マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム

この手順の全体的な目標は、半自動のマイクロ流体ベースのプラットフォームを組み立てて使用し、細胞の小さな集団を培養および刺激し、分子分析のための細胞溶解物を回収することです。これは、まず、細胞灌流チャンバーと呼ばれるフィブロネクチン被覆マイクロキャピラリーでマイクロスケールの細胞培養を確立することによって達成されます。2番目のステップは、灌流チャンバーをデジタルマイクロ流体またはDMFモジュールに接続することで、マイクロスケールの細胞培養との間で試薬をルーティングする柔軟な手段を提供します。

次に、DMFモジュールが目的の刺激を灌流チャンバーに送達し、細胞は所定の曝露時間、刺激とともにインキュベートされます。最後に、細胞を化学的手段で溶解し、ライセートを分子分析のためにDMFモジュールに回収します。次に、回収されたライセートを定量的R-T-P-C-Rを使用して分析し、刺激に対する細胞集団の転写応答を特徴付けます。

この技術が従来の細胞培養法と比較した場合の主な利点は、この技術により、少量の細胞を使用した細胞刺激研究を行うことができ、また少量の試薬を使用することも可能です。私たちの研究は、プラットフォームがマイクロスケールで細胞と試薬を正確に取り扱うことで、実験間のばらつきを最小限に抑えることを実証しました。プラットフォームも非常に用途が広いです。

デジタルマイクロフローモジュールは、細胞や試薬を灌流チャンバーとの間で非常に柔軟にルーティングできるため、実験のカスタマイズや再構成を迅速かつ容易に行うことができます。まず、50マイクログラム/ミリリットルのフィブロネクチンの滅菌溶液を調製し、マルチポートシリンジポンプを使用して30マイクロリットルの溶液を各マイクロキャピラリーに引き込み、マイクロキャピラリー内面のコーティングを促進します。摂氏37度で2時間インキュベートした後、フィブロネクチン溶液を回収して廃棄し、微小毛細血管を室温で6時間乾燥させます。

次に、ファイバーニンコーティングされたマイクロキャピラリーまたは灌流チャンバーをポリカーボネートチューブに接続し、チューブをシリンジポンプにキャピットフィッティングを使用して接続します。ここに示すセットアップでは、6 つの灌流チャンバーをサポートするエイド ポート シリンジ ポンプを使用しています。テープを使用して、各灌流チャンバーの本体をヒートブロックに固定し、ヒートブロックの温度を摂氏37度に設定します。

次いで、灌流チャンバーの開放端を、新鮮な成長で懸濁した細胞を含むリザーバーに浸し、培地を1ミリリットルあたり100万個の細胞の濃度で均一に分散させる。シリンジポンプに、10マイクロリットルの細胞懸 ?? 液を各 ?? 流チャンバーに引き込むように指示します。.次に、灌流チャンバーの開放端を細胞懸濁液から取り外し、シリンジポンプに液体プラグをヒートブロックに固定されたセクションに移動するのに十分な空気を引き込むように指示します。

フィブロネクチンでコーティングされた灌流チャンバーの内面に細胞を接着させ、摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。その間に、灌流チャンバーの開放端を、新鮮な成長培地を含む新しいリザーバーに移します。接着期間の後、シリンジポンプに液体プラグを廃棄物に送り、次に10マイクロリットルの新鮮な培地を各増殖チャンバーに引き込むように指示し、続いて新鮮な培地を接着した細胞の上に配置するのに十分な空気を送ります。

細胞を摂氏37度でインキュベートし続け、培養物が十分に平衡化して増殖するまで、2時間ごとに培地を交換します。パターン。46個の酸化インジウムスズ電極を備えたDMFモジュールの底板。標準的なフォトリトグラフィー技術を使用して、DMFモジュールの底板を化学蒸着によって5ミクロンのLene Cでコーティングし、次に50ナノメートルのテフロンafでスピンコートします。

次に、スピンコートと50ナノメートルのテフロンAFをトッププレートとして使用する非パターン化酸化インジウムスズガラス基板。金属製の圧縮フレームを使用して、プレート間の間隔を400ミクロンに維持するくぼみのあるポリマーキャストにプレートを固定します。この間隔と2.5mm二乗の作動電極サイズの組み合わせにより、液滴の体積は電極あたり2.5マイクロリットルと定義されます。

次に、テフロンコーティングされた転写マイクロキャピラリーをDMFプレート間のスペースに挿入します。各転送の反対側の端まで同族の作動電極の端まで伸びるように各々を配置します。マイクロキャピラリーはキャピテフィッティングを固定します。

次に、電気コネクタをかみ合わせて、インジウム10酸化物電極に電圧を供給します。電極の活性化シーケンスは、所定のスクリプトを実行するコンピュータ制御の電子インターフェースを使用して自動化されます。次に、リザーバーに搭載されているDMFモジュールに、細胞の刺激、洗浄、溶解に適した試薬を充填します。

