Name: 神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ 高コンテンツスクリーニングを用いた遺伝子組み換え幹細胞の高速特性評価法。マウス間葉系幹細胞の増殖と分化因子を解析し、神経保護治療への応用可能性を示す。

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この研究のための資金は、米国陸軍医学研究・資材司令部(助成金口座番号W81XWH-11-1-0700)と幹細胞研究基金によって提供されました。PABとEMPは、Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships(SULI)の受賞者でした。

96ウェルプレートのための1。基板の準備<ol><li> （ 図1）検査対象の異なる基板と細胞型を概説し、96ウェルプレートのマップを作成します。 </li><li>ストック異なる基質溶液[ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニンおよびエンタクチン、コラーゲンIV、ラミニン（ECL）]、96ウェルマルチウェルプレートを入手し、無菌細胞培養でワークステーションを準備フード。 </li><li> （この濃度は、以前に、細胞の成長および増殖のための基質濃度依存的アッセイに基づいて決定した）を5μg/ mlの最終濃度になるように滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でストックを希釈することにより、個々の基板を用意する。無菌の貯水池に注ぐ前にボルテックスを用いて混ぜる。 </li><li> 96ウェルマップ（ 図1）に応じて、各ウェルに100μlの基質溶液を加える（12ビットまたは8チャンネルのマイクロピペットは、96ウェルプレートにマイクロピペッティングのために便利である）。パラフィルムのストリップを使用して96ウェルプレートに蓋を密封し、4℃で一晩保存する。 </li></ol> 2.細胞のプレーティングとタイムラプスイメージング注：マウスMSCを、成体C57BL / 6マウスの骨髄から単離し、そして接着細胞株として維持した。レンチウイルスベクターのエンコーディングBDNF（LV-BDNFを使用して、およびグリア細胞由来神経栄養因子（ヒトcDNA GDNF）; MSCは、脳由来神経栄養因子（ヒトcDNA BDNF）を分泌するためにそれらを設計するレンチウイルスベクターを使用して感染したCMV-BDNF-IRES -GFP）、GDNF（LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP）、および緑色蛍光タンパク質（GFP、LV-GFP; CMV-GFP）。 注：マウスの​​間葉系幹細胞のための培養培地（MSCは）10 mg / mlのストレプトマイシン、10％ハイブリドーマ修飾ウシ胎児血清、10％ウマ血清、2mMのL-グルタミン、10,000 U / mlのペニシリンを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地である。マウスのMSC（MSCは、GFP-MSCの5種類、BDNF-GFP-MSCを、GDNF-GFP-MのSCおよびBDNF / GDNF-GFP-MSCは）T75細胞培養フラスコ中で約30％コンフルエンスで播種した。 <ol><li> 細胞のプレーティング <ol><li>二回、翌日、吸引により基質溶液を除去し、滅菌PBSの約200μlで各ウェルをすすぐ。最後のPBSでリンスした後、各ウェルに細胞培養培地を（200μl/ウェル）を加える。 37℃に設定し、細胞培養インキュベーター中に96ウェルプレートを置き、平衡化のため、5％CO 2。 </li><li> 96ウェルプレートをインキュベーター内で平衡化されている間、T75フラスコから（馴化培地とも呼ばれる）の増殖培地を回収し（T75フラスコ中のMSCが収穫/めっき時に約70％コンフルエントであるべきである）細胞を採取し無菌条件下で15ミリリットルコニカルチューブに保存する（この条件培地は、以下のステップ2.1.4で使用されます）。 </li><li>フラスコに滅菌PBSの8ミリリットルを加え、穏やかに旋回した後、PBSをオフにピペットで0.05％トリプシンの1ミリリットルを追加し、0.01％T75フラスコの培養表面から細胞を剥離するEDTA溶液。位相差光学系を搭載した倒立顕微鏡を用いてフラスコを表示することにより、細胞の剥離を監視します。 </li><li>細胞が剥離したら、すぐにフラスコに（ステップ2.1.2収集）馴化培地の8ミリリットルを追加します。細胞懸濁液を収集し、15ミリリットルコニカル遠心チューブに移し、細胞をペレットに450×gで4分間遠心する。 </li><li>上清を除去し、新鮮な200μlの細胞ペレットを再懸濁し（37℃）で細胞培養培地を温め。 </li><li>血球計数器を使用してパンブルー生細胞数を実行することによって細胞懸濁液中の細胞数を決定します。約300細胞/ウェルの密度に96ウェルプレートの適切なウェルに細胞をプレー。 </li><li>細胞の各集団のためにこれらのステップを繰り返します。 </li></ol></li><li> タイムラプスイメージング <ol><li> MSCの全てがメッキされた後、場所2時間インキュベーターに96ウェルプレートは、MSCが基板に付着することを可能にする。 </li><li> HCSシステムを起動し、平衡化するためのシステムのために2時間待つ。 37℃までの環境制御装置を設定し、一定の空気供給源HCSシステム環境チャンバに空気中5％CO 2を含む混合ガスシリンダを接続する。 </li><li> 2時間の平衡期間以下のインキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、HCSシステムの細胞増殖チャンバ内に直接配置します。平衡化のための30分は、プレートのあらゆる熱関連の拡張を考慮して、プレートの設定を構成する画像取得と解析ソフトウェアを起動できるようにします。 </li><li>イメージングのための20X目的​​を選択します。 [ すなわち、などフィブロネクチン上のGFP-MSCを（×2回の反復30条件=合計で60ウェルの合計6基材×5 MSCサブタイプ）]タイムラプスイメージングを設定するための条件あたり2つのウェルを選択します。とイメージングのための2つのサイトを選択してください各ウェル中。 </li><li>イメージングのための正しい光の波長を選択してください。 注：二つの異なる波長（位相コントラスト及びGFP蛍光）はタイムラプスイメージングのために選択した。 </li><li>レーザーオートフォーカスを使用して、井戸の底に焦点を当て、最適化された焦点面を見つけるために、複数のサイトや複数のウェル用のテスト画像を撮影する。 </li><li>フォーカスが確立されると、すべての60ウェル（120部位）のための48時間の画像ごとに5分のキャプチャを開始する。 </li><li> HCSシステムからの96ウェルプレートを除去することにより、細胞を24時間ごとにフィード。