Name: 細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学ぶ細胞分化とトラクション軍の相関分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム。ポリアクリルアミドヒドロゲルと蛍光ビーズを用いて、幹細胞生物学と組織工学の研究に応用可能です。

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私たちは認めるオースティンCyphersmithとMayandi Sivaguru（ゲノム生物学のためのカール・R. Woese研究所、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校）顕微鏡の支援のためと寛大顕微鏡コアで画面とビデオキャプチャを収容します。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

我々の実験では、我々は、最も一般的な障害が作製アレイの品質に関連し、不十分な目的の生物学的システムにおける応答を特徴としていることを発見しました。我々は、細胞マイクロアレイ実験における共通の故障モードと関連するトラブルシューティングの手順については、 表1にリーダーを参照してください。特定の配列の品質に関しては、我々は次のことをお勧めします。そのようなローダミン結合デキストランなどの蛍光標識分子を使用して配列するプログラム、パラメータ、およびバッファの技術的品質と堅牢性を確認してください。前またはさらに視覚的に製造業者の指示に従って並べ及び後のいずれかに徹底的にきれいなピンは、ピンチャネルは、光学顕微鏡を用いて、デブリの明確であることを確認してください。一般的なタンパク質の汚れや免疫標識を使用して配列された生体分子の保持を確認してください。 70kDaの以下の分子量を有する生体分子が頻繁にヒドロゲル23に保持されていないことに注意してください、 </<html> SUP&gt; 31。複数の細胞型を使用して配列された生体分子の細胞機能を検証します。唯一の接着細胞をアレイと互換性があることに注意してください。さらに、アレイへの接着は、細胞特異的な特性（ 例えば 、インテグリン発現プロファイル）と選択されたECMタンパク質の両方に依存しています。 スペースに限りがあるため、ここではアレイ設計、レイアウト、および製造の大規模な治療を提供していないと、以前の作品23、25を読者に参照してください。私たちは、一般的に10から20のユニークな生体分子の条件（ すなわち 、5月10日のスポット/条件）からなる100スポットサブアレイ（150μmのスポット径、450μmの中心間距離）を使用します。 1アレイ内のサブアレイの数が快適に1 25×75mmの顕微鏡スライド上に1280にスケールアップすることができ、目的の生体分子条件の数に応じて変化する（〜64サブアレイで6400スポット）上記外部参照&quot;&gt; 25、31のパラメータは、さらに関心のパターンサイズによって異なります。75からパターンを生成することが可能なピン- 450μmのは、容易に入手可能です。 アレイ実験は、最高の他の培養フォーマット、アッセイの読み出し、および生物学的モデル系を使用して、関心の高スコア配列条件の検証によって補完されます。具体的には、我々はさらに、標準的な分子生物学的技術（ 例えば 、定量RT-PCR、免疫ブロット法）、または標準のTFMと一緒にバルク培養を用いて、選択配列された条件の影響を検証することをお勧めします。適切な生物学的モデル系における関心の因子の遺伝子操作（ 例えば 、ノックダウンまたは過剰発現）は、アレイ内の観察された効果を確認するために役立つことができます。 インビボでの動物モデルは、検証の別の手段を表しており、最近でガレクチン-3およびガレクチン8の中心的な役割を確認するために、例えば、使用されました肺がん転移性ニッチは、として最初に細胞マイクロアレイ31、49を介して同定しました。 他の多くの方法は、二次元の微細加工システム18、50、51、52、53、54、55及び三次元操作生体材料システム56、57、58の種々含む、細胞機能の微小環境調節を調べるために使用されています、59、60、61。他の方法と比較して、ここに記載した細胞マイクロアレイプラットフォームの特定の利点は、で構成されています：（1）最大スループット交互作用効果の解析を可能にする要因の異なる組み合わせの数百または数千。 （2）アクセス可能な、自動化されたイメージングと分析。 （3）配列の要素の制御されたプレゼンテーションで両方の生化学的および生物物理学的読み出しの統合。 （4）基板材料の特性を変化させる能力;細胞の運命および機能の（5）の高含有量の単一細胞分析。 要約すると、調整可能な基板の剛性の基板上にTFMを用いた細胞マイクロアレイの組み合わせは、両方の生化学的および生物物理学的な手がかりの徹底的な特性評価を可能にします。ここに示されるように、このプラットフォームは、一般化され、容易に細胞分化及びメカノの組み合わせ微小環境調節の改善された理解に向けて接着細胞タイプおよび組織の様々な状況に適用することができます。

