Name: マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 学ぶ マイクロスケール細胞刺激のための半自動マイクロ流体プラットフォームを用いた細胞培養と刺激の方法。少量の細胞と試薬を使用し、細胞溶解物を回収して分子解析を行う技術です。

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著者はDMFデバイスおよびDMFハブの設計と開発への貢献のためにロナルドF.レンツィとマイケルS. BARTSCHに感謝します。この研究は完全にサンディア国立研究所で研究所監督研究開発プログラムによってサポートされていました。サンディア国立研究所は、契約DE-AC04-94AL85000下エネルギー省の国家核安全保障管理局の米国商務省のためサンディア社、ロッキード·マーティン社の完全子会社が管理·運営、マルチプログラム研究室です。

この一般的なプロトコルは、研究の多種多様なプラットフォームのアプリケーションをサポートするように設計されているが、この報告書に記載の代表研究に固有の側面は括弧内に分離されている図2プロトコルを使用して行う代表的な研究を示しています。プロトコルでは、すべての &quot;指示する&quot;コマンドはあらかじめ決められたスクリプトの使用を介して自動化されていることに注意してください。ステップ2、ステップ1（ステップ1.7と1.8の間に、例えば ）と並行して行うことができることにも注意して、そのステップ2.1は、多くの場合、バイパスされ（パターン化/コーティングされたDMFデバイスプレートを洗浄して再使用することができるので、ステップ5.2を参照のこと） 。 1。細胞灌流チェンバースを組み立て、移入<ol><li>コー​​ト滅菌（オートクレーブ）マイクロキャピラリー（フューズドシリカ長さ15cm;; 679μmの外径、534μmの番号）の内面無菌フィブロネクチン溶液（50μgの/ mlの30μlの）を描画するためにシリンジポンプを指示することによってフィブロネクチンと、それぞれに解決策を撤回するシリンジポンプを指示すると、マイクロキャピラリー乾燥（6時間室温（RT）を）せ、（37℃2℃時間）インキュベートし、マイクロキャピラリー。 </li><li> CapTite継手（6灌流チャンバー、8ポートシリンジポンプ）を使用して、ポリカーボネートの管（500μmの外径、100μmのID）とマルチポートシリンジポンプにチューブに各フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（灌流チャンバー）を接続します。 </li><li>テープを用いて、所望の温度（37℃）に設定したヒートブロックに各灌流チャンバーの本体を固定する。 </li><li>新鮮な増殖培地（RPMI-1640、10％FBS、500単位/ mlペニシリン、500μgの中に懸濁させ、リザーバ内の灌流チャンバーの開放端（microcentifugeチューブまたはマイクロタイタープレートウェル）を含有する細胞（P388D.1マウスマクロファージ）浸し/所望の濃度（10 6細胞/ ml）でのストレプトマイシン）。 </li><li>十分な愛が続く各灌流チャンバーに細胞（10μlを、10 4細胞）を描画するためにシリンジポンプを指示ヒートブロックに固定部分に液体プラグ（約4.5センチ）を移動するには、r。 </li><li>細胞は灌流チャンバーのフィブロネクチンでコーティングされた内部表面（ - 2時間37℃で1）に準拠することができます。一方、セルリザーバからの新鮮な成長培地を含む新しいタンクに潅流チャンバの開放端を転送する。 </li><li>遵守期間の後、無駄に新鮮な培地（10μL）を撤回し、付着した以上の新しい液体プラグ（新鮮な培地）を配置するために十分な空気に従うように液体プラグ（馴化培地と付着していない細胞）を送信するためにシリンジポンプを指示細胞。 </li><li>細胞集団は、（ - 〜1,000細胞/チャンバーの集団を生成したマイクロスケールの文化の24時間16）が十分に平衡化と拡張になるまで定期的に（毎週2時間）で培地交換（ すなわち繰り返しステップ1.7）を実施し続けています。 </li></ol> 2。 DMFデバイスを製造し、ハブ·アーキテクチャを組み立てる<ol><l私は&gt;前述14,29、四十から六インジウムスズ酸化物（ITO）、フォトリソグラフィとエッチングにより電極（滴作動のドライバ）、及びパリレン-Cおよび50の5μmのとコートとパターンDMFデバイスの底板を説明テフロン-AFのNM。テフロン（登録商標）-AFでパターン化されていないITOガラス基板は、上述したように、コーティングによりDMF装置の天板を形成する。 </li><li> 、この間隔は、作動電極サイズ（2.5ミリメートル2）と組み合わせた液滴量（2.5μLを定義し、金属圧縮フレームを使用して、プレート間に400μmの間隔を維持する凹部を有するポリマーキャスト14,30にDMFのプレートを固定する電極当たり ）。 DMFアセンブリは単純な手段24によって達成することができることに注意してください。 </li><li>その同族作動電極の端まで延長し、各位置決めをDMFプレート間の空間に、 - ;インサートテフロンコーティングされた転送マイクロキャピラリー（4.0センチメートル長い3.5 OD、100μmの番号360ミクロン）。 </li><li>反対ENに各転送マイクロキャピラリー接辞CapTite金具のD。 </li><li> ITO電極に電圧を供給するための電気コネクタをかみ合わせます。電極の活性化配列は、所定のスクリプトを実行しているコンピュータ制御された電子インターフェースの使用を介して自動化されている。 </li><li>オプション：液滴の追跡を容易にするために電荷結合素子（CCD）カメラ（DCR-HC96（ソニー、日本））を備えた顕微鏡の並進ステージ（SZ-6145TR（オリンパス、日本））上に組み立てられたハブDMFを移動する31 </li></ol> 3。 DMFハブに灌流チェンバースを接続し、細胞集団を刺激<ol><li>培地リザーバから灌流チャンバーの開放端を取り外します（ステップ1.6を​​参照）、（ステップ2.4​​を参照）をDMFハブの転送マイクロキャピラリーの両端に貼付CapTiteフィッティングに挿入してください。 </li><li>無駄に灌流チャンバー内の液体プラグ（馴化培地）を送信するためにシリンジポンプに指示します。 </li><li>インストオンボードリザーバから（ 大腸菌 0.1％プルロニックF127 w / vの新鮮な培地では100μg/ mlで生体粒子）刺激を描き、微小毛細血管各転送に適切な大きさの液滴（10μL）を提供するDMFハブをruct 。オンボード·リザーバは、円筒状の区画（1.5×1.5センチずつ）で構成され、配管を介してDMFハブに接続されている。 </li><li>刺激が転送マイクロキャピラリーに差し込む描き、灌流チャンバーで細胞集団上のプラグを配置するために十分な空気に従うことをシリンジポンプに指示します。 </li><li>刺激（ - 4時間37℃1℃）で細胞をインキュベートする。オプション：定期的に新鮮な刺激のために為替（ つまりリピートステップ3.2から3.4）。 </li></ol> 4。刺激を終了し、解析のための細胞ライセートを回復<ol><li>オプション：ポスト刺激期間が必要な場合は、（ すなわち繰り返しステップ3.2新鮮培地に対して刺激含有液プラグを交換する- 3.4、）刺激のために新鮮な培地を代入し、インキュベートし、必要に応じて交換することを続けています。 </li><li>洗浄バッファー（プレリュード直接溶解モジュールバッファーB）（ すなわち繰り返しステップ3.2から3.4まで、刺激のための洗浄バッファーを代入）のExchange灌流チャンバー内の液栓、となど（5分）が必要とインキュベートする。 </li><li>為替溶解溶液（プレリュード直接溶解モジュールバッファー0.1％プルロニックF127 w / v）のための液体プラグ（バッファを洗う）（ つまりリピートステップ3.2から3.4まで、刺激のために溶解液を置換）、および必要に応じてインキュベート（5分） 。 </li><li> DMFハブに液体プラグ（細胞溶解物）を送信するためにシリンジポンプに指示します。 </li><li> DMFハブを分解し、DMFデバイス（これは液滴混合になることができますように、横向きプレートを傾けないように注意して使用して）の天板を取り外し、オフプラットフォーム分析用ピペットマンや注射器を使用して溶解物（遺伝子発現プロファイリングを収集定量PCR経由）。 </li></ol> 5。用クリーンプラットフォームハードウェア再利用<ol><li> 、RTで10分間、10％の漂白剤（水中v / v）で、転写マイクロキャピラリーとCapTite継手を浸す脱イオン水で十分にすすぎ、窒素ガスを用いたドライ。 </li><li> RTで10分間、10％の漂白剤でDMFデバイスプレートを浸し、イソプロパノールでよくすすぎ、脱イオン水に続いて、ドライ用いて窒素ガスを10分間160℃で焼成した。 </li><li>シリンジポンプのポリカーボネートチューブ、およびDMFデバイスのポリマーキャストと圧縮フレームは、洗浄することなく再利用することができる。灌流チャンバーマイクロキャピラリーは、各実験の後に破棄されます。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