各ウェルから培地75μlのを削除し、各ウェルに100μlの新鮮な培地を加える（37℃で新鮮な培地を平衡化し、5％CO 2）。 </li><li>タイムラプス実験の終わりに、HCSシステムからの96ウェルプレートを取り外します。無菌条件下で、各ウェルからの馴化培地試料を収集し、別の96ウェルプレートに、これらのサンプルを移す。 注：これらのサンプルは、さらにanalysのために使用することができる神経栄養因子のためのELISAを実行することによってである。 </li><li> （詳細は下記を参照のこと）などのKi67の細胞増殖アッセイまたはヨウ化プロピジウム生/死染色アッセイなどの追加アッセイ用培養したMSCを96ウェルプレートを準備します。 </li><li> セクション5以下で説明するように、細胞遊走/細胞追跡用のタイムラプスイメージング解析を行う。 </li></ol></li></ol> 3. Ki67の細胞の増殖およびヨウ化プロピジウムライブ/デッドアッセイ<ol><li> Ki67の細胞増殖アッセイ（免疫細胞化学） <ol><li> 0.1 Mリン酸（PO 4）を有する細胞培養物は1分間2回リンスバッファー。室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で文化を修正。 PFAを削除し、7分3回PBSでウェルをすすぐ。 </li><li>最後のすすぎの後、各ウェルに遮断溶液100μl（リン酸緩衝生理食塩水、5％正常ロバ血清、0.4％ウシアルブミン血清及び0.2％トリトンX-100）を追加ND 1時間室温でインキュベートする。 200：1の作業割合でブロッカー溶液中で希釈することにより、一次抗体、ウサギ抗Ki67のを準備します。 </li><li>ブロッカー溶液を除去し、各ウェルに一次抗体溶液100μlを適用します。 96ウェルプレートをカバーし、4℃で一晩、サンプルをインキュベートする。 </li><li>翌日、抗体溶液を除去し、7分、3回PBSですすぎます。 </li><li> 500：1の加工率​​でブロッキング溶液中で二次抗体、ロバ抗ウサギCy3のを準備します。 100：1の希釈で二次抗体溶液にDAPI核染色を追加します。最後のPBSリンスを除去した後、各ウェルに二次抗体/ DAPI溶液100μlを加える。 90分間、室温、暗所でインキュベートする。 </li><li>二次抗体/ DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 </li></ol></li><li> Propidiumヨウライブ/デッドアッセイ<ol><li>後述のようにヨウ化プロピジウム（PI）排除アッセイによって細胞死を測定する。 </li><li>培養培地中の1.5μMの濃度のヨウ化プロピジウム染色液を準備します。 </li><li>それらの細胞を死滅させることを意図して、2分間MSCの1ウェルに70％エタノールを100μlを追加します。この井戸は、PI染色の陽性対照として役立つ。 MSCの大部分は、PI染色細胞死を示すであろう。エタノール溶液を除去します。 </li><li>各ウェルに、ヨウ化プロピジウム染色溶液100μlを加え、5％CO 2インキュベーター中で37℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 1分、2回の0.1 Mリン酸緩衝液で細胞をリンスする。室温で20分間、0.1M P0 4バッファに4％PFAを用いて細胞を固定してください。 PFAを削除し、7分間PBSで3回すすいでください。 </li><li>室温で1時間遮断溶液中に希釈されたDAPI溶液（1:50）でインキュベートする。で全てのウェルをすすぐ7分間、PBS、3回。 </li><li> DAPI溶液を除去し、7分間PBSで各ウェルをすすぎ、3回。画像化されるまで4℃で96ウェルプレートおよびストアをカバーする。 </li></ol></li></ol> 4.自動イメージングと多波長スコアリング分析<ol><li> 96ウェルプレートをロードHCSシステムに（以前のKi67免疫標識またはヨウ化プロピジウム染色のために処理される）、20分のHCSシステムの画像収集および解析ソフトウェアを開き、プレートを平衡化させる。 </li><li>細胞は自動露出機能を利用して存在し、関心のある各波長のオフセットを計算したZ-プレーンを探す1でビニングカメラと2のゲイン設定を使用して、10倍の対物レンズの取得設定を選択します。この分析のために、DAPI（W1）、Cy3で（W2）、およびFITC（W3）のための画像をキャプチャ。陰性対照ウェルは、画像取得のためのシグナルを示さないが​​できる最大強度レベルを選択する。この設定は、POSに適して確認してくださいitive井戸。 </li><li>プレートを取得。画像をキャプチャし、画像取得と解析ソフトウェアのデータベースに格納します。 </li><li>画像いったん上記取得した画像から、オープン画像収集と分析、オフラインのソフトウェアとレビュー版データを取得されている。 </li><li>多波長スコアリング分析を選択します。各波長の最小値と最大強度を設定します。 注：DAPI検出は各可視核の周りに染色をマークする必要があります。 Cy3では、Ki67の免疫反応性（IR）で陽性の細胞を検出する必要があり、負のコントロールの下でIRを検出しないでください。 Cy3のKi67のIRについては、おおよその最小幅は7であった、おおよその最大幅は30であった、地元のバックグラウンドを超える強度が150グレーレベルであり、最小染色面積は、50μm2であった。 </li><li>すべてのポジションのために分析を実行します。スプレッドシートに表示するデータをエクスポートします。 </li></ol> 5.細胞追跡<ol><li>オープン画像acquisitionおよび解析プログラムとをクリックして「レビュープレートデータ[DB] ...」は、目的のプレートを選択する。 </li><li> &quot;まあ対時間」としてデータを表示します。 </li><li>所望の選択を左クリックして、「サイト」セクションからのサイトのいずれかを選択します。選択して下の &quot;...送信された「&quot;波長： &quot;。右96ウェルプレートテンプレートでよくターゲットをクリックして、「ロードイメージ」をクリックしてください。 </li><li> &quot;アプリ&quot;とし、 &quot;トラック·オブジェクト」をクリックすることで、細胞を追跡します。 </li><li> 例えば 、Microsoft Excelのデータをエクスポートする形式を選択して「ダイナミックデータエクスチェンジ（DDE）」を使用してください。 </li><li>起源、デルタxとデルタyに例えば輸出、 経過時間、オブジェクト番号、距離、時間間隔、速度、絶対角度、距離に追跡データを選択する。 </li><li>標的細胞上の「Ctrlキー+左クリック」で関心の各セルにタグをつける。 </li><li>トラック細胞。必要に応じて、停止/「ESC」キーを用いて細胞の不適切な追跡を変更し、設定を調整します。 </li><li>細胞追跡が完了したら、「ログデータ」を使用してデータを保存します。 </li></ol>