細胞および周囲の微小環境因子間の相互作用は、開発、恒常性、および疾患の病因1、2、3、4を通して生物学的プロセスの多種多様を媒介します。これらの微小環境との相互作用は、リガンド - 受容体結合を介して、細胞に細胞 - マトリックス結合、および細胞 - 細胞相互作用の可溶性因子の送達を含みます。上記生化学的考察に加えて、基板の機械的特性などの生物物理学的パラメータは、（ 例えば 、ヤング率、気孔率）と細胞の形状、及び関連する下流のメカノは、ますます、細胞分化5、6、7、8の重要なメディエーターとして認識を得ています9 <sup&gt; 10。これらの微小環境の相互作用から生じるシグナルは、遺伝子ネットワークとシグナル伝達経路への入力として機能します。また、これらの細胞固有のコンポーネントは、細胞固有の遺伝的プログラムとの間の複合体の共調節ループを完了し、分泌因子およびマトリックス分解酵素を介して微小環境にフィードバックを提供し、細胞外因性微小環境は5、11、12因子 。 微小環境因子の制御された提示のための操作システムの使用は、異なるコンテキスト13、14、15の範囲内で有用であることが証明されています。特に微細加工システムは、小型化13を介してタンパク質や細胞ならびに高度に並列化された分析の正確な空間的パターン形成を容易にしました<supクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 16、17、18、19、20、21、22。細胞マイクロアレイは、生体分子の組み合わせが接触印刷弾性ポリアクリルアミドヒドロゲル基板23、24、25にしたもので、このような微細加工システムを表します。細胞接着性の成分（すなわちマトリックスタンパク質）を含むことはしばしば免疫細胞化学および蛍光レポーターを経て下流の分析が続いているマイクロアレイ、上の持続的な細胞接着や文化を可能にします。細胞マイクロアレイを生産肝細胞表現型23、26、神経前駆体の分化27、mammarの改善された理解を得るに向けられていますY前駆細胞の運命の決定28、胚性幹細胞の維持/分化23、29、30、肺癌転移31、及びメラノーマ32で治療反応。我々は最近、内胚葉仕様33、肝前駆細胞の分化34、35、及び肺腫瘍細胞の薬物応答36における細胞外マトリックス（ECM）タンパク質組成物の役割を定義するための細胞マイクロアレイの使用を実証しました。これらの作品では、我々は、アレイプラットフォームの組み合わせの機能を拡張し、細胞外マトリックス組成物および生体力学と細胞固有のシグナル伝達の交差点を探索に焦点を当てています。加えて、我々は定量的にCHARACする能力を提供するために、この配列のプラットフォームでは生物物理学的読み出しを実装しています分化における細胞収縮性のterize役割は、35を処理します。そうするために、我々は、細胞生成トラクションの高スループットの評価を可能にするために、細胞マイクロアレイと牽引力顕微鏡（TFM）を統合しました。 TFMは、細胞が生成した牽引力を測定するために広く利用方法であり、組成物および局所微小環境37、38、39、40のバイオメカニクスを備えた単一細胞および組織レベルの機能の調整に関する重要な洞察を提供しています。したがって、細胞マイクロアレイとTFMを組み合わせてキー、生理学的に関連する生物物理学的パラメータを測定するためのハイスループットシステムを提供します。 ポリアクリルアミド基板の製作、アレイの製造、細胞培養およびアッセイの読み出し、およびデータの分析：ここで説明した細胞マイクロアレイプラットフォームは、4つのセクションで構成されています。見る最初の3つの実験のセクションの概略概要については、図1。免疫蛍光データの分析に焦点を当てた最後のセクションの概略概要については、 図2を参照してください。生体力学的な細胞-基質相互作用の研究に細胞マイクロアレイプラットフォームを適合させるために、我々は、ウェンらごとに、調整可能なヤング率が、同様の多孔性のポリアクリルアミド基材を使用しました。 41。その基板上の細胞によって及ぼされる力のTFMの測定を可能にするため、私たちはしばしば、他のグループにより利用用スライド厚いガラス顕微鏡に加えて、ガラスボトムシャーレフォーマットを実装しました。従って、この細胞マイクロアレイプラットフォームは、別個のガラスボトムディッシュにTFMを介して顕微鏡スライドおよび細胞発生力の免疫蛍光を介した細胞分化の並列測定が可能です。我々はまた、一般的に、細胞マイクロアレイで使用される分析手法にいくつかの改良を適用しています。 SpecificalLY、代わりに全体的な島強度のパラメトリックZスコアの、我々は、単一セルの強度を測定し、非正規分布を考慮し、より正確な細胞挙動を説明するために、分位正規化を適用します。私たちは、これらの改善は、生化学的および生物物理学的両方の手がかりが重要で、交差する役割を果たしている生物学的プロセスの研究に向けて、特定のユーティリティを提供すると信じています。さらに、我々の分析の改善は、単一細胞および集団レベルの動作が発散するために細胞機能の範囲の研究と細胞マイクロアレイの適用を可能にします。