場合によっては、刺激物自体を、ロードされたオンボードリザーバーから引き出す使用直前のステップでロードし、微小液滴をDMFモジュールに分注するのが最善です。DMFモジュールと転写マイクロキャピラリー間の輸送を含む、マイクロ液滴の作動をテストします。ブライス。まず、0.1%オンF1 27を含む新鮮な培地で刺激を100マイクログラム/ミリリットルの最終濃度で調製します。

次に、80〜100マイクロリットルの刺激を指定されたオンボードリザーバーにロードします。次に、灌流チャンバーの開放端を培地リザーバーから取り外し、トランスファーマイクロキャピラリーの端に固定されたキャピテフィッティングに挿入し、シリンジポンプに灌流チャンバー内の液体プラグを廃液容器に送るように指示します。次に、DMFモジュールに10マイクロリットルの刺激液滴を生成し、それらを移送マイクロキャピラリーを介して灌流チャンバーに送達するように指示します。

必要に応じて、37°Cの刺激で細胞を1〜4時間インキュベートします。刺激期間終了後、定期的に新鮮な刺激と交換します。シリンジポンプに刺激を廃棄物容器に送るように指示し、DMFモジュールに10マイクロリットルの洗浄バッファーを各灌流チャンバーに送るように指示します。.

細胞を洗浄バッファーと5分間インキュベートします。次に、洗浄バッファーを10マイクロリットルの溶解液と交換し、さらに5分間インキュベートします。次に、シリンジポンプに各細胞ライセートをDMFモジュールに送るように指示します。

DMFモジュールのトッププレートを取り外し、プレートを横に傾けないように注意してください。最後に、ピペットマンを使用してオープンDMFモジュールからライセートを採取し、遺伝子発現などのオフプラットフォーム解析、定量R-T-P-C-Rによるプロファイリングを行い、次の実験に向けてプラットフォームを準備します。まず、トランスファーマイクロキャピラリー、CAPITEフィッティング、DMFモジュールプレートを10%漂白剤に室温で10分間浸漬し、DMFモジュールプレートをイソプロパノールですすぎ、脱イオン水で窒素ガスで乾燥させた後、160°Cで10分間ベーキングします。

このプロトコルに記載されている播種方法により、灌流チャンバーあたり約500 mirenマクロファージが付着しました。細胞を37°Cの増殖培地で16時間インキュベートした後、集団サイズは倍増し、灌流チャンバーあたり約1000細胞になりました。ここでは、細菌に対する自然免疫応答に重要な役割を果たすことが知られている4つの遺伝子の定量的R-T-P-C-R解析の結果を示します。

マクロファージは、従来の培養物またはマイクロスケールの培養物のいずれかで増殖させ、大腸菌バイオ粒子で1時間または4時間刺激しました。青色のバーは、従来の培養細胞を刺激すると遺伝子発現が平均して増加するのを示し、赤色のバーは、増殖および刺激された細胞の発現が誘導されることを示しています。マイクロスケールの培養では、エラーバーは3つの独立した実験からの生物学的複製間の標準偏差を示します。

遺伝子発現プロファイリングの結果は、従来の培養物がウェルあたり約50,000個の細胞を持つ96ウェルプレートを使用したのに対し、マイクロスケールの培養物は灌流チャンバーあたり約1000個の細胞を持つマイクロキャピラリーを使用した実験の変動性は少なくとも同等であり、マイクロスケールで作動する短いエラーバーによって示されるように、マイクロスケールの培養ではしばしば減少したにもかかわらず、遺伝子発現プロファイリングの結果は非常に類似していました。細胞の消費量を5倍に、試薬の消費量を3〜50倍に削減しました。従来の実験と比較して。

この方法は、事実上あらゆる接着細胞タイプの培養に使用でき、場合によっては異なる細胞外マトリックス成分または増殖を使用して培養できます。培地非接着細胞型は困難な場合がありますが、細胞テザリング戦略は同様の状況で成功することが示されています。ここで説明するアプローチは、最大24時間のマイクロスケール培養をサポートします。

このプラットフォームには、長期培養を行うためのすべての機能も含まれていますが、細胞継代プロトコルを開発する必要があります。追加のモジュールは、マイクロキャピラリーインターコネクトを介してデジタルマイクロ流体カブに統合できます。このように、DMFは、複雑なワークフローを実行するための周辺モジュールを接続するための中央ハブとして機能します。

私たちは主に感染性病原体に対する宿主の転写応答の特性評価に焦点を当てましたが、このプラットフォームは非常に汎用性が高いように設計されているため、さまざまな研究アプリケーションをサポートするはずです。