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成体間葉系幹細胞（MSC）は、細胞および遺伝子送達に基づく治療を組み合わせる実験戦略の開発のための魅力的な細胞型である。 MSCは17,18のパラダイム/差別適切な誘導と神 ​​経細胞とグリア系統に分化転換、中胚葉系統の細胞に分化することができる多能性であり、かなりの可塑性を表示する。また、MSCは、神経変性状態19を含む多数の障害について、前臨床試験に移植し、有効であることが証明されました。 MSCの治療効果は十分に起因20有益な抗増殖性、抗炎症性および抗アポトーシス活性には公知である。 MSCはまた、おそらく、損傷または疾患21の部位に移植後のナイーブのMSCに関連付けられた神経保護の質に寄与する、種々の神経栄養および成長因子を産生および分泌することが知られている。 IMPOrtantly、MSCは、遺伝的に結合された細胞および遺伝子療法ベースのアプリケーションのための神経栄養因子の持続送達のために修飾することができ、CNS 11,19,22に対する損傷または疾患の多くの動物モデルにおいて使用されている。 組み合わせた細胞および遺伝子療法ベースの戦略を開発するには、細胞の健康状態を注意深くインビトロそれらの広範な使用の前に、特にインビボ適用において評価することが重要である。コンセプトの証明として、我々は高いコンテンツスクリーニング（HCS）のアプローチを用いて、細胞の健康とフィットネス上の遺伝子改変の影響を研究するために設計さと制御MSCラインの複数の集団を調査した。一般的には、HCSは、細胞画像ベースのハイスループットスクリーニング14を指す。このスクリーニングアプローチは、空間の複数のレベル（日ミリ秒）（細胞内への細胞）および時間的なRESでの細胞表現型の定量的評価を可能にするさまざまな実験条件間でolution。細胞増殖、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現、細胞死、及び細胞運動/移動：このアプローチを用いて、我々は次のパラメータに基質選択の可能性の違いにアクセス。実験は、96ウェル細胞培養プレートフォーマットで設計した。単板の中で、私たちが日常的レンチウイルス形質導入細胞の異なるMSC集団の各パラメータに関して、可能な基板関連の違いを調査し、オリジナルと設計のMSC、非形質導入MSCを比較した。これは、直接タイムラプスデジタルイメージングを行うことにより、ヨウ化プロピジウム染色を用いKi67の免疫標識、生/死細胞生存率アッセイを使用して、細胞増殖のようなインビトロアッセイのバッテリ、および、細胞の挙動と異なるMSC亜型の結果を比較するための手段を提供。 1はまた、個々のワットから収集馴化培地サンプルにELISA法を実行することができます。このHCSの延長として定量的神経栄養因子の分泌を決定するためのエル。異なるMSCサブタイプからの条件培地もまた、分泌因子11,23の生物学的活性を決定するためのin vitroバイオアッセイにおいて使用することができる。 HCSプラットフォームのこのタイプは、一次ニューロン培養神経幹細胞株24からの神経突起伸長のインビトロ測定のために使用することができる。全体として、我々の結果は、遺伝的に改変されたMSCの亜集団は、非修飾のMSCと比較して類似した挙動を示すことを実証した。細胞増殖および細胞遊走に対する多様な培養基質の影響は劇的にMSC亜型間で異なるだけでなく、培養基質ではなかった。このように、試験された細胞外マトリックス基質は、これらの異なる設計されたMSCのための細胞の挙動のこれらの側面の調節に重要な役割を果たしているようには見えなかった。 この研究は、differen分析するためのHCSシステムの使用を示す細胞の挙動の側面をトン。しかしながら、画像解析に関連する制限に遭遇することは珍しいことではない。機会に、蛍光画像を分析しながら、それが免疫標識または陽性に染色/標識のように染色した細胞をカウントされるであろう上記の正確な閾値を決定することがやや困難であった。したがって、主観的なバイアスを最小にするために、閾値の決定は、対照と比較して（蛍光イメージングのための陰性対照は、一次または二次抗体の省略によって、すべての処理中に並行して実施した）に依存した。別の制限は、時間の経過デジタル画像を使用して、細胞移動の解析中に発生しました。いくつかのケースでは、イメージングソフトウェアは、実際には非常に短い距離を移行細胞対細胞のランダムなブラウン運動を区別することができなかった。追加の制限が解析ソフトウェアはmultipの存在を区別することができませんでした状況で明らかであった一互いに非常に近接ル細胞。この制限を克服するために、分析ではなく、完全に自動化された分析の間に手動のセル選択を必要とした。細胞播種密度はまた、互いから分離して成長する細胞に対する塊中で増殖するより大きな嗜好を示す細胞の集団間の細胞遊走データスキューをもたらすことができる。違いこれらのタイプは、おそらく部分的には、細胞 - 細胞の環境に対する細胞 - 基質の反射である。 画像を取得し、データ分析を実行するためにHCSシステムを使用して、複数のセルパラメータを評価するための効率的かつ迅速な手段を提供する。また、30の異なる条件（6基質と5種類のMSCのサブタイプ）のためのタイムラプスデジタルビデオは、日常的に環境室を使用しながら、時間から日間（48時間）の範囲の期間に取得した。このデータは、その後、別のECM上で種々の細胞株を横切る細胞の移動速度の差を計算し、決定するために使用された分子。 本報告書では、細胞の健康と機能を評価するために、高コンテンツスクリーニングプラットフォームの実装を強調している。このタイプの分析は、有向細胞成長および神経再生を促進するために、細胞型、ならびにポリマー基板を設計するための合理的な戦略を開発するために有用である。これは、細胞移植戦略を用いてインビボ前臨床研究における従来広範囲の治療因子の幹細胞ベースの送達の応用に向けて不可欠なステップである。