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;mシリンジフィルター</td><td>ポールコーポレーション</td><td>4433</td><td>適切なサイズのルアーロックプラスチックシリンジと合わせます。</td></tr><tr><td>100 &times; ペニシリン&ndash;ストレプトマイシン溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 60 mm カバーグラス</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート (3-TPM)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>440159</td><td>製造元の指示に従って不活性ガスで保管してください。3-TPMを空気にさらすと、ガラス基板のシラン化が損なわれる可能性があります。注意: 3-TPMは可燃性の液体です。熱、火花、裸火、高温の表面から遠ざけ、化学薬品のドラフトでのみ使用してください。</td></tr><tr><td>3-[(3-チョルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸水和物(CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mmガラス底ペトリ皿</td><td>セルE&G</td><td>GBD00002-200</td><td>#1.5カバーガラスからなる13mmウェル。TFMおよび生細胞イメージングを可能にします。</td></tr><tr><td>384ウェルポリプロピレンV底マイクロプレート、非滅菌</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルポリスチレンマイクロプレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35mmガラス底ペトリ皿はマイクロプレートのウェルに収まり、アレイの作製を容易にします。</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>注意:アクリルアミドへの曝露は、急性毒性および刺激を引き起こす可能性があります。保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>コラーゲンI、ラットテール</td><td>EMDミリポア</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIII、ヒト</td><td>EMDミリポア</td><td>CC054</td><td></td></tr>コラーゲン<tr><td>IV、ヒト</td><td>EMDミリポア</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>架橋剤、365nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr>デ<tr><td>キストラン、ローダミンB-コンジュゲート、70kDa</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1841</td>アレイ<td>位置のマーカーとして使用されます。</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>デコン ラボ</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-組換え DLL1, マウス</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc組換えDLL4、マウス</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc組換えJAG1、ラット</td><td>R&D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン、ヒト</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡、倒立</td><td>型 Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>顕微鏡には、自動蛍光イメージングとTFMの両方に対応するロボットステージが装備されています。環境制御(すなわち.、37°;Cおよび5% CO2)は、TFMに強くお勧めします。</td></tr><tr><td>フルオロマウントG with DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>注意: 酢酸は可燃性で腐食性があります。保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, mouse</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Microarray scanner</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Fluorophoresは、Cy3またはCy5に適合している必要があります。