液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

この手順の全体的な目標は、抗菌特性を評価する目的で、サイズと組成を制御してナノ粒子コロイドを製造することです。この方法は、サイズ、形状、組成などの特定のナノ粒子特性が毒性に与える影響など、抗菌性ナノ粒子の開発における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、潜在的に危険な化学副産物がない場合に、さまざまな材料システムからナノ粒子を簡単に製造できることです。

この実験を実証するのは、学部生のマシュー・ラッティと、ラトガース・カムデンの教員であるジュリアン・グリーペンバーグです。50ミリリットルのガラスビーカー内に磁気攪拌子と多孔質アブレーションステージを配置して、アブレーション装置を組み立てます。ビーカーを磁気攪拌板に置き、攪拌板をXY並進ステージにセットして、アブレーション中にターゲットを移動できるようにします。

Nd:YAGレーザーを基本波長1,064ナノメートル、パルス持続時間5ナノ秒、パルス繰り返し周波数10ヘルツで動作するように設定します。レーザー出力およびエネルギーメーターでパルスあたりのエネルギーを測定します。250mmの焦点距離の収束レンズを使用して、アブレーションステージ上のターゲットの下のビームを集束させます。

銀ナノ粒子の合成では、まずマイクロバランスを用いて平坦な銀ターゲットを秤量し、アブレーション前の質量を求めます。次に、銀ターゲットを両面カーボンテープを使用して多孔質ステージに接着します。ビーカーに40ミリリットルのアブレーション液を追加します。

ターゲットからの液体の高さは11ミリメートルです。銀のターゲットをいくつかのレーザーパルスでアブレーションすることにより、スポットサイズを決定します。スポットサイズを測定するには、CCDカメラを搭載した光学顕微鏡で、アブレーションされたターゲットをマイクロメータスライドと一緒に観察します。

銀ナノ粒子を合成するためには、コンピュータ制御の電動XYステージを楕円形に楕円形に動かし、一定の攪拌下で毎秒0.42cmの速度で移動させ、ターゲットを20〜40分間アブレーションします。デカンテーションによりビーカーからナノ粒子溶液を収集します。ナノ粒子の紫外可視光スペクトルを測定することで、ナノ粒子の存在を確認します。

ナノ粒子溶液をアブレーション溶液中で1〜40に希釈することにより、動的光散乱を用いてナノ粒子の流体力学的直径を測定する。1センチメートルのプラスチックキュベットを使用する場合、希釈溶液の総量1ミリリットルが必要です。180度の測定角度を利用して、633ナノメートルの波長での光散乱を測定し、ストークス・アインシュタイン方程式に従ってナノ粒子の直径を決定します。

透過型電子顕微鏡を用いて、ナノ粒子溶液1〜40を二重蒸留水で希釈し、イメージングを妨げる可能性のある余分な添加物を除去し、ナノ粒子のサイズと形状を確認します。次に、2マイクロリットルの溶液を、Lacey薄膜でプレコートされた銅製TEMグリッドに滴下します。デシケーターで室温で一晩グリッドを乾燥させ、デシケーターでナノ粒子をイメージングする前に、テキストプロトコルで参照されているようにナノ粒子をイメージングします。

ナノ粒子濃度を計算するには、蒸留水を含む超音波処理水浴にターゲットを1分間置くことにより、アブレーションされた金属ターゲットから緩く付着したナノ粒子を取り出します。圧縮空気の流れの下でターゲットを1分間乾燥させます。次に、ミクロ天びん上のターゲットの質量を測定します。

ナノ粒子を同じアブレーション溶液中で1ミリリットルあたり100マイクログラムの最大濃度に希釈します。希釈したナノ粒子の15〜17ミリリットルを、攪拌棒を含む石英キュベットに移します。Nd-YAGレーザーシステムを使用して、25ピコ秒、532ナノメートルのレーザーパルスを生成します。

また、焦点距離75mmのレンズを使用して、レーザーを溶液の中心に集束させます。溶液を30分から数時間、所望のサイズに応じて照射します。ナノ粒子の抗菌特性を測定するには、まず大腸菌培養物を一晩成長させ、次にこれらを新鮮なLBで光学密度0.01に希釈します。ナノ粒子が添加剤を含むアブレーション媒体で合成された場合は、ナノ粒子を添加しても濃度が一定に保たれるように、それぞれの化学物質をLBに添加します。

次に、ナノ粒子を希釈した培養物に、0〜50マイクログラム/ミリリットルの範囲の濃度で添加します。摂氏37度でさらに2時間振とうしながら培養物を育てます。2時間のインキュベーション後、培養サンプルを新鮮なLBで1〜10個連続希釈します。そして、各希釈液の10マイクロリットルの滴をLBオーガープレートにスポットします。

液滴が吸収されたら、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、コロニー形成ユニットを数えます。ここで、液体中でパルスレーザーアブレーションによって生成されるナノ粒子は、その吸収スペクトルによって特徴付けられます。

銀ナノ粒子の紫外可視光スペクトルは、400ナノメートルの表面プラズモン共鳴波長に特徴的なピークを示します。ナノ粒子をさらに特徴付けるために、そのサイズ分布を透過型電子顕微鏡で測定します。大腸菌などの細菌をナノ粒子で処理すると、コロニー形成単位の測定によって決定される生存率が低下します。

細胞をポジティブコントロールとしてカナマイシンで処理した。銀ナノ粒子を受け取らない細胞は、界面活性剤が独立して毒性をもたらさないように、6ミリモルSDSの存在下で増殖したことに注意してください。習得すると、ナノ粒子は4〜5時間で生成および特性評価できます。

ナノ粒子の抗菌毒性の試験には、さらに24時間かかります。この手順を試行する際には、バッチ間の一貫性には、パルスエネルギーやレンズの位置などの詳細に細心の注意を払う必要があることを覚えておくことが重要です。この作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、適切な目の保護などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。