神経系障害の治療のために有用な治療法を実施するの主な問題は、さらに変性を防止し、また、機能の回復を促進する効果的な方法を開発することである。革新的な戦略は、移植前に神経保護因子の産生のために、遺伝子操作幹細胞のex vivoである。遺伝子治療のタイプと結合し、細胞ベースの治療法の組み合わせは、神経系の疾患または損傷誘発性神経細胞死の治療のための強力な方法を提供する。 神経栄養因子は、成熟した神経細胞の成長と発達ニューロンの生存だけでなく、メンテナンスや可塑性のために必須である。多くの研究は、中枢および末梢神経系（CNSおよびPNS）のニューロンの初期の成長および分化を促進する神経栄養因子の重要な役割を実証しており、それらはまた、 インビトロおよび内再生を刺激することができる神経損傷1のニマルモデル。脳由来神経栄養因子（BDNF）は、高度にCNSで発現され、神経発生、シナプス可塑性および修理2の調節に重要な役割を果たしている。グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）は、ドーパミン作動性及び運動ニューロン3を含む神経細胞の多くのタイプの生存を促進する。したがって、神経修復のための重要な戦略は、神経系の損傷したまたは罹患した領域に神経栄養因子の外因性の供給源を提供することにある。 多能性骨髄由来の間葉系幹細胞（MSC）は、損傷または罹患した神経系を治療するための治療用タンパク質の送達のための大きな可能性を保持する。彼らは、2）多能能力、3）少し倫理的な問題、4離およびメンテナンス1）相対的な容易さを含む多くの利点を有するので、MSCの移植は、患者の互換性の細胞ベースの治療法を開発するための努力に大きな注目を集めている）移植と自家移植の4,5のため5）潜在的な以下の生き残りと移行する機能。有望な結果は、脊髄損傷6,7、ストローク8,9、ミエリン欠損10、及び網膜変性11-13を含む様々な神経変性状態の数の動物モデルにおけるナイーブおよび遺伝子操作されたMSCの使用が報告されている。遺伝子操作された幹細胞からの神経栄養因子の送達と細胞移植を結合する新規かつ重要な神経修復のストラテジーである。 細胞ベースの治療因子の送達システムを開発する上で必須のステップでは、操作された細胞の正常な健康状態を決定することである。このように、本研究の主な目的は、遺伝子操作された成体幹細胞の一般的な成長パラメータを評価することであった。急速に複数のセルパラメータを評価するための重要なアプローチは、細胞の画像に基づくハイスループットscreeninを使用することであるG（HTS）、しばしば高いコンテンツスクリーニング（HCS）手順14と呼ばれる。この技術は、自動化された画像取得および解析を可能にし、このアプローチは、幹細胞研究用途に特に適している。本プロジェクトでは、HCSシステムを採用した遺伝子操作した成体幹細胞と細胞基質の好みや細胞機能の迅速な特性評価と最適化が可能プロファイリングプラットフォームを開発しました。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>ImageXpressで使用するために選択された96ウェルプレート</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗Ki67抗体</td><td>Abcam(マサチューセッツ州ケンブリッジ)</td><td>Ab16667</td><td>1:200希釈コラーゲン</td></tr><tr><td>I型</td><td>Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)</td><td>C7661</td><td>ラットテール</td></tr><tr>由来のコラーゲン<td>DAPI</td><td>Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td><td>Jackson Immuno Res Lab (ペンシルベニア州ウェストグローブ)&nbsp;</td><td>711-165-152</td><td>1:500希釈ECL</td></tr><tr><td>(エンタクチン-コラーゲン-ラミニン)</td><td>ミリポア/ケミコン(カリフォルニア州テメキュラ)</td><td>08-110</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ハイクロン(ユタ州ローガン)</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>ハイクロン(ユタ州ローガン)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ケミストリーストア(アイオワ州エイムズ)</td><td>12003510</td><td>100%、200プルーフ</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(ニューハンプシャー州ハンプトン)</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>イスコーブs Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P285</td><td>For PO4buffer</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Scientific (ハンプトン、 NH)</td><td>P288</td><td>PO4バッファー用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco/Invitrogen (グランドアイランド、ニューヨーク州)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Laminine (マウス)</td><td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>成体C57BL/6マウスのマウスMSCs</td> 遺伝子<td>治療用Tulane Cent(ニューオーリンズ、ルイジアナ州)</td><td></td><td>骨髄から単離</td></tr><tr><td>遺伝子組み換えMSC(GFP、BDNF、GDNF、BDNF/GDNF)</td><td>これらの細胞は、私たちの以前の研究から得られました:Ye et al.(準備中)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常ロバ血清(NDS)</td><td>Jackson Immuno Res Lab(ペンシルベニア州ウェストグローブ)&nbsp;</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>O4042</td><td>4% PFA in 0.1 M PO4 buffer</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム (PI)</td><td>Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.05% (EDTA 1x)</td><td>Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's modified dulbecco's medium</td><td>Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)</td><td>12440&ndash;046</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリドーマ認定 FBS</td><td>ハイクロン (ユタ州ローガン)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>ハイクロン (ユタ州ローガン)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress マイクロ</td><td>分子デバイス (カリフォルニア州サニーベール)</td><td>ImageXpress マイクロ</td><td>ハイコンテントスクリーニングシステム</td></tr><tr><td>MetaXpress 4.0</td><td>分子デバイス (カリフォルニア州サニーベール)</td><td>MetaXpress 4.0</td><td>画像取得と解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

