ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

このハイコンテンツ顕微鏡ベースの手法の全体的な目的は、ミトコンドリアの形態機能と細胞内の活性酸素種レベルを同時に定量化し、さまざまな実験的摂動にさらされた細胞株の堅牢なレドックスフィンガープリントを確立することです。本手法は、病原性条件下または化合物処理によって酸化ストレスが誘発されるか、またミトコンドリアの形態と機能がどの程度影響を受けるかといった、レドックス生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、すべてのパラメータを同一の細胞内で同時に測定できることです。

手順を開始するために、薄い連続的なポリスチレンまたはガラス底を持つ黒色96ウェルプレートの60個の内側ウェルに、8,000～10,000個のヒト真皮線維芽細胞を播種します。異なる条件、処理、または細胞株を使用する場合は、プレート効果を最小限に抑えるため、播種位置をプレート上に均等に分散させてください。次に、焦点調整に使用するために、ウェルB01にさらに8,000～10,000個の細胞を播種します。

その後、ウェル間および周囲環境との勾配を最小限に抑えるため、外周の空のウェルに培地を満たします。細胞が部分的に凝集して増殖するのを防ぐため、プレートを3回軽くタッピングしてからインキュベーターに戻します。細胞を24時間、またはコンフルエンシーが70%に達するまで培養します。

その後、実験の処理情報をsetupという名前のスプレッドシートに保存します。顕微鏡をセットアップするには、まずソフトウェアを使用してXYステージのキャリブレーションを行います。次に、撮影ソフトウェアを使用して、マルチウェルプレート用のイメージングプロトコルを作成します。

このプロトコルでは、96ウェルプレートの設定された位置および選択したウェルの自動キャプチャが可能です。まず、ソフトウェア内で提供されている利用可能なプレートの一覧から、適切な種類のマルチウェルプレートを選択してください。または、プレートとウェルの寸法を用いてマルチウェルプレートのフォーマットを定義してください。

次に、外側の4つのコーナーウェルのうち2つのコーナーを指定して、ウェルプレートの位置合わせを行います。その後、取得が必要なウェルを選択し、連続波長取得で構成される取得プロトコルを定義します。GFPチャンネルが最初に設定されていることを確認してください。

次に、定義した取得プロトコルを用いて、選択した各ウェルの中心付近に配置される、重なりのない4枚の等間隔の画像を撮影するためのウェルプレートループを定義します。このステップで、CM-H2DCFDAおよびTMRMストック溶液をHBSS HEPESバッファーに添加し、60ウェル分の染色溶液を調製します。次に、プレートを一度の滑らかな動作で逆さまにし、細胞から培養液を捨てます。

細胞をHHバッファーで2回緩やかに洗浄します。フォーカス調整に使用した細胞が入っているウェルA01を忘れないようにしてください。洗浄ステップの合間にHHバッファーを廃棄します。

次に、各ウェルに染色液を100 µLずつ添加し、CM-H2DCFDAおよびTMRMで細胞をロードします。ここでも、ウェルA01を忘れないようにしてください。室温、暗所で25分間細胞をインキュベートします。

25分後、100 µLのHH緩衝液で細胞を2回洗浄し、60個の内部ウェルすべてに100 µLのHH緩衝液を加えます。実際の測定を行うために、プレートを顕微鏡にセットします。次に、ハードウェアベースのオートフォーカスシステムをオンにし、ウェルB01とTMRMチャネルを用いて、鮮明な画像が得られるまでオートフォーカスオフセットを調整します。

続いて、イメージングプロトコルを実行します。得られた画像データセットにより、基底状態のROSレベル、ミトコンドリア膜電位、およびミトコンドリア形態に関する情報を得ることができます。次に、誘導されたROSレベルを測定するため、96ウェルプレートを顕微鏡から慎重に取り出します。

各ウェルに40 µMのTBHP溶液を100 µL加え、TBHPがCM-H2DCFDAと完全に反応するまで少なくとも3分間待機します。この間に、ウェルA01に抗体ワーキングソリューションを100 µL加えます。その後、プレートを顕微鏡に再度セットし、ウェルB01を用いて焦点を確認します。

次に、最初のイメージングラウンドと同じイメージングプロトコルを用いて、同様の位置を撮影します。得られた画像データセットから、誘導されたROSレベルに関する情報を得ることができます。続いて、ウェルA01でフラットフィールド画像を撮影します。

信号がダイナミックレンジ内に十分収まっていることを確認してください。そのためには、取得設定を調整します。その後、取得したデータセットを、標準化された命名法を用いて個別のTIFFファイルとして単一のフォルダにエクスポートします。

