン含有PVSに浸します。アレイ化された基板にUVCを30分間照射します。その後、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を細胞培養培地に交換します。

細胞を回収し、計数した後、35 mmペトリ皿1枚あたり3 mLの割合でアレイ上に播種します。アレイ培養物を37 °C、5%CO2条件下で2時間から24時間、または細胞島が十分に形成されるまでインキュベートします。播種密度および時間は、細胞の種類や特定の用途に応じて調整可能です。

細胞アイランドの形成を待った後、あらかじめ温めておいた 3 mL の細胞培養培地でアレイ培養物を 2 回洗浄します。この時点で、適切なコントロールおよび目的の処理を生物学的システムに添加することができます。各処理の濃度を維持するため、アレイの培地を 1〜2 日ごとに交換してください。

アレイ培養の開始から1〜5日以内に、TFMを用いて細胞と基質の相互作用のライブ評価を行います。アレイ培養を含む35 mmペトリ皿を、TFM測定用のロボットステージを備えたインキュベート付き倒立蛍光顕微鏡に移動します。1つの皿において、位相差顕微鏡を用いて個々の細胞アイランドの位置と焦点面をマークします。

遠赤色蛍光顕微鏡に切り替えて、ビーズを可視化します。次に、前のステップで保存した各ポジションに戻り、焦点面のz座標を調整して、細胞アイランド直下の最初のビーズ層のみに焦点を合わせます。新しい座標を保存し、すべての細胞アイランドの自動イメージングを行い、解離前の位相差像および遠赤色蛍光像をキャプチャします。

次に、150 µLのBSA/SDS溶液をディッシュに注意深く加え、細胞が基質から完全に解離するまで5分間待ちます。細胞の解離状態を位相差顕微鏡で観察してください。細胞の島が基質から解離した後、マークした位置に戻り、ビーズの最上層が依然として焦点内にあることを確認します。

細胞が生成する牽引力による変形のためにこれらのビーズが面外に出ている場合は、再び焦点が合うように、フォーカス面のz座標を補正してください。補正したz座標を保存し、すべてのアイランドの自動イメージングを繰り返し、解離後の遠赤色蛍光画像をキャプチャします。残りのディッシュについても、これらの手順を繰り返します。

Protein A/Gを結合させたNotchリガンドであるJagged1およびDelta-like 1は、ハイドロゲル内での保持能が向上したことを示した。また、Notchリガンドの提示により、緑色の胆管細胞マーカーの存在で示されるように、肝前駆細胞から胆管細胞への分化が誘導された。5種類の細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を用いてNotchリガンドに対する応答を定量化したところ、肝前駆細胞のリガンドに対する応答はECMのコンテキストに依存することが明らかになった。

delta-like 1およびjagged 1のリガンドを欠損させた前駆細胞を作成するために、小型ヘアピンRNA（shRNA）によるノックダウンを利用しました。次に、これらの細胞にnotchリガンドであるjagged 1、delta-like 1、およびdelta-like 4を提示しました。配列化されたnotchリガンドに対する反応は、細胞内で発現しているリガンドの種類によって異なりました。

これらの画像は、肝前駆細胞の分化が基質の剛性とECM組成の両方に依存していることを示しています。定量分析により、コラーゲンIVは軟らかい基質と硬い基質の両方で分化を促進する一方で、フィブロネクチンは硬い基質においてのみ分化を促進することが明らかになりました。代表的なヒートマップは、コラーゲンIV上の低基質剛性において持続的な牽引ストレスがかかることで、胆管細胞への分化が促進されることを示唆しています。

この知見は、牽引ストレスの平均二乗平均平方根値を定量化することで確認されました。本ビデオと付属のプロトコルでは、ハイドロゲルおよびアレイの作製、アレイ基板上での細胞培養、および牽引力顕微鏡法を用いた細胞と基板の相互作用の測定に関する主要な手順を解説しました。これらの技術に習熟すれば、適切に実施することで、各実験を最短1〜2週間で完了させることが可能です。

本手法を併用し、定量的PCR、免疫ブロッティング、標準的なスケールのメカノバイオロジー軸、またはその他の補完的な分子生物学的手法を用いて、スコアの高いアレイ条件を細胞培養で検証する必要があります。この汎用性の高いプラットフォームは、幹細胞分化やがん細胞生物学を含む、幅広い細胞および組織のコンテキストにおける細胞機能の高スループット研究に適用可能です。