骨髄由来の骨髄由来の葉系幹細胞(MSC)は強力な細胞資源であり、さまざまな疾患を治療するための戦略を開発するための潜在的な候補として多くの研究で使用されてきました。この研究の目的は、損傷したまたは病気の神経系を救うための神経保護戦略の一環として、治療因子の送達用に設計された細胞媒体としてMSCを開発し、特徴付けることでした。本研究では、脳由来神経栄養因子(BDNF)またはグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)をコードするレンチウイルスベクターを用いて遺伝子改変したマウスMSCと、緑色蛍光タンパク質(GFP)を併用しました。
>jove_content<in vivo移植研究を進める前に、遺伝子改変が正常な細胞の挙動の側面を変化させるかどうかを判断するために、操作された細胞を特徴づけることが重要でした。遺伝子組換えMSCの4つの亜集団の細胞接着、増殖、生存、および細胞移動をサポートする能力について、さまざまな培養基質を調べました。ハイコンテントスクリーニング(HCS)を実施し、画像解析を実施しました。
検査された基質には、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニン、エンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン(ECL)が含まれていました。Ki67免疫標識は細胞増殖の調査に使用され、ヨウ化プロピジウム染色は細胞生存率の調査に使用されました。 タイムラプスイメージングは、ハイコンテントスクリーニングシステム上で透過光/環境チャンバーシステムを使用して実施されました。
私たちの結果は、遺伝子組み換えMSCの異なる亜集団が、元の非改変MSCのそれと一般的に匹敵する同様の振る舞いを示したことを示しました。細胞増殖および細胞遊走に対する異なる培養基質の影響は、異なるMSCサブタイプおよび培養基質を比較したグループ間で劇的に異なる差はありませんでした。
この研究は、神経系の救助と修復のための長期の生体内移植研究に適用する前に、操作された幹細胞とその振る舞いを迅速に特徴付けるための実験的戦略を提供します。