これには、プレート、TBHP処理の前後、ウェル、視野、およびチャンネルへの言及が含まれ、それぞれアンダースコアで区切られています。また、フラットフィールド画像を、標準化された命名法を用いて個別のTIFFファイルとして同じフォルダに保存してください。このステップでは、画像処理ソフトウェアを開き、redox metricsマクロセットをインストールします。

次に、Sボタンをクリックしてセットアップインターフェースを開き、解析設定を行います。画像タイプ、チャンネル数、およびフラットフィールド画像の取得に使用したウェルを選択してください。その後、どのチャンネルに細胞またはミトコンドリアが含まれているかを示します。

「background（背景）」および「enhance（強調）」のチェックボックスを選択し、それぞれ背景減算とコントラスト制限適応ヒストグラム平均化を実行します。次に、細胞のガウシアンブラーおよびミトコンドリアのラプラシアン強調のためのσ（シグマ）値を定義します。自動閾値設定アルゴリズムを選択し、サイズ除外制限の範囲を入力してください。

次に、取得したデータセットからいくつかの画像を選択して開き、メニューのCボタンまたはMボタンをクリックして、それぞれ細胞またはミトコンドリアのセグメンテーション設定をテストします。その後、ハッシュボタンをクリックし、対象の画像フォルダを選択して、フォルダ内のバッチ解析を実行します。設定を確認し、OKを押してください。

バッチ解析の後、「V」ボタンをクリックして画像が含まれるフォルダを選択し、検証スタックでセグメンテーションのパフォーマンスを視覚的に確認します。検証スタックを順に確認し、セグメンテーションが成功したかを確認してください。抽出されたデータの初期解析は、付属のShinyアプリケーションによって自動的に行われます。

これにより、結果を迅速に解釈することができます。まず、R Studioでアプリケーションを開きます。外部ブラウザで実行することを選択してください。

入力ページで、結果ファイルが格納されているディレクトリを選択してください。このディレクトリにセットアップファイルが含まれていることを確認してください。結果ファイルとセットアップ情報は、自動的にインポート、コンパイルされ、視覚化されます。

実験セットアップページでは、実験のレイアウトが表示されます。次のページでは、各プレートごとのROSレベルおよび複数のミトコンドリアパラメータが表示されます。ドロップダウンメニューを使用して、可視化したいプレートを選択してください。

データはマルチウェルプレート形式のほか、外れ値をウェル番号および画像番号でラベル付けしたボックスプロットで表示されます。結果の全実験ページでは、すべてのプレートを統合した標準化結果が、基本的な統計解析とともに示されます。入力ページを通じてドロップファイルが提供された場合は、指定されたデータポイントが除外されます。

クラスター解析ページでは、5つのパラメータのデータに基づいた主成分分析を用いて、感度の高いレドックスプロファイルが作成されます。最後に、データダウンロードページで、処理および再編成されたデータを保存し、後で使用することが可能です。ここでは、ヒト真皮線維芽細胞にHIVプロテアーゼ阻害剤のサキナビルを投与した実験結果を示しています。

記載したプロトコルを用いた結果、基底レベルおよび誘導後の ROS レベルの両方において有意な増加が検出されました。DMSO で処理した対照細胞と比較して、サキナビルはミトコンドリアの形態機能にも有意な影響を及ぼしました。

ミトコンドリアのピクセルあたりの平均TMRM信号として測定されたミトコンドリア膜電位が有意に上昇しました。加えて、個々のミトコンドリアの円形度の増加と平均サイズの縮小によって定量的に示されるように、ミトコンドリアは高度に断片化したパターンを示しました。上述のパラメータを主成分分析を用いて統合したところ、コントロール群とサキナビル投与群は、そのレドックス指紋（redox fingerprints）によって明確に区別することができました。

この手順を行う際は、照明自体が酸化ストレスの原因となることに留意することが重要です。したがって、露光条件を最小限に抑え、実験全体を通して一定に保つ必要があります。この手法を習得すれば、1日で最大20枚の96ウェルプレートの染色および画像取得が可能です。

2回目のイメージングラウンドの後、細胞を固定して、後続の免疫蛍光染色に使用することができます。これにより、同一の細胞において測定されるパラメータ数を増やし、さらなる疑問の解消が可能になります。このビデオを視聴した後、ハイコンテンツ顕微鏡を用いて、接着細胞培養におけるROSとミトコンドリアの形態機能の複合測定ができるようになるはずです。