ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

このハイコンテント顕微鏡ベースの方法の全体的な目標は、ミトコンドリアの形態機能と活性酸素種の細胞レベルを同時に定量化し、さまざまな実験的摂動にさらされた細胞株の堅牢な酸化還元フィンガープリントを確立することです。この方法は、病原性疾患や複合処理が酸化ストレスを引き起こすかどうか、ミトコンドリアの形態と機能がどの程度影響を受けるかなど、酸化還元生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、すべてのパラメータを同じセル内で同時に測定できることです。

手順を開始するには、薄い連続ポリスチレンまたはガラスの底を持つ黒い96ウェルプレートの60の内側のウェルに8〜10,000のヒト真皮線維芽細胞を播種します。異なる条件、処理、または細胞株を使用する場合は、プレート上の播種位置を均一に分散させて、プレートの影響を最小限に抑えます。次いで、フォーカス調整に用いるウェルB01にさらに8〜10,000個の細胞を播種する。

その後、空の外側のウェルを培地で満たして、ウェルと環境の間の勾配を最小限に抑えます。プレートをインキュベーターに戻す前に、プレートを3回軽くたたいて、細胞がパッチ状に成長しないようにします。細胞を24時間、または70%の密度に達するまで培養します。

その後、実験の処理情報を setup というスプレッドシートに保存します。顕微鏡をセットアップするには、まずソフトウェアを使用してXYステージを校正します。次に、取得ソフトウェアを使用してマルチウェルプレートのイメージングプロトコルを作成します。

このプロトコルにより、96ウェルプレートの設定位置と選択したウェルを自動的に取得できます。次に、ソフトウェア内で提供される利用可能なプレートのリストから正しいタイプのマルチウェルプレートを選択します。または、プレートとウェルの寸法を使用してマルチウェルプレートの形式を定義します。

次に、4 つの外側のコーナー ウェルの 2 つのコーナーを定義して、ウェル プレートを位置合わせします。その後、取得する必要のあるウェルを選択し、シーケンシャル波長取得で構成される取得プロトコルを定義します。GFPチャネルが最初に設定されていることを確認してください。

次に、ウェルプレートループを定義して、定義された取得プロトコルを使用して、選択した各ウェルの中心付近に配置された、等間隔でオーバーラップしない4つの画像を取得します。このステップでは、CM-H2DCFDAとTMRMストック溶液をHBSS HEPESバッファーに添加して、60ウェルの染色溶液を調製します。次に、プレートを一気に逆さまにして細胞から培地を捨てます。

細胞をHHバッファーで2回穏やかに洗浄します。ピント調整に使用したセル付きのA01もお忘れなく。洗浄ステップの間にHHバッファーを廃棄します。

次に、各ウェルに100マイクロリットルの染色溶液を加えて、CM-H2DCFDAとTMRMを細胞にロードします。繰り返しになりますが、A01もお忘れなく。細胞を室温で暗所で25分間インキュベートします。

25分後、細胞を100マイクロリットルのHHバッファーで2回洗浄し、100マイクロリットルのHHバッファーを60個のインナーウェルすべてに加えます。実際の測定を行うには、プレートを顕微鏡に取り付けます。次に、ハードウェアベースのオートフォーカスシステムをオンにし、ウェルB01とTMRMチャネルを使用してオートフォーカスオフセットを調整し、鮮明な画像が得られます。

その後、イメージングプロトコルを実行します。結果として得られる画像データセットは、基礎ROSレベル、ミトコンドリア膜電位、およびミトコンドリア形態に関する情報を提供します。次に、誘導されたROSレベルを測定するために、96ウェルプレートを顕微鏡から慎重に取り外します。

各ウェルに40マイクロモルのTBHP溶液100マイクロリットルを加え、TBHPとCM-H2DCFDAが完全に反応するまで少なくとも3分間待ちます。この間に、100マイクロリットルの抗体ワーキング溶液をウェルA01に加えます。次に、プレートを顕微鏡に取り付け直し、ウェルB01を使用してピントを再度確認します。

次に、同じイメージングプロトコルを使用して、最初のイメージングラウンドと同じ位置を取得します。結果として得られる画像データセットは、誘導されたROSレベルに関する情報を提供します。次に、A01睠のフラットフィールド画像を取得します。

信号がダイナミックレンジ内に十分収まっていることを確認します。取得設定を調整する。その後、集録したデータセットを標準化された命名法を使用して、1つのフォルダに個別のTIFFファイルとしてエクスポートします。