MSCの成長パラメータは、異なる基板上のMSCの異なる集団を培養することによって調べた。 MSCのサブタイプ（MSCは、GFP-MSCは、BDNF-GFP-MSCは、GDNF-GFP-MSCを、及びBDNF / GDNF-GFP-MSCの）5つの異なる集団は異なるでプレコーティングした96ウェル組織培養プレートに播種した図1に示すように、基板は、培養の4日後、プレートを固定し、免疫標識および/ ​​または適切な試薬を用いて染色した後、HCSシステムを用いて検査し、画像取得及び解析ソフトウェアプログラムを用いて行われた分析。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> 図1：実験計画のために96ウェルプレートテンプレート 96ウェルプレート、種々の基材、ウェルをコーティングしたテンプレートに示すように操作された幹細胞を播種した。は 。例として、唯一のwel行BFにおけるlsがこの実験に使用した。列A、GおよびHは空のままにした。略語 - MSCは：間葉系幹細胞; GFP-MSCは：緑色蛍光タンパク質を発現するMSCを。 BDNF-GFP-MSCの：脳由来神経栄養因子-GFPを発現するMSCを。 GDNF-GFP-MSCの。グリア細胞由来神経栄養因子-GFPを発現するMSCを。 BDNF / GDNF-GFP-MSCの。 BDNFおよびGDNF- GFP発現MSCを。 ECL：エンタクチンコラーゲンIV-ラミニン）。 DAPI対比続く抗Ki67の免疫標識は、異なる基板が操作されたMSC（ 図2A）の異なる集団の増殖に影響を与えたかどうかを評価するために使用した。のKi67抗原の発現は、細胞周期のG 1、S、G 2及びM後期段階の間に優先的に発生し、休止期にある細胞（G 0）が検出されなかったので、増殖15に対する細胞マーカーとして有用である。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）は、一般的に使用されるニューあるDNA 16の領域にに結合すると青色の蛍光を発する明確な染色体対比。フィールド内の細胞の総数は、DAPI染色された核の数を数えることによって決定することができる。 図2Bに示されるように増殖したMSCの割合のばらつきがあったが、全ての基板にもかかわらず、MSCサブタイプのそれぞれについて、かなりの細胞増殖を支持した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> 図2：Ki67の細胞増殖アッセイ。 Ki67の免疫標識の（A）合併、二重蛍光画像（赤）およびDAPI（青色）核染色。 MSCの多くは、Ki67抗体（赤）で免疫標識した。 Ki67についてのパーセンテージを示すスケールバー=50μmである。（B）棒グラフは、ポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、コラーゲン上で増殖させたMSCのサブタイプを免疫標識私は、ラミニン、またはエンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン、in vitroで 5日間（ECL）基質（DIV）を入力します。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから8画像化サイトから平均プールされたデータを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ヨウ化プロピジウム（PI）染色は、異なる基質が細胞生存率（ 図3）の影響を受けるかどうかを評価するために使用した。ヨウ化プロピジウムは、一般的に使用される赤色蛍光核染色体の対比である。ヨウ化プロピジウムは、膜非透過性であり、一般的に、生細胞から排除され、したがって、集団中の死細胞を検出するのに有用である。フィールド内のすべてのセルを識別するようDAPIなどの一般的な核のラベルと組み合わされた場合、与えられた条件の中の死細胞の割合を決定することができる。 PI陽性細胞の割合は、（試験した全ての基板上に低かった図3）。 PI試薬の陽性対照として、MSCを含む、いくつかのウェルは、70％エタノール中で、図3B及び図3Cに示すように、PI標識細胞の高い割合をもたらし、ほとんどの細胞を死滅させることが知られている条件でインキュベートした（エタノール、正扱わコントロール）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> 図3：ヨウ化プロピジウムは、細胞死アッセイ。 （A）合併、ヨウ化プロピジウム（赤）およびDAPI（青）染色のための二重蛍光画像。生存細胞の全ての核をDAPI（青色）で染色されたが、全くヨウ化プロピジウム染色はMSCが検出されなかった。（B）実質的に全てのMSCは、70％エタノールに暴露した後、ヨウ化プロピジウムで染色した。 A中のスケールバー、B =100μmである。ヨウ化プロピジウム（PI）のパーセンテージを示す（C）棒グラフは、染色されたMSCのサブタイプポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、 インビトロ （DIV） で 5日間コラーゲンタイプI、ラミニン、またはエンタクチン、コラーゲンIV、ラミニン（ECL）基板上に成長させた。■。エタノール制御：この状態は、PI染色試薬の陽性対照として役立った。 PI染色以下のエタノール処理を施しほとんどの細胞は死んでいるので、積極的にPI試薬について染色である。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから8画像化サイトから平均プールされたデータを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 操作されたMSCの挙動に対する異なる基質の可能性のある影響を調べるために、細胞遊走は、（ 補足ビデオ1を参照）HCSシステムにタイムラプスデジタル顕微鏡および透過光/環境チャンバシステムを用いて分析した。複数のサイト/ウェルタイムラプスを画像化した画像取得及び解析ソフトウェアプログラムを使用して異なる基板上に成長したMSCの異なる亜集団のための細胞移動速度を計算するために使用される。 図4（c）に示すように、一般に、MSCの全てのサブタイプは、細胞外マトリックスでコーティングされた表面（フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンおよびECL）非コートポリスチレン表面上の最も遅い最速移動速度を示した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> 図4：細胞追跡および移行 MSCは、画像収集及び分析ソフトウェアで追跡。 29時間後、タイムラプスイメージングセッションの終了時でのタイムラプスイメージング及び（B）の（A）は、開始からの透過光と蛍光画像のオーバーレイされた画像は、（ 補足ビデオ1を参照のこと）。細胞遊走トラック着色李によって示されのNE。スケールバー：ポリスチレン（PS）、ポリ-L-リジン（PLL）、フィブロネクチン、I型コラーゲン、ラミニン上で増殖させたMSCの亜型についての平均移動速度を示す50μmの（C）バーグラフ（ミクロン/時間で表される）、またはエンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン、in vitroで 2日間（ECL）基質（DIV）。 Nは、一つの実験を=。各バーは、各条件のための2つのウェルから少なくとも10撮像されたセルの平均を表している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> まとめると、これらの結果は、遺伝子操作されたMSCのこれらの亜集団は、類似の増殖特性を表示するという予備的証拠を提供する。これらの結果は、これらのMSCの遺伝子改変を仲介するレンチウイルスは、このスクリーニングプラットフォームを用いて調べ成長パラメータには劇的な検出可能な有害な作用を誘発しないことを説得力のある証拠を提供する。 補足ビデオ画像取得と解析ソフトウェアプログラムを使用して、MSCの追跡の1。タイムラプスデジタルビデオ。 [1（緑のトラッキングライン）として示され、2（ブルートラッキングライン）] 2のMSCの移行パスのが示されている。ビデオは29時間の期間中に捕獲した。画像は5分ごとに捕獲された。 GFPを発現するMSCの蛍光画像は、ビデオの調製においてタイムラプスイメージングのために使用した。 =50μmのキャリブレーションバー。このタイプの分析は、細胞移動および細胞分裂を含む、細胞の挙動を研究するために有用である。