私たちは、マイクロスケールの細胞培養と刺激実験のためのシンプルで汎用性の高い自動化されたプラットフォームを開発しました。文化サイズがさらに小さい直径のマイクロキャピラリーを使用することにより減少させることができる、プラットフォームは、私たちは小さな文化ボリュームと細胞集団- （ - 20μLと100 2,000細胞、室ごとに1）で動作するようになります。これらのスケールでの仕事はルーチン試験のコストを低減し、貴重な試薬および/または細胞の使用を必要とする可能研究を行う。プラットフォーム実行実験は、細胞や体液が自動化されたプラットフォームによって処理される精度と再現性におそらく起因少なくばらつきを示す。 プラットフォームの現在の構成は、播種、平衡、および灌流チャンバーで細胞集団の拡大のためにオフボード貯水池（マイクロチューブまたはマイクロタイタープレートウェル）から細胞やメディアを描画します。これは、間に不一致に対処するための簡単​​な方法である成長培地要件（上記の代表的な実験で消費される例えば 700μL）およびDMFデバイスの貯水池（24μLず...

（in vitroでの解析では）文化の中で維持された細胞の研究では、複雑な生物学的システムと人間の健康を支配する基本的な原理と分子メカニズムに貴重な洞察を提供してきました。ペトリ皿とマイクロタイタープレートを利用して分析するための文化、刺激し、細胞の収集のための従来の方法は、ミリリットル規模な文化量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の大規模な集団の研究のために設計されていた。しかし、細胞の限られた量が使用可能な多くのインスタンスが（ 例えば、初代細胞）、または細胞の小集団（ 例えば 、集団全体のセル間のばらつきを低減する）ことが望ましい、または必要な試薬を得ることが困難であるまたは高価（ 例えば精製細胞分泌因子）。このような問題が正常に培養規模を縮小することによって対処することができ、これは、 すべての消費を低減するという利点を有している試薬は、in vitroでの解析1,2 にするために必要。残念なことに、従来の装置および方法は、マイクロスケールの文化や3-11はあまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化され、現在入手可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムの正確で再現性のある操作をサポートしていません。 マイクロスケールのボリュームで（1 - 20μL） - 本稿では、自動化された文化、刺激し、細胞の小集団（2,000細胞100）の回復のためのシンプルで汎用性の高い技術プラットフォームの組み立てと使用を説明します。フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリーが（ &quot;細胞灌流チャンバー&quot;モジュール）マイクロスケール文化の確立、維持、刺激のためのサイトとして機能のセット、およびデジタルマイクロフルイディクス（DMF：プラットフォーム·アーキテクチャ（ 図1）は、設計でモジュール化され&quot;転送&quot;マイクロキャピラリー（ &quot;中央ハブ&quot;モジュール）14,15路線細胞を装備）12,13デバイス灌流チャンバーへとからと試薬。 DMFは、ユーザが個々に、同時に複数の液滴に対応し、デバイスハードウェアを変更することなく操作（ すなわち、再構成試料処理列）を変更または再注文することを可能にする。その驚異的な柔軟性は、細胞培養16,17、酵素アッセイ18,19、20,21イムノアッセイ、DNA分析22,23、タンパク質処理、24,25など、幅広い用途でのキーテクノロジーとしての最近の出現で明らかであるおよび臨床検体処理。26,27地球中心ハブは、DMFデバイスに固有の柔軟性を利用し、さらに特化した周辺装置の操作のサブセット（ 例えば、細胞培養物）を実施する機会を提供微小インタフェースを追加することによってそれを増強するむしろDMFデバイス自体よりもモジュール。このように処理列車の区画もPLAの設計を簡素化TFORMアーキテクチャ（ すべての処理手順を実行することができるDMFデバイスを構築する必要がない）と新しい機能としての進化を促進するには（単に必要に応じて新たな周辺モジュールを統合）が必要です。から、交通機関へ、そして灌流チャンバー内で高精度な注射器で生成された圧力変化によって供給され、中央ハブ内の細胞と試薬の輸送はDMF装置13,28内の電極の逐次的活性化によって生成される力をエレクトロウェッティングにより駆動されるポンプ。これらの流体運動のすべては、単純な電子インターフェースを介して制御され、予め決められたスクリプトを使用して自動化されている。 代表的な例として、細菌によるチャレンジ（ 図2）により誘発された免疫細胞の転写応答の研究のためのプラットフォームの使用を示す。プラットフォーム上でこれらの実験を行うことは、私たちは、細胞の数が少ない（experimen あたり 〜1,000で動作するように有効にTAL条件）、実験·ツー·実験の変動、節約試薬、再直接ハンズオン労力を最小限に抑えます。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性を考えると、このプラットフォームでは、研究室や様々なアプリケーションでの使用を見つけて、限られた量で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。

