マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

この手順の全体的な目的は、半自動のマイクロ流体ベースのプラットフォームを構築して使用し、少数の細胞集団を培養および刺激し、分子解析のために細胞溶解物を回収することです。これは、まずフィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（細胞灌流チャンバーと呼ぶ）内でマイクロスケールの細胞培養を確立することによって達成されます。次のステップは、灌流チャンバーをデジタルマイクロ流体（DMF）モジュールに接続することであり、これにより、試薬をマイクロスケール細胞培養へと、またそこから柔軟に誘導することが可能になります。

次に、DMFモジュールが目的の刺激を灌流チャンバーに届け、細胞をあらかじめ設定した曝露時間で刺激と共にインキュベートします。最後に、化学的手法で細胞を溶解し、分子解析のために溶解物をDMFモジュール上で回収します。回収した溶解物を定量R-T-P-C-Rで解析し、刺激に対する細胞集団の転写応答を特性評価します。

この手法の従来の細胞培養法に対する主な利点は、少量の細胞を用いて細胞刺激研究を行うことができ、試薬の使用量も抑えられる点にあります。当研究グループの実証により、マイクロスケールでの細胞および試薬の精密なハンドリングが可能な本プラットフォームは、実験間のばらつきを最小限に抑えることが示されています。また、本プラットフォームは非常に汎用性が高いことも特徴です。

デジタルマイクロフローモジュールを使用すると、細胞や試薬を灌流チャンバーへ柔軟に誘導できるため、実験のカスタマイズや再構成を迅速かつ容易に行うことができます。まず、50 µg/mLのフィブロネクチンの滅菌溶液を調製し、マルチポートシリンジポンプを用いて、各マイクロキャピラリーに30 µLの溶液を吸引し、マイクロキャピラリー内壁のコーティングを促進させます。37 °Cで2時間インキュベートした後、フィブロネクチン溶液を吸引して廃棄し、マイクロキャピラリーを室温で6時間乾燥させます。

次に、ファイバーを挿入した被覆マイクロキャピラリーまたは灌流チャンバーをポリカーボネートチューブに接続し、そのチューブをキャピラリフィッティングを用いてシリンジポンプに接続します。ここに示すセットアップでは、6つの灌流チャンバーに対応したAid Portシリンジポンプを使用しています。テープを用いて各灌流チャンバーの本体をヒートブロックに固定し、ヒートブロックの温度を37 °Cに設定します。

次に、灌流チャンバーの開口端を、1 mlあたり100万個の濃度で均一に分散させ、新鮮な増殖培地に懸濁させた細胞を含むリザーバーに浸します。シリンジポンプを操作し、細胞懸濁液 10 µLを各灌流チャンバーに吸引します。その後、灌流チャンバーの開口端を細胞懸濁液から取り出し、シリンジポンプを操作して十分な量の空気を吸引し、液 plugsをヒートブロックに固定されたセクションまで移動させます。

細胞を37 °Cで1〜2時間インキュベートし、灌流チャンバーのフィブロネクチンコートされた内壁に接着させます。その間に、灌流チャンバーの開放端を、新鮮な増殖培地を含む新しいリザーバーへと移します。接着期間の後、シリンジポンプを操作して液体プラグを廃棄し、次に各灌流チャンバーに10 µLの新鮮な培地を吸引し、続いて十分な量の空気を送り込み、新鮮な培地を接着した細胞の上に配置します。

細胞を37°Cで引き続きインキュベートし、培養液が十分に平衡化され、細胞数が増殖するまで2時間ごとに培地を交換します。DMFモジュールの底面プレートには46個の酸化インジウムスズ電極が配置されています。標準的なフォトリソグラフィ技術を用いて、化学気相成長法によりDMFモジュールの底面プレートに5 µmのLene Cをコーティングし、次にTeflon afを50 nm厚でスピンコートします。

次に、上プレートとして使用するために、パターン形成されていない酸化インジウムスズ（ITO）ガラス基板にTeflon AFを50 nanometersの厚さでスピンコートします。プレートをポリマーキャストに固定するために金属圧縮フレームを使用し、プレート間の間隔が400 micronに維持されるように凹み部分で調整します。この間隔と2.5 millimeters squaredの駆動電極サイズにより、液滴量は電極あたり2.5 microlitersと定義されます。

次に、テフロンコーティングされた移送用マイクロキャピラリーをDMFプレートの隙間に挿入します。各キャピラリーは、対応する駆動電極の端から移送先の反対端まで届くように配置し、マイクロキャピラリーにキャップフィッティングを固定します。

次に、電気コネクタを接続してIndium 10酸化物電極に電圧を供給します。電極の活性化シーケンスは、あらかじめ設定されたスクリプトを実行するコンピュータ制御の電子インターフェースを通じて自動化されています。その後、DMFモジュールのオンボードリザーバーに、細胞の刺激、洗浄、および溶解に適した試薬を充填します。