</td></tr><tr><td>マイクロアレイ</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid マイクロ</td><td>同等またはそれ以上の能力を持つ他のマイクロアレイは、容易に代用することができます。</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、25 &times; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0.9 &ndash; 厚さ 1.1 mm。</td></tr><tr><td>N,N&prime;-メチレンビスアクリルアミド(ビスアクリルアミド)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>注意:アクリルアミドへの曝露は、急性毒性および刺激を引き起こす可能性があります。保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)、16% v/v</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>RT15710</td><td>最適な固定のためにPFAを新鮮に調製します(保存しないでください)。注意:PFAへの曝露は急性毒性を引き起こす可能性があり、接触すると皮膚を刺激したり腐食させたりする可能性もあります。保護手袋、衣服、目の保護具を着用し、化学薬品のドラフトでのみ使用してください。</td></tr><tr><td>プロテインA/G、組換え</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>パイレックス乾燥トレイ、2,000&nbsp;mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>長方形4チャンバー培養ディッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>アレイ顕微鏡スライドでの細胞培養用。</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>注意:NaOHは腐食性が高く、重度の皮膚や目の損傷を引き起こす可能性があります。保護手袋、衣服、目の保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>アレイ用のステルスピン</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>各アレイの実行後に、製造元の指示に従ってピンをクリーニングします。150ミクロンのドメインを生成します。他のピンサイズ(75&ndash;450ミクロン)をお客様の特定のアプリケーションに適しています。</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

弾性ヒドロゲル表面上の生体分子の接触印刷の組み合わせから成る微細加工細胞マイクロアレイは、細胞分化に配列された生化学的シグナルの影響を測定するために厳密に制御され、高スループット操作システムを提供します。細胞マイクロアレイを用いた最近の努力は、多くの微小環境因子が並列に提示されるコンビナトリアル研究のためのそれらの有用性を実証しました。しかし、これらの努力は、主に細胞応答に対する生化学的手がかりの効果を調査に焦点を当てています。ここでは、牽引力顕微鏡により免疫蛍光および生体力学的細胞 - 基質相互作用の両方によって、細胞分化を評価するための調節可能な材料特性を有する細胞のマイクロアレイプラットフォームを提示します。そうするために、我々は、いずれかの顕微鏡スライドまたはガラス底ペトリ皿上に作製ヤング率を変化させるのポリアクリルアミドハイドロゲルを用いた二つの異なるフォーマットを開発しました。我々は、BESを提供しますこれらのヒドロゲル基板上のマイクロアレイの製造、マイクロアレイ上の後、細胞培養物、およびデータの取得のためのトンのプラクティスとトラブルシューティング。このプラットフォームは、手がかりの役割が交差する、重要な果たし得るための生化学的（ 例えば 、細胞外マトリックス組成物）および生物物理学的両方の生物学的プロセスの研究に使用するために適している（ 例えば 、基板の剛性）。