<table><tbody><tr><td>Prelude Direct Lysis Module</td><td>NuGEN</td><td>1400-24</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4% w/v)</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cell Stripper</td><td>Cellgro</td><td>25-056-C1</td><td></td></tr><tr><td>Ovation PicoSL WTA</td><td>NuGEN</td><td>3310-048</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo BioParticles</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>CCL4 TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00443111_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCL5 TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm01302428_m1</td><td></td></tr><tr><td>PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00478374_m1</td><td></td></tr><tr><td>TNF TaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm00443258_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDHTaqMan qRT-PCR assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm99999915_g1</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Sigma Chemical</td><td>2594628</td><td></td></tr><tr><td>Fluorinert FC-40</td><td>Sigma Chemical</td><td>51142-49-5</td><td></td></tr><tr><td>Parylene C dimer</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>28804-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-AF</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td></td></tr><tr><td>Polyimide tape</td><td>ULINE</td><td>S-11928</td><td></td></tr><tr><td>酸化インジウムスズ(ITO)コーティングガラス基板 </td><td>デルタテクノロジー</td>ズ <td>CB-40IN-1107</td><td></td></tr><tr><td>DMFハブ テフロンコーティング溶融シリカマイクロキャピラリー</td><td>ポリマイクロテクノロジー</td><td>ズ TSU100375</td><td></td></tr><tr><td>灌流チャンバーマイクロキャピラリー</td><td>ポリマイクロテクノロジー</td><td>ズ TSP530700</td><td></td></tr><tr><td>チューブおよびマイクロキャピラリーフィッティング</td><td>サンディア国立研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート製チューブ</td><td>Paradigm Optics</td><td>CTPC100-500-5</td><td></td></tr><tr><td>8ポート精密シリンジポンプ、30mm(500 &#956;l容量)シリンジ</td><td>ハミルトン社</td><td>54848-01</td><td></td></tr><tr><td>パリレンC蒸着装置</td><td>スペシャルティコーティングシステムズ</td><td>PDS 2010 ラボコーター2</td><td></td></tr><tr><td>高電圧関数発生器</td><td>トレック</td><td>615A-1 615-3</td><td></td></tr><tr><td>MVX10顕微鏡</td> オ<td>リンパス</td><td></td><td>オプション(DMFハブ上の液滴の追跡を促進)</td></tr><tr><td>QIClickデジタルCCDカメラ</td><td>QImaging</td><td>QIClick-F-CLR-12</td><td>オプション (DMF ハブ上の液滴の追跡を容易にします)</td></tr></tbody></table>