これには、プレート、TBHP処理前またはTBHP処理後、井戸、フィールド、およびアンダースコアで区切られたチャネルへの参照が含まれます。また、フラットフィールド画像は、標準化された命名法を使用して、個々のTIFFファイルと同じフォルダーに保存します。このステップでは、画像処理ソフトウェアを開き、酸化還元メトリクスマクロセットをインストールします。

次に、セットアップインターフェースを開き、Sボタンをクリックして解析設定を行います。画像の種類、チャンネル数、フラットフィールド画像の取得に使用したウェルを選択します。その後、どのチャネルに細胞またはミトコンドリアが含まれているかを示します。

[背景]チェックボックスと[強化]チェックボックスをオンにして、背景の減算とコントラスト制限された適応ヒストグラムの均等化をそれぞれ実行します。次に、細胞のガウスとぼかし、ミトコンドリアのラプラシアン増強のシグマを定義します。自動しきい値処理アルゴリズムを選択し、サイズ除外制限を入力します。

次に、取得したデータセットの選択したいくつかの画像でセグメンテーション設定をテストします。これらの画像を開き、メニューの「C」ボタンまたは「M」ボタンでセルまたはミトコンドリアのセグメンテーションをそれぞれクリックします。その後、目的のフォルダのバッチ分析から、ハッシュボタンをクリックし、画像のあるフォルダを選択します。設定を確認し、[OK]を押します。

バッチ解析後、Vボタンをクリックし、画像のあるフォルダを選択することで、検証スタック上のセグメンテーションパフォーマンスを視覚的に確認します。検証スタックを調べて、セグメンテーションが成功したかどうかを確認します。抽出されたデータの初期分析は、無料のShinyアプリケーションを使用して自動的に行われます。

これにより、結果を迅速に解釈できます。開始するには、R Studio でアプリケーションを開きます。外部ブラウザでの実行を選択します。

入力ページで、結果ファイルが配置されているディレクトリを選択します。セットアップ ファイルもこのディレクトリに存在することを確認してください。結果ファイルとセットアップ情報は自動的にインポート、コンパイル、視覚化されます。

実験のセットアップ ページには、実験のレイアウトが表示されます。次のページには、ROSレベルと、各プレートのいくつかのミトコンドリアパラメータが個別に表示されます。ドロップダウンメニューを使用して視覚化するプレートを選択します。

データはマルチウェルプレート形式で表示されるほか、外れ値にウェル番号と画像番号でラベル付けされた箱ひげ図でも表示されます。結果全体の実験ページには、すべてのプレートを組み合わせた正規化された結果と、基本的な統計分析が表示されます。入力ページからドロップ ファイルが提供された場合、指定されたデータ ポイントは除外されます。

クラスター分析ページでは、主成分と 5 つのパラメーターからのデータの分析を使用して、感度の高い酸化還元プロファイルが構成されます。最後に、データのダウンロードページでは、処理および再配置されたデータを保存して、さらに使用できます。ここに示したのは、ヒトの経皮線維芽細胞をHIVプロテアーゼ阻害剤であるサキナビルで治療した実験の結果です。

記載されたプロトコルを使用して、基礎ROSレベルと誘導ROSレベルの両方について有意な増加が検出されました。対照細胞と比較して、DMSOで処理しました。サキナビルはまた、ミトコンドリアの形態機能にも有意な影響を与えました。

ミトコンドリアピクセルあたりの平均TMRMシグナルとして測定されたミトコンドリア膜電位は、有意に増加しました。さらに、ミトコンドリアは非常に断片化されたパターンを獲得し、個々のミトコンドリアのより高い真円性とより小さな平均サイズによって定量的に示されました。主成分分析を使用して前述のパラメータを組み合わせると、コントロール条件とサキナビル条件の両方を、酸化還元フィンガープリントによって互いに明確に区別することができました。

この手順を試みるときは、照明自体が酸化ストレスを引き起こすことを覚えておくことが重要です。したがって、曝露条件は最小限に抑え、実験全体を通して一定に保つ必要があります。習得すると、最大20枚の96ウェルプレートを1日で染色および取得できます。

2回目のイメージングラウンドの後、細胞を固定し、下流の免疫蛍光染色に使用できます。これにより、まったく同じセルで測定されるパラメータの数が増え、追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、接着細胞培養におけるROSとミトコンドリアの形態機能の組み合わせ測定を、ハイコンテント顕微鏡を用いて行えるようになるはずです。