このプラットフォームを使用して、我々は肝前駆細胞34、35の運命仕様の両方の生化学的および生物物理学的手がかりの役割を調べました。プロテインA / G-共役Notchリガンドは、ポリアクリルアミドハイドロゲル（ 図3A）に改善された保持およびクラスタリングを示し、胆管細胞の運命（ 図3B）に向けて、肝前駆細胞の分化を駆動する、さらに可能でした。単一細胞分析を使用して、我々は、リガンドの肝前駆細胞の応答は、にも依存することを見出し、ECMタンパク質コラーゲンI、コラーゲンIII、コラーゲンIV、フィブロネクチン、およびラミニン（ 図3C）のためのNotchリガンドに対する応答を定量化ECMコンテキスト。最後に、我々はリガンドDLL1とJAG1ずに肝前駆細胞を生成するためのshRNAノックダウンを利用しました。配列Notchリガンドへの応答は、PRに依存して変化しいずれかのリガンドのesenceは、細胞外因性リガンドに対する応答がセル固有のリガンドの発現（ 図3D）の関数でもあることが確認されました。さらに、我々はDLL1ノックダウン中の二重陽性（ALB + / OPN +）細胞（ 図3D）の別個の亜集団を観察しました。一緒に、これらの代表的な結果は：（1）個々のリガンドのノックダウンで複数配列されたECMタンパク質およびNotchリガンドのペアリングにより例示されるように配列形式の組合せ能力; （2）だけでなく、の機能は、ECMタンパク質の配列だけでなく、プロテインA / G媒介結合を介して細胞 - 細胞リガンド配列します。 （3）我々の単一細胞解析および固有の亜集団を識別する能力の実現。 我々はまた、肝臓の前駆細胞の分化は、基板の剛性とECM組成物（ 図4Aの両方に依存することが観察され</str<html>オング&gt;）、特にフィブロネクチンだけ硬い基板（ 図4B）の分化をサポートしながら、コラーゲンIVは両方のソフトと硬い基板上の分化を支持していることを発見。 TFM測定の代表的なヒートマップは、コラーゲンIV上の低い基板剛性での持続的な牽引応力が胆管細胞（ 図4C）、平均二乗平均平方根値（ 図4D）によって確認所見への分化を促進することを示唆しました。一緒に、これらの代表的な結果は：（1）調整可能な剛性を有する基板上の細胞マイクロアレイとTFM統合の成功は、細胞の表現型とトラクションストレスの両方を評価すること; （2）マトリックス組成物と基板の剛性の両方と肝前駆細胞の運命を調整します。 （3）当TFM分析および細胞マイクロアレイにおける典型的な牽引応力プロファイルの実装。 電子1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：最初の3実験のセクションを表示概要回路図。第1に、ガラス基板を洗浄し、ポリアクリルアミドハイドロゲルの製造を容易にするために、シラン化されています。第2節では、関心対象の生体分子の組み合わせは、384ウェル源マイクロプレート中で調製されます。ロボットアレイヤーその後、ヒドロゲル上のアレイを製造する、きれいなピン、供給源マイクロプレート、およびポリアクリルアミドハイドロゲルでロードされ、初期化されます。第3節では、細胞は、関心の培養プロトコルが行われた後、配列されたドメイン上に播種し、付着させます。エンドポイントで、細胞は、いずれのTFMを用いて免疫細胞化学/免疫蛍光のために固定または分析されます。スケールバーは75μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ページ内= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> 図2：処理と配列からの免疫蛍光データの解析。 （A）タイルは、複合材料の32ビットRGB画像はまずビニング及び個々 8ビットのチャネルに分割されます。配列された蛍光マーカーと細胞の島々の組み合わせを使用して、配列の3コーナーが自動化された向きと配列のグリッド化を可能にするために識別されます。 （B）単セルのデータが入力配列の各チャネルのために生成されます。実験的ドリフトを考慮するために、変位値正規化は、全ての反復にまたがる単一の共有分布を生成する、生物学的複製によって適用されます。分位正規化されたデータは、その後プロットと解釈アンサンブル測定の計算を介して（ 例えば 、細胞/島、強度を意味し、ラベルの割合の細胞が陽性）または単一細胞分布の直接分析されます。メートル/ファイル/ ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> 図3：ノッチリガンドプレゼンテーションを媒介する肝臓前駆分化。プロテインA / Gで配列するとき（A）のFc-組換えNotchリガンドのJagged-1（JAG1）とデルタ様1（DLL1）を向上させる保持およびクラスタリングを示しました。スケールバーは50μmです。 （B）肝前駆細胞は、Notchリガンドとプレゼンテーションの際に胆管細胞に分化しました。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）は核標識である、アルブミン（ALB）は、肝細胞マーカーであり、オステオポンチン（OPN）は、胆管細胞マーカーです。スケールバーは150μmです。 （C）ECMタンパク質コラーゲン上のNotchリガンドJAG1、DLL1ためのOPNのための陽性細胞の割合の定量化、およびデルタ様4（DLL4）私は、Collagen III、コラーゲンIV、フィブロネクチン、およびラミニン。 スチューデントt -testsはP &lt;0.05（*）に対して示さP値を有する各ECMタンパク質内の各アレイNotchリガンドのためのコントロールIgGに対して行いました。 （D）NotchリガンドJAG1、DLL1、およびDLL4を提示コラーゲンIII上の細胞のためのALBとOPNのイメージングサイトメトリー。ノッチなしの肝前駆細胞は、DLL1とJAG1（ すなわち 、shDll1とshJag1が）のshRNAノックダウンを使用して生成されたリガンド。この図は、Kaylan らから変更されている平均値±SEMとして（C）内のデータが提示しました。 34。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> 図4：マトリックス組成物と基板剛性クー肝前駆分化をrdinate。胆管細胞への（A）肝前駆細胞の分化は、ECM組成物及び基板の剛性の両方に依存します。 DAPIは核標識である、ALB、肝細胞マーカーであり、OPNは、胆管細胞マーカーです。 （B）のヤング率の基板30キロパスカル、13キロパスカル、コラーゲン4 kPaのI（C1）、コラーゲンIV（C4）、フィブロネクチン（FN）、およびすべての双方向の組み合わせでOPNについて陽性の細胞の割合の定量化これらのECMタンパク質。 （C）細胞牽引応力は、基板の剛性とECM組成の両方に依存します。 （D）ヤング率の基板30キロパスカルとコラーゲンのための4 kPaのI（C1）、コラーゲンIV（C4）、フィブロネクチン（FN）、およびそれらのすべての双方向の組み合わせに牽引ストレスの二乗平均平方根値の定量ECMタンパク質。 （B）及び（D）において、データは、SEM及びスチューデントt -tests±平均値として表しました30 Pのために示されたP値と各ECMの組み合わせのkPaの&lt;0.05（*）、P &lt;0.01（**）、およびP &lt;0.001（***）に対して行いました。スケールバーは50μmです。この図は、Kourouklis らから変更されています。 35。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> セクション </td><td fo:width="1.5in"> 問題 </td><td fo:width="1.5in"> 潜在的な原因 </td><td> 溶液 </td></tr><tr><td rowspan="3">ポリアクリルアミド基板の1製作。 </td><td>カバーガラスは、ヒドロゲルから削除することはできません。 </td><td> Overpolymerization。 </td><td> &lt;10分（4 W / m 2）とに重合時間を短縮します。その紫外線crossliをチェックnker出力は、予想の範囲内です。 </td></tr><tr><td>悪いポリアクリルアミドヒドロゲル重合。 </td><td> Underpolymerization。 </td><td> 10分（4 W / m 2）と&gt;に重合時間を増やします。 UVクロスリンカー出力が期待される範囲内であることを確認してください。 </td></tr><tr><td>ポリアクリルアミドヒドロゲルは、カバーガラスを除去した後に破損しています。 </td><td>柔らかいポリアクリルアミドヒドロゲルは損傷しやすいです。 </td><td>私たちは、特に柔らかい（ すなわち 、4キロパスカル）のヒドロゲルのためのハイドロゲルの製造収率（〜50％）の減少を観察します。優しくヒドロゲルを処理し、目的の収量を達成するための出発数を増やします。 </td></tr><tr><td rowspan="2">配列の2製作。 </td><td rowspan="2">悪いまたは一貫性のないスポット形態。 </td><td>一貫性のない加湿機能。 </td><td>その加湿器をチェックして、各プリントラン全体の機能をレオメーター、65％RHを維持します。 </td></tr><tr><td>プリントヘッドまたは詰まりで立ち往生ピンGED。 </td><td>無料のピンの動きを可能にするためにプリントヘッドを清掃してください。ピンチャネルから凝集物を除去するために徹底的に各プリントランの前または後にクリーンピン。 </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3.細胞培養およびアッセイの実行。 </td><td rowspan="2">最初の取り付け後のアレイ上での細胞の剥離や死。 </td><td> Overseedingおよび過剰増殖。 </td><td>最初の播種密度と時間を削減します。細胞増殖を低減するために、アレイの培養中に「保守」または「分化」メディアを使用します。 </td></tr><tr><td>ヒドロゲルからの有毒なアクリルアミドモノマーのリリース。 </td><td>アクリルアミドモノマーの拡散/放出を可能にし、細胞毒性を低減するために、少なくとも3日間のdH 2 Oにヒドロゲルを浸します。 </td></tr><tr><td rowspan="4">細胞は、アレイに接続しないでください。 </td><td> Underseeding。 </td><td>最初の播種密度と時間を増やします。より強力な接着性の細胞型を使用します。 </td></tr><tr><td>の悪い堆積マトリックスまたは生体分子の状態。 </td><td>粒子および凝集体のきれいなピンは、印刷パラメータを確認し、蛍光マーカー、 例えば 、ローダミン結合デキストランのスポッティングを評価します。 </td></tr><tr><td>細胞 - マトリックス相互作用の特異性。 </td><td>異なる細胞型は、いくつかのではなく、他のECMタンパク質に特異的に付着します。あなたの細胞に複数の異なるECMタンパク質をテストします。 </td></tr><tr><td>製造後の次善のアレイストレージ。 </td><td>我々は、凍結中に相変化を回避するために、部分的には、65％RH、室温で一晩作製アレイを記憶するお勧めします。細胞接着は、湿度、温度、および貯蔵時間の両方に敏感です。これらのパラメータは、あなたの実験のために最適化された/一致していることを確認してください。 </td></tr><tr><td rowspan="2">細胞培養中のガラス基板からのヒドロゲルの剥離。 </td><td>スライドクリーニングとシラン化が悪いです。 </td><td>スライドの洗浄のために働いてソリューションを交換して、シラン化。 </td></tr><tr><td> Overdehydratedヒドロゲル。 </td><td> 15〜30分間よりも長い間、ホットプレート上で脱水ヒドロゲルを放置しないでください。 </td></tr><tr><td>データの4.分析。 </td><td>複製スポットとスライド間の高い変動。 </td><td>アレイ製造の変動。 </td><td>ピンとプリントヘッドが汚れていないことを確認してください。加湿器の機能を確認してください。視覚化し、蛍光マーカーを使用してスポットと配列品質を定量化します。上記の推奨のように配列を格納。 </td></tr></tbody></table> 表1：トラブルシューティング。

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

このセルマイクロアレイプラットフォームの全般的な目的は、微小環境のコンテキストの関数として、細胞分化と牽引力の両方の測定値を相関させることです。この手法は、組織工学分野における重要な疑問への回答に役立ち、幹細胞生物学の基礎的な研究と分化プロトコルの最適化の両方を可能にします。この技術の主な利点には、スループットの高さ、生化学的および生物物理学的キューを変化させられる能力、そして免疫蛍光染色と牽引力顕微鏡法（TFM）の両方によるエンドポイント読み取りが挙げられます。本手法は肝前駆細胞の分化を理解するために用いられていますが、他の動脈細胞種や組織コンテキストにも容易に適用可能です。この手法を視覚的に実演することは極めて重要です。なぜなら、実験の成功は、アレイ作成プロトコルを高品質なハイドロゲル基材および牽引力顕微鏡法（TFM）の両方と統合させることに依存するためです。TFMを用いて細胞と基材の相互作用をライブ評価するために、シラン化された35 mmガラス底ペトリ皿上に蛍光ビーズ含有ポリアクリルアミドハイドロゲルを作製するには、まずテキストプロトコルに記載されているように溶液中でガラス基材を準備します。シラン化処理済みの35 mmガラス底ペトリ皿をガラス製乾燥トレイに配置し、各皿の中心に9対1のプレポリマービーズ・光開始剤溶液を20 µLピペッティングします。気泡が入らないように注意しながら、各皿を12 mmの円形カバーガラスでそっと覆います。蛍光ビーズをハイドロゲルの表面に分散させるため、皿を反転させ、室温で20分間放置します。ディッシュを倒立させたまま、365ナノメートルのUVAを10分間照射します。必要に応じて重合時間を最適化してください。次に、ハイドロゲルを1モーラーのHEPES緩衝液に浸し、室温の暗所で一晩静置します。カミソリを用いて、重合したハイドロゲルを傷つけないように注意しながら、カバーガラスを慎重に剥がします。ホットプレートを用いて50 °Cで、ハイドロゲルが乾燥するまで脱水します。ハイドロゲルは、室温・遮光条件下で3か月間保存可能です。テキストプロトコルに従って、バイオ分子のプリント用およびソースプレート用のバッファーを調製します。テキストプロトコルに従って洗浄済みピンを装着した後、マイクロアレイ装置を準備し、メーカー提供のソフトウェアを使用してプログラムを設定します。次に、加湿装置の電源を入れます。設定値を相対湿度65%に調整し、レオメーターの設定値に達するまで待機します。ソースプレートを適切なアダプターに設置します。次に、脱水したハイドロゲル基材を適切なアダプターに設置します。ソースプレートのレイアウト、アレイ設計、および希望のフォーマットを正確に反映させるようにプログラムのパラメータを調整します。アレイの作製を開始します。湿度が65%相対湿度以下に低下していないか、およびピンに目詰まりがないかを、少なくとも1時間に1回は確認してください。湿度が予期せず低下した場合は、アレイ作成を一時停止し、加湿器への給水および関連チューブ内の結露の除去を行ってください。ピンに目詰まりがある場合は、アレイ作成を一時停止してピンを洗浄するか、あらかじめ洗浄済みのピンと交換してください。