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

培養中の細胞（in vitroでの解析で ）の研究では、複雑な生物学的システムに重要な洞察を提供してきました。 in vitroでの解析でするための従来の方法と装置はよくミリリットル規模な量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の多数の研究に適しています。しかしながら、関心および/またはその培養物、刺激、または処理に必要な試薬の細胞の消費を減らすために、培養規模を縮小することが必要または望ましいである多くの例がある。残念なことに、従来のアプローチでは、マイクロスケールの文化を正確かつ再現性のある操作をサポートしていないと、現在利用可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムは、あまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化されます。マイクロスケール体積 - この問題に対処するために、我々は自動化された培養物、刺激し、細胞の小集団（2,000セル100）の回収のためのシンプルかつ汎用性の高い技術プラットフォームを開発したS（1 - 20μL）。 &quot;転送&quot;マイクロキャピラリー（ &quot;中央ハブを装備し、デジタルマイクロフルイディクス（DMF）デバイス、プラットフォームは、マイクロスケール培養物を、確立され維持され、刺激され、その中フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（&quot;細胞灌流チャンバー &quot;）、のセットで構成され&quot;）、および灌流チャンバーからのルート細胞および試薬れ、パワー灌流室と中央ハブの間の材料の輸送高精度シリンジポンプ、れると、材料の輸送を制御でき電子インターフェース、ある調整し、予め決められたスクリプトを介して自動化。例として、細菌によるチャレンジに基づい免疫細胞において誘発転写応答の研究を容易にするために、プラットフォームを使用した。プラットフォームを使用することにより、私たちは、細胞や試薬の消費量を減らす実験ツー実験の変動を最小限にするために有効で、再直接ハンズオン労働。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性、Oを考えるウルプラットフォームは、研究室やさまざまなアプリケーションでの使用を見出す、とだけ数量限定で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。

自動化されたプラットフォームの証明として、我々は、免疫細胞の小集団は、マイクロスケール培養で増殖させた細菌でチャレンジし、炎症促進性応答（ 図2のプラットフォーム外分析のために溶解しされた研究を行うためにそれを使用し）。 6セル灌流チャンバーの各々は、成長培地10μlに再懸濁し、10 4免疫細胞（P388D.1ネズミマクロファージ）を播種した。遵守期間（37℃で2時間、C）と培地交換した後、〜500細胞は、複製マイクロ培養（細胞キレート剤処理を介して放出され、カウントの分析を通して測定された各チャンバーの内部表面（ 図3A）、に装着のまま血球計および光顕微鏡を介して）。 2時間間隔で培地交換し、16時間、37℃でさらにインキュベーションは、チャンバーあたり 〜1,000細胞（ 図3B）（として測定番目に細胞集団を拡大上記のように反復マイクロ文化の大まかな分析、）。 6灌流チャンバー4において、細胞集団はE.でチャレンジした...

