神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

この手順の全体的な目標は、ハイコンテントスクリーニングまたはHCSシステムを使用して、遺伝子組み換え幹細胞を迅速に特性評価することです。これは、最初に96ウェルプレートの実験を設計および準備し、次に操作された幹細胞のさまざまな集団をプレーティングすることによって達成されます。次に、ハイコンテントスクリーニングシステムをライブセルイメージング用に準備し、その後、所望の時間でタイムラプスイメージングを開始します。

次に、タイムラプスイメージングが完了した後、培養プレートは、ヨウ化プロピジウム、細胞死のための染色、または細胞増殖を特徴付けるためのKI67免疫標識などの細胞染色手順のために調製されます。最後に、96ウェルプレートをハイコンテントスクリーニングシステムにリロードして、蛍光イメージングと画像取得を行います。最終的に、画像解析ソフトウェアを使用して、さまざまな細胞増殖パラメータを決定するためのデータ解析を行います。

この方法論は、幹細胞の分化を刺激する因子の同定や特性評価など、幹細胞生物学の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の意味するところは、in vivoで使用される前に細胞タイプを特徴づけることが重要であるため、細胞ベースの治療戦略にまで及びます。この方法は、細胞の挙動に関する洞察を得ることができ、培養でよく増殖する他のほぼすべての細胞タイプに適用できます。

さらに、これらのアプローチは、ゼブラフィッシュの幼生などの生物全体に使用できる可能性があります。まず、ここに示すように、滅菌培養フードの下で検査するさまざまな基質と細胞タイプを概説する96ウェルプレートのマップを作成します。さまざまな基材と96ウェルプレートを備えたワークステーションを準備します。

マップに従って、それぞれに100マイクロリットルの基質溶液を追加します。次に、マウス間葉系幹細胞を分離し、テキストプロトコルに従ってレンチウイルスベクターに感染させた後、パーフィルのストリップを使用して蓋を密封し、摂氏4度で一晩保存し、96ウェルプレートから基質溶液を取り出し、約200マイクロリットルの滅菌PBSを使用してウェルを2回洗浄します。最終すすぎを200マイクロリットルの細胞培養培地で除去したら、細胞培養インキュベーター内のプレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で平衡化します。

その間、無菌条件下で、まず、フラスコから15ミリリットルの円錐管に成長培地(現在は馴化培地と呼ばれている)を収集してMSCを収穫します。次に、8ミリリットルの滅菌PBSをフラスコに加え、緩衝液を吸引する前に穏やかに渦巻きますフラスコから細胞を切り離すには、0.05%トリプシンと0.01%EDTA溶液を1ミリリットル加えます。細胞が分離したら、8ミリリットルの馴染培地を加えてから、細胞懸濁液を回収し、ウェルあたり約300個の細胞で細胞を再播種します。

テキストプロトコルに従って、プレートを2時間インキュベートして、細胞がインキュベートしている間にMSCが基質に付着できるようにします。HCSシステムを起動し、平衡化するまで2時間待ちます。環境コントローラーを摂氏37度に設定し、空気中に5%の二酸化炭素を含む混合ガスボンベを、一定の空気源を供給する環境チャンバーであるHCSシステムに慎重にオンにします。

次に、2時間のインキュベーション期間の後、96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、HCSシステムの環境チャンバーに直接入れます。プレートを30分間平衡化させた後、ソフトウェアを起動してプレート設定を構成します。イメージングパラメータを設定したら、テキストプロトコルに従って、レーザーオートフォーカスを使用してウェル底に焦点を合わせ、複数のサイトと複数のウェルからテスト画像を撮影して、最適化された焦点面を見つけます。

ピントが合ったら、60 個のウェルすべてについて、5 分ごとに 48 時間にわたって画像のキャプチャを開始します。実験の最後に、無菌条件下でHCSシステムから96ウェルプレートを取り外し、各ウェルから調整培地サンプルを採取し、それらを新しい96ウェルプレートに移します。これらのサンプルは、後でELIZAがKI 67細胞増殖アッセイを実施するために使用できます。

0.1モルリン酸緩衝液を使用して、細胞培養物を1分間すすぎます。洗浄を繰り返した後、4%パラホルムアルデヒドまたはPFAを室温で20分間使用し、固定後の培養物を固定します。PFAを取り出し、PBSを使用してウェルを3回、それぞれ7分間すすぎます。

テキストプロトコールに従って細胞をブロックした後、それぞれに100マイクロリットルの一次抗体溶液を塗布します。プレートをしっかりと覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。細胞を7分間3回洗浄した後。

洗浄のたびに、二次抗体を塗布します。細胞を暗所に置き、さらに3回の洗浄後、室温で90分間インキュベートします。プレートを覆い、イメージングするまで摂氏4度で保管します。

自動イメージングを行うには、免疫標識プレートをHCSシステムにロードし、プレートを20分間平衡化させます。HCSシステムの画像取得および解析ソフトウェアを開きます。10 x 対物レンズの撮影設定を選択するには、カメラの曲げを 1 に、ゲインを 2 に設定します。

自動露光機能を使用して、セルが存在するZ平面を見つけ、ここで示す分析の対象となる各波長のオフセットを計算します。DAP、EGFPおよびS3の画像をキャプチャします。ネガティブコントロールウェルが画像取得のシグナルを示さない最大強度レベルを選択します。ポジティブウェルにも同じしきい値設定を使用します。

最後に、画像分析を実行する前に、画像をキャプチャしてデータベースに保存します。テキストプロトコルによれば、ここに示すように、MSCサブタイプの5つの異なる集団を、この図の異なる基質、増殖細胞を同定する抗KI67で予めコードされた96ウェル組織培養プレートに播種し、DAPIを使用して、ここに示すように、異なる基質が遺伝子操作されたMSCの異なる集団の増殖に影響を与えたかどうかを評価しました。 増殖するMSCの割合にはばらつきがありましたが、すべての基質は各MSCサブタイプについてかなりの細胞増殖をサポートしていました。このプロットは、集団内の死細胞を特定するヨウ化プロピジウムまたはPI染色を施した細胞の割合が、ほとんどの細胞を死滅させる70%エタノールで処理された細胞を検査したすべての基質で低いことを示し、高いPI標識率を示し、異なる基質上のMSCの挙動を調査するためのポジティブコントロールとして機能することを示しています。

29時間にわたる細胞移動をタイムラプスデジタル顕微鏡を用いて解析しました。セル 1 とセル 2 の移行パスは、それぞれ緑と青の線でマークされています。ここに示すように、MSCのすべてのサブタイプは、細胞外マトリックス、コーティングされた表面で最も速い移動速度を示し、コーティングされていないポリスチレン表面で最も遅い移動速度を示しました。

この手順を試行する際には、この手順に従って96ウェルプレートなどのマルチウェルプレートフォーマットの実験を慎重に計画および設計することを覚えておくことが重要です。Eliza Sのような他の方法は、その開発後に、操作された幹細胞による治療因子の産生および分泌に関する追加の質問に答えるために、条件培地上で実施することができる。ハイコンテントスクリーニング手順により、幹細胞生物学や創薬分野の研究者は、複雑な生物学的システムをハイスループットで探索する道が開かれました。