プログラムが完了したら、作製したアレイをスライドボックスまたはアルミホイルで覆ったマイクロプレートに入れて保管してください。アレイを室温、相対湿度65%で一晩放置します。我々の経験では、最も一般的な問題はアレイの作製に関連しています。蛍光標識分子、一般的なタンパク質染色、および免疫蛍光染色を用いて、作製したアレイの技術的な品質と堅牢性を確認することを推奨します。作製翌日に、アレイ化した35 mmペトリ皿を3 mLの1% (v/v) ペニシリン-ストレプトマイシン含有PVSに浸します。アレイ化された基板にUVCを30分間照射します。その後、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を細胞培養培地に交換します。細胞を回収し、計数した後、35 mmペトリ皿1枚あたり3 mLの割合でアレイ上に播種します。アレイ培養物を37 °C、5%CO2条件下で2時間から24時間、または細胞島が十分に形成されるまでインキュベートします。播種密度および時間は、細胞の種類や特定の用途に応じて調整可能です。細胞アイランドの形成を待った後、あらかじめ温めておいた 3 mL の細胞培養培地でアレイ培養物を 2 回洗浄します。この時点で、適切なコントロールおよび目的の処理を生物学的システムに添加することができます。各処理の濃度を維持するため、アレイの培地を 1〜2 日ごとに交換してください。アレイ培養の開始から1〜5日以内に、TFMを用いて細胞と基質の相互作用のライブ評価を行います。アレイ培養を含む35 mmペトリ皿を、TFM測定用のロボットステージを備えたインキュベート付き倒立蛍光顕微鏡に移動します。1つの皿において、位相差顕微鏡を用いて個々の細胞アイランドの位置と焦点面をマークします。遠赤色蛍光顕微鏡に切り替えて、ビーズを可視化します。次に、前のステップで保存した各ポジションに戻り、焦点面のz座標を調整して、細胞アイランド直下の最初のビーズ層のみに焦点を合わせます。新しい座標を保存し、すべての細胞アイランドの自動イメージングを行い、解離前の位相差像および遠赤色蛍光像をキャプチャします。次に、150 µLのBSA/SDS溶液をディッシュに注意深く加え、細胞が基質から完全に解離するまで5分間待ちます。細胞の解離状態を位相差顕微鏡で観察してください。細胞の島が基質から解離した後、マークした位置に戻り、ビーズの最上層が依然として焦点内にあることを確認します。細胞が生成する牽引力による変形のためにこれらのビーズが面外に出ている場合は、再び焦点が合うように、フォーカス面のz座標を補正してください。補正したz座標を保存し、すべてのアイランドの自動イメージングを繰り返し、解離後の遠赤色蛍光画像をキャプチャします。残りのディッシュについても、これらの手順を繰り返します。Protein A/Gを結合させたNotchリガンドであるJagged1およびDelta-like 1は、ハイドロゲル内での保持能が向上したことを示した。また、Notchリガンドの提示により、緑色の胆管細胞マーカーの存在で示されるように、肝前駆細胞から胆管細胞への分化が誘導された。5種類の細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を用いてNotchリガンドに対する応答を定量化したところ、肝前駆細胞のリガンドに対する応答はECMのコンテキストに依存することが明らかになった。delta-like 1およびjagged 1のリガンドを欠損させた前駆細胞を作成するために、小型ヘアピンRNA（shRNA）によるノックダウンを利用しました。次に、これらの細胞にnotchリガンドであるjagged 1、delta-like 1、およびdelta-like 4を提示しました。配列化されたnotchリガンドに対する反応は、細胞内で発現しているリガンドの種類によって異なりました。これらの画像は、肝前駆細胞の分化が基質の剛性とECM組成の両方に依存していることを示しています。定量分析により、コラーゲンIVは軟らかい基質と硬い基質の両方で分化を促進する一方で、フィブロネクチンは硬い基質においてのみ分化を促進することが明らかになりました。代表的なヒートマップは、コラーゲンIV上の低基質剛性において持続的な牽引ストレスがかかることで、胆管細胞への分化が促進されることを示唆しています。この知見は、牽引ストレスの平均二乗平均平方根値を定量化することで確認されました。本ビデオと付属のプロトコルでは、ハイドロゲルおよびアレイの作製、アレイ基板上での細胞培養、および牽引力顕微鏡法を用いた細胞と基板の相互作用の測定に関する主要な手順を解説しました。これらの技術に習熟すれば、適切に実施することで、各実験を最短1〜2週間で完了させることが可能です。本手法を併用し、定量的PCR、免疫ブロッティング、標準的なスケールのメカノバイオロジー軸、またはその他の補完的な分子生物学的手法を用いて、スコアの高いアレイ条件を細胞培養で検証する必要があります。この汎用性の高いプラットフォームは、幹細胞分化やがん細胞生物学を含む、幅広い細胞および組織のコンテキストにおける細胞機能の高スループット研究に適用可能です。

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