この研究は、人工幹細胞とその振る舞いを迅速に特徴づけるための実験プラットフォームを、神経系の救助と修復のための長期の生体内移植研究に適用するためのものです。

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

この手順の全体的な目標は、ハイコンテントスクリーニングまたはHCSシステムを使用して、遺伝子組み換え幹細胞を迅速に特性評価することです。これは、最初に96ウェルプレートの実験を設計および準備し、次に操作された幹細胞のさまざまな集団をプレーティングすることによって達成されます。次に、ハイコンテントスクリーニングシステムをライブセルイメージング用に準備し、その後、所望の時間でタイムラプスイメージングを開始します。次に、タイムラプスイメージングが完了した後、培養プレートは、ヨウ化プロピジウム、細胞死のための染色、または細胞増殖を特徴付けるためのKI67免疫標識などの細胞染色手順のために調製されます。最後に、96ウェルプレートをハイコンテントスクリーニングシステムにリロードして、蛍光イメージングと画像取得を行います。最終的に、画像解析ソフトウェアを使用して、さまざまな細胞増殖パラメータを決定するためのデータ解析を行います。この方法論は、幹細胞の分化を刺激する因子の同定や特性評価など、幹細胞生物学の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の意味するところは、in vivoで使用される前に細胞タイプを特徴づけることが重要であるため、細胞ベースの治療戦略にまで及びます。この方法は、細胞の挙動に関する洞察を得ることができ、培養でよく増殖する他のほぼすべての細胞タイプに適用できます。さらに、これらのアプローチは、ゼブラフィッシュの幼生などの生物全体に使用できる可能性があります。まず、ここに示すように、滅菌培養フードの下で検査するさまざまな基質と細胞タイプを概説する96ウェルプレートのマップを作成します。さまざまな基材と96ウェルプレートを備えたワークステーションを準備します。マップに従って、それぞれに100マイクロリットルの基質溶液を追加します。次に、マウス間葉系幹細胞を分離し、テキストプロトコルに従ってレンチウイルスベクターに感染させた後、パーフィルのストリップを使用して蓋を密封し、摂氏4度で一晩保存し、96ウェルプレートから基質溶液を取り出し、約200マイクロリットルの滅菌PBSを使用してウェルを2回洗浄します。最終すすぎを200マイクロリットルの細胞培養培地で除去したら、細胞培養インキュベーター内のプレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で平衡化します。その間、無菌条件下で、まず、フラスコから15ミリリットルの円錐管に成長培地(現在は馴化培地と呼ばれている)を収集してMSCを収穫します。次に、8ミリリットルの滅菌PBSをフラスコに加え、緩衝液を吸引する前に穏やかに渦巻きますフラスコから細胞を切り離すには、0.05%トリプシンと0.01%EDTA溶液を1ミリリットル加えます。細胞が分離したら、8ミリリットルの馴染培地を加えてから、細胞懸濁液を回収し、ウェルあたり約300個の細胞で細胞を再播種します。テキストプロトコルに従って、プレートを2時間インキュベートして、細胞がインキュベートしている間にMSCが基質に付着できるようにします。HCSシステムを起動し、平衡化するまで2時間待ちます。環境コントローラーを摂氏37度に設定し、空気中に5%の二酸化炭素を含む混合ガスボンベを、一定の空気源を供給する環境チャンバーであるHCSシステムに慎重にオンにします。次に、2時間のインキュベーション期間の後、96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、HCSシステムの環境チャンバーに直接入れます。プレートを30分間平衡化させた後、ソフトウェアを起動してプレート設定を構成します。イメージングパラメータを設定したら、テキストプロトコルに従って、レーザーオートフォーカスを使用してウェル底に焦点を合わせ、複数のサイトと複数のウェルからテスト画像を撮影して、最適化された焦点面を見つけます。ピントが合ったら、60 個のウェルすべてについて、5 分ごとに 48 時間にわたって画像のキャプチャを開始します。実験の最後に、無菌条件下でHCSシステムから96ウェルプレートを取り外し、各ウェルから調整培地サンプルを採取し、それらを新しい96ウェルプレートに移します。これらのサンプルは、後でELIZAがKI 67細胞増殖アッセイを実施するために使用できます。0.1モルリン酸緩衝液を使用して、細胞培養物を1分間すすぎます。洗浄を繰り返した後、4%パラホルムアルデヒドまたはPFAを室温で20分間使用し、固定後の培養物を固定します。PFAを取り出し、PBSを使用してウェルを3回、それぞれ7分間すすぎます。テキストプロトコールに従って細胞をブロックした後、それぞれに100マイクロリットルの一次抗体溶液を塗布します。プレートをしっかりと覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。細胞を7分間3回洗浄した後。洗浄のたびに、二次抗体を塗布します。細胞を暗所に置き、さらに3回の洗浄後、室温で90分間インキュベートします。プレートを覆い、イメージングするまで摂氏4度で保管します。自動イメージングを行うには、免疫標識プレートをHCSシステムにロードし、プレートを20分間平衡化させます。HCSシステムの画像取得および解析ソフトウェアを開きます。10 x 対物レンズの撮影設定を選択するには、カメラの曲げを 1 に、ゲインを 2 に設定します。自動露光機能を使用して、セルが存在するZ平面を見つけ、ここで示す分析の対象となる各波長のオフセットを計算します。DAP、EGFPおよびS3の画像をキャプチャします。ネガティブコントロールウェルが画像取得のシグナルを示さない最大強度レベルを選択します。ポジティブウェルにも同じしきい値設定を使用します。最後に、画像分析を実行する前に、画像をキャプチャしてデータベースに保存します。テキストプロトコルによれば、ここに示すように、MSCサブタイプの5つの異なる集団を、この図の異なる基質、増殖細胞を同定する抗KI67で予めコードされた96ウェル組織培養プレートに播種し、DAPIを使用して、ここに示すように、異なる基質が遺伝子操作されたMSCの異なる集団の増殖に影響を与えたかどうかを評価しました。 増殖するMSCの割合にはばらつきがありましたが、すべての基質は各MSCサブタイプについてかなりの細胞増殖をサポートしていました。このプロットは、集団内の死細胞を特定するヨウ化プロピジウムまたはPI染色を施した細胞の割合が、ほとんどの細胞を死滅させる70%エタノールで処理された細胞を検査したすべての基質で低いことを示し、高いPI標識率を示し、異なる基質上のMSCの挙動を調査するためのポジティブコントロールとして機能することを示しています。29時間にわたる細胞移動をタイムラプスデジタル顕微鏡を用いて解析しました。セル 1 とセル 2 の移行パスは、それぞれ緑と青の線でマークされています。ここに示すように、MSCのすべてのサブタイプは、細胞外マトリックス、コーティングされた表面で最も速い移動速度を示し、コーティングされていないポリスチレン表面で最も遅い移動速度を示しました。この手順を試行する際には、この手順に従って96ウェルプレートなどのマルチウェルプレートフォーマットの実験を慎重に計画および設計することを覚えておくことが重要です。Eliza Sのような他の方法は、その開発後に、操作された幹細胞による治療因子の産生および分泌に関する追加の質問に答えるために、条件培地上で実施することができる。ハイコンテントスクリーニング手順により、幹細胞生物学や創薬分野の研究者は、複雑な生物学的システムをハイスループットで探索する道が開かれました。