我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

この手順の全体的な目的は、半自動のマイクロ流体ベースのプラットフォームを構築して使用し、少数の細胞集団を培養および刺激し、分子解析のために細胞溶解物を回収することです。これは、まずフィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（細胞灌流チャンバーと呼ぶ）内でマイクロスケールの細胞培養を確立することによって達成されます。次のステップは、灌流チャンバーをデジタルマイクロ流体（DMF）モジュールに接続することであり、これにより、試薬をマイクロスケール細胞培養へと、またそこから柔軟に誘導することが可能になります。次に、DMFモジュールが目的の刺激を灌流チャンバーに届け、細胞をあらかじめ設定した曝露時間で刺激と共にインキュベートします。最後に、化学的手法で細胞を溶解し、分子解析のために溶解物をDMFモジュール上で回収します。回収した溶解物を定量R-T-P-C-Rで解析し、刺激に対する細胞集団の転写応答を特性評価します。この手法の従来の細胞培養法に対する主な利点は、少量の細胞を用いて細胞刺激研究を行うことができ、試薬の使用量も抑えられる点にあります。当研究グループの実証により、マイクロスケールでの細胞および試薬の精密なハンドリングが可能な本プラットフォームは、実験間のばらつきを最小限に抑えることが示されています。また、本プラットフォームは非常に汎用性が高いことも特徴です。デジタルマイクロフローモジュールを使用すると、細胞や試薬を灌流チャンバーへ柔軟に誘導できるため、実験のカスタマイズや再構成を迅速かつ容易に行うことができます。まず、50 µg/mLのフィブロネクチンの滅菌溶液を調製し、マルチポートシリンジポンプを用いて、各マイクロキャピラリーに30 µLの溶液を吸引し、マイクロキャピラリー内壁のコーティングを促進させます。37 °Cで2時間インキュベートした後、フィブロネクチン溶液を吸引して廃棄し、マイクロキャピラリーを室温で6時間乾燥させます。次に、ファイバーを挿入した被覆マイクロキャピラリーまたは灌流チャンバーをポリカーボネートチューブに接続し、そのチューブをキャピラリフィッティングを用いてシリンジポンプに接続します。ここに示すセットアップでは、6つの灌流チャンバーに対応したAid Portシリンジポンプを使用しています。テープを用いて各灌流チャンバーの本体をヒートブロックに固定し、ヒートブロックの温度を37 °Cに設定します。次に、灌流チャンバーの開口端を、1 mlあたり100万個の濃度で均一に分散させ、新鮮な増殖培地に懸濁させた細胞を含むリザーバーに浸します。シリンジポンプを操作し、細胞懸濁液 10 µLを各灌流チャンバーに吸引します。その後、灌流チャンバーの開口端を細胞懸濁液から取り出し、シリンジポンプを操作して十分な量の空気を吸引し、液 plugsをヒートブロックに固定されたセクションまで移動させます。細胞を37 °Cで1〜2時間インキュベートし、灌流チャンバーのフィブロネクチンコートされた内壁に接着させます。その間に、灌流チャンバーの開放端を、新鮮な増殖培地を含む新しいリザーバーへと移します。接着期間の後、シリンジポンプを操作して液体プラグを廃棄し、次に各灌流チャンバーに10 µLの新鮮な培地を吸引し、続いて十分な量の空気を送り込み、新鮮な培地を接着した細胞の上に配置します。細胞を37°Cで引き続きインキュベートし、培養液が十分に平衡化され、細胞数が増殖するまで2時間ごとに培地を交換します。DMFモジュールの底面プレートには46個の酸化インジウムスズ電極が配置されています。標準的なフォトリソグラフィ技術を用いて、化学気相成長法によりDMFモジュールの底面プレートに5 µmのLene Cをコーティングし、次にTeflon afを50 nm厚でスピンコートします。次に、上プレートとして使用するために、パターン形成されていない酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板にTeflon AFを50 nanometersの厚さでスピンコートします。プレートをポリマーキャストに固定するために金属圧縮フレームを使用し、プレート間の間隔が400 micronに維持されるように凹み部分で調整します。この間隔と2.5 millimeters squaredの駆動電極サイズにより、液滴量は電極あたり2.5 microlitersと定義されます。次に、テフロンコーティングされた移送用マイクロキャピラリーをDMFプレートの隙間に挿入します。各キャピラリーは、対応する駆動電極の端から移送先の反対端まで届くように配置し、マイクロキャピラリーにキャップフィッティングを固定します。次に、電気コネクタを接続してIndium 10酸化物電極に電圧を供給します。電極の活性化シーケンスは、あらかじめ設定されたスクリプトを実行するコンピュータ制御の電子インターフェースを通じて自動化されています。その後、DMFモジュールのオンボードリザーバーに、細胞の刺激、洗浄、および溶解に適した試薬を充填します。場合によっては、オンボードリザーバーから充填し、DMFモジュール上に微小液滴を分注することで、刺激剤自体を後続のステップで使用直前にロードするのが最適です。