場合によっては、オンボードリザーバーから充填し、DMFモジュール上に微小液滴を分注することで、刺激剤自体を後続のステップで使用直前にロードするのが最適です。DMFモジュールと移送用マイクロキャピラリ間の輸送を含め、微小液滴の作動を確認してください。Blais。まず、最終濃度が 100 micrograms per milliliter となるように、0.1%onic F1 27 を含む新鮮な培地で刺激剤を調製します。

次に、80〜100 µLの刺激物質を、指定されたオンボードリザーバーにロードします。続いて、灌流チャンバーの開放端を培地リザーバーから取り外し、移送用マイクロキャピラリーの両端に取り付けられたキャピテフィッティングに挿入します。その後、シリンジポンプを操作し、灌流チャンバー内の液体プラグを廃棄容器に送ります。最後に、DMFモジュールを操作して、10 µLの刺激物質ドロップレットを生成させ、移送用マイクロキャピラリーを介して灌流チャンバーに送液します。

必要に応じて、細胞を刺激剤とともに37 °Cで1〜4時間インキュベートします。刺激期間終了後は、定期的な間隔で新鮮な刺激剤に交換してください。シリンジポンプを操作して刺激剤を廃棄容器へ送り、DMFモジュールを操作して各灌流チャンバーに10 µLの洗浄バッファーを滴下させます。

細胞を洗浄バッファーで5分間インキュベートします。次に、洗浄バッファーを10 µLの溶解液に交換し、さらに5分間インキュベートします。その後、シリンジポンプを操作し、各細胞溶解物をDMFモジュールへ送液します。

液滴間の相互汚染を避けるため、プレートを横に傾けないように注意しながら、DMFモジュールのトッププレートを取り外します。最後に、ピペットマンを用いて開放されたDMFモジュールからライセートを回収し、定量RT-PCRによる遺伝子発現プロファイリングなどのプラットフォーム外での解析に供し、次回の実験に向けてプラットフォームを準備します。まず、移送用マイクロキャピラリー、CAPITEフィッティング、およびDMFモジュールプレートを10%漂白剤に室温で10分間浸漬させます。次に、DMFモジュールプレートをイソプロパノールで洗浄し、続いて脱イオン水で洗浄して窒素ガスで乾燥させ、最後に160 °Cで10分間ベーキングします。

本プロトコルに記載した播種法により、灌流チャンバー1つあたり約500個のmirenマクロファージが付着しました。細胞を増殖培地を用い37 °Cで16時間インキュベートした後、細胞数は灌流チャンバー1つあたり約1000個まで倍増しました。ここでは、細菌に対する自然免疫応答において重要な役割を果たすことが知られている4つの遺伝子の定量的R-T-P-C-R解析の結果を示します。

マクロファージを従来法またはマイクロスケール培養のいずれかで育成し、E. coliバイオパーティクルを用いて1時間または4時間の刺激を行った。青色の棒グラフは、従来法で培養した細胞を刺激した際の遺伝子発現の平均倍率増加を示し、赤色の棒グラフは、マイクロスケールで育成し刺激した細胞における誘導発現を示す。マイクロスケール培養において、エラーバーは3回の独立した実験における生物学的レプリケート間の標準偏差を示す。

従来の培養では96ウェルプレートを使用し1ウェルあたり約50,000個の細胞を用いていたのに対し、マイクロスケール培養ではマイクロキャピラリーを使用し1灌流チャンバーあたり約1000個の細胞を用いていましたが、遺伝子発現プロファイリングの結果は非常に類似していました。エラーバーが短くなっていることからわかるように、実験間のばらつきは、マイクロスケールでの操作において少なくとも同等であり、多くの場合減少していました。また、従来の実験と比較して、細胞の消費量は5分の1に、試薬の消費量は3分の1から50分の1に削減されました。

この手法は、場合によっては異なる細胞外マトリックス成分や増殖培地を使用することで、事実上あらゆる接着性細胞種の培養に利用可能です。非接着性細胞種の培養は困難な場合がありますが、同様の状況において細胞テザリング戦略が有効であることが示されています。本手法で説明するアプローチは、最大24時間までのマイクロスケール培養をサポートします。

このプラットフォームは長期培養を行うためのすべての機能を備えていますが、細胞継代プロトコルを構築する必要があります。さらに、マイクロキャピラリー相互接続を通じて、デジタルマイクロ流体キューブに他のモジュールを統合することが可能です。これにより、DMFは周辺モジュールを接続し、複雑なワークフローを実行するためのセントラルハブとして機能します。

我々は主に感染剤に対する宿主の転写応答の特性解析に焦点を当てましたが、本プラットフォームは極めて汎用性が高く設計されているため、幅広い研究アプリケーションに対応することが可能です。