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医学

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この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

ここで外傷に影響を与えるに関連するタイム スケール上の 96 ウェル形式でストレッチ損傷の人間の in...

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。...

血液由来神経細胞のGMフリー生成

成熟したオリゴデンドロサイトに分化する胎児または成体の神経幹細胞に由来するアストロサイトとオリゴデンドロサイト前駆細胞の混合培養の生成と、有害刺激のインビトロモデリングについて述べています。細胞ベースの高含有スクリーニング技術との結合は信頼でき、強い薬物スクリーニングシステムを造る。...

胎児および成人神経幹細胞由来オリゴデンドロビテ前駆細胞培養の高含有スクリーニング分化と成熟解析

ヒト皮膚由来線維芽細胞を誘発ニューロン前駆細胞(iNIC)に再プログラムするプロトコルと、その後の誘導アストロサイト(iA)への分化について説明する。この方法は、iNPCとiAを大量に高速かつ再現可能に生成します。...

線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

ここでは、成体マウス脳室下ゾーンから単離された拡大神経幹細胞(NSC)における遺伝子導入効率を高めるように設計されたヌクレオフェクションシステムについて説明します。この知見は、この方法が神経幹細胞における遺伝子摂動を大幅に改善し、従来のトランスフェクションプロトコルの有効性を上回り、細胞の生存率を向上させることを示しています。...

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

ここでは、化学的に再プログラムされた幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させ、パーキンソン病のマウスモデルに移植し、移植された細胞の成功した統合と機能的有効性を確認するために、これらの細胞を正確なニューロン調節を達成するためのプロトコルについて説明します。...

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

学ぶ 高コンテンツスクリーニングを用いた遺伝子組み換え幹細胞の高速特性評価法。マウス間葉系幹細胞の増殖と分化因子を解析し、神経保護治療への応用可能性を示す。

神経保護戦略のための治療因子の送達のために設計成体幹細胞の高スループット特性評価

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