DMFモジュールと移送用マイクロキャピラリ間の輸送を含め、微小液滴の作動を確認してください。Blais。まず、最終濃度が 100 micrograms per milliliter となるように、0.1%onic F1 27 を含む新鮮な培地で刺激剤を調製します。次に、80〜100 µLの刺激物質を、指定されたオンボードリザーバーにロードします。続いて、灌流チャンバーの開放端を培地リザーバーから取り外し、移送用マイクロキャピラリーの両端に取り付けられたキャピテフィッティングに挿入します。その後、シリンジポンプを操作し、灌流チャンバー内の液体プラグを廃棄容器に送ります。最後に、DMFモジュールを操作して、10 µLの刺激物質ドロップレットを生成させ、移送用マイクロキャピラリーを介して灌流チャンバーに送液します。必要に応じて、細胞を刺激剤とともに37 °Cで1〜4時間インキュベートします。刺激期間終了後は、定期的な間隔で新鮮な刺激剤に交換してください。シリンジポンプを操作して刺激剤を廃棄容器へ送り、DMFモジュールを操作して各灌流チャンバーに10 µLの洗浄バッファーを滴下させます。細胞を洗浄バッファーで5分間インキュベートします。次に、洗浄バッファーを10 µLの溶解液に交換し、さらに5分間インキュベートします。その後、シリンジポンプを操作し、各細胞溶解物をDMFモジュールへ送液します。液滴間の相互汚染を避けるため、プレートを横に傾けないように注意しながら、DMFモジュールのトッププレートを取り外します。最後に、ピペットマンを用いて開放されたDMFモジュールからライセートを回収し、定量RT-PCRによる遺伝子発現プロファイリングなどのプラットフォーム外での解析に供し、次回の実験に向けてプラットフォームを準備します。まず、移送用マイクロキャピラリー、CAPITEフィッティング、およびDMFモジュールプレートを10%漂白剤に室温で10分間浸漬させます。次に、DMFモジュールプレートをイソプロパノールで洗浄し、続いて脱イオン水で洗浄して窒素ガスで乾燥させ、最後に160 °Cで10分間ベーキングします。本プロトコルに記載した播種法により、灌流チャンバー1つあたり約500個のmirenマクロファージが付着しました。細胞を増殖培地を用い37 °Cで16時間インキュベートした後、細胞数は灌流チャンバー1つあたり約1000個まで倍増しました。ここでは、細菌に対する自然免疫応答において重要な役割を果たすことが知られている4つの遺伝子の定量的R-T-P-C-R解析の結果を示します。マクロファージを従来法またはマイクロスケール培養のいずれかで育成し、E. coliバイオパーティクルを用いて1時間または4時間の刺激を行った。青色の棒グラフは、従来法で培養した細胞を刺激した際の遺伝子発現の平均倍率増加を示し、赤色の棒グラフは、マイクロスケールで育成し刺激した細胞における誘導発現を示す。マイクロスケール培養において、エラーバーは3回の独立した実験における生物学的レプリケート間の標準偏差を示す。従来の培養では96ウェルプレートを使用し1ウェルあたり約50,000個の細胞を用いていたのに対し、マイクロスケール培養ではマイクロキャピラリーを使用し1灌流チャンバーあたり約1000個の細胞を用いていましたが、遺伝子発現プロファイリングの結果は非常に類似していました。エラーバーが短くなっていることからわかるように、実験間のばらつきは、マイクロスケールでの操作において少なくとも同等であり、多くの場合減少していました。また、従来の実験と比較して、細胞の消費量は5分の1に、試薬の消費量は3分の1から50分の1に削減されました。この手法は、場合によっては異なる細胞外マトリックス成分や増殖培地を使用することで、事実上あらゆる接着性細胞種の培養に利用可能です。非接着性細胞種の培養は困難な場合がありますが、同様の状況において細胞テザリング戦略が有効であることが示されています。本手法で説明するアプローチは、最大24時間までのマイクロスケール培養をサポートします。このプラットフォームは長期培養を行うためのすべての機能を備えていますが、細胞継代プロトコルを構築する必要があります。さらに、マイクロキャピラリー相互接続を通じて、デジタルマイクロ流体キューブに他のモジュールを統合することが可能です。これにより、DMFは周辺モジュールを接続し、複雑なワークフローを実行するためのセントラルハブとして機能します。我々は主に感染剤に対する宿主の転写応答の特性解析に焦点を当てましたが、本プラットフォームは極めて汎用性が高く設計されているため、幅広い研究アプリケーションに対応することが可能です。

a-versatile-automated-platform-for-micro-scale-cell-stimulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ マイクロスケール細胞刺激のための半自動マイクロ流体プラットフォームを用いた細胞培養と刺激の方法。少量の細胞と試薬を使用し、細胞溶解物を回収して分子解析を行う技術です。

マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

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