Name: ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング手法。蛍光レポーターでROSとミトコンドリア形態機能を同時定量し、ヒト真皮線維芽細胞で実験条件ごとの酸化ストレスとミトコンドリア健康状態を評価する。

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この研究は、アントワープ大学(TTBOF/29267, TTBOF/30112)、ゲント大学特別研究基金(プロジェクトBOF/11267/09)、NB-Photonics(プロジェクトコード01-MR0110)、オランダ科学研究機構(NWO;いいえ:CSBR09 / 013V)。この原稿の一部は、Springerの許可を得て、別の出版物1から改作されています。著者らは、広視野顕微鏡の支援についてGeert Meesenに感謝します。

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<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).</li>
<li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li>
<li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-GEN+SUBJECTS%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li>
<li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II%2C+III%2C+IV+and+V%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-BIOENERGETICS%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li>
<li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+deficiency%3A+radical+changes+in+mitochondrial+morphology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li>
<li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li>
<li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li>
<li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17066472">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &#34;,7 -&#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li>
<li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li>
<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
<li>Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuiderveld%2C+K+%22Graphics+gems+IV%22">Graphics gems IV</a>. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).</li>
<li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+W+%22shiny%3A+Web+Application+Framework+for+R.+R+package+version+0.14.2%22">shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2</a>. , 
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<li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v064i09">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li>
<li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4%28%2B%29+T-cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li>
<li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype%3A+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li>
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<li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li>
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<li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li>
<li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+drug+development+technologies%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益または他の利益相反はないと述べている。対応する著者はまた、すべての著者がすべての利益相反を開示するよう頼まれていることを保証する。

本稿では、NHDFにおける細胞内ROSレベルとミトコンドリア機能の同時定量化のための高含量顕微鏡法について述べる。その性能は、SQV処理NHDFに関する事例研究によって実証された。この結果は、19,20,21,22,23,24,25の別個の実験ではあるが、1型HIVプロテアーゼ阻害剤による治療後に、ROSレベルまたはミトコンドリア機能障害の増加が観察された文献からの以前の証拠を裏付けている。重要な違いは、記載されたアッセイが形態細胞データと共に同じ生きた細胞内でこれらのパラメータを同時に測定できることである。このアプローチの主な利点は、スペースとtの両方の要素を明確に決定することですこれは、因果関係を正確に示すことができます。特定の摂動の敏感なレドックスプロファイルを生成することを可能にする主成分分析が行われる。しかし、より高度なデータマイニング技術および（監督された）クラスタリングアルゴリズムを、予測されるレドックスプロファイリングを可能にするために抽出されたデータに使用することもできる。これは、デジタル病理学における診断または予後分類ツール、ならびに治療標的のスクリーニングにおいて価値ある特徴であり得る。 例えば ...

<html>細胞内ROSの濃度は、ROS生成系とROS解離系との間の動的相互作用によってきめ細かく調節される。両者の間の不均衡が酸化ストレスの状態を引き起こす。 ROSの主要な供給源には、ミトコンドリア1がある。細胞内呼吸での役割を考えると、細胞内スーパーオキシド（O 2 ・ - ）分子の大部分を担っている2 。これは、主に強い負の内部ミトコンドリア膜電位（Δψm）、 すなわちミトコンドリア過分極の条件下での電子輸送鎖の複合体1でのO 2への電子漏出に起因する。他方、ミトコンドリアの脱分極は、複数の作用様式を指し示すROS産生の増加と相関している&gt; 6,7,8。さらに、核分裂融合機構のタンパク質のレドックス修飾によって、ROSはミトコンドリア形態を共調節する9。例えば、断片化は、ROS産生およびアポトーシスの増加と相関する10,11。繊維状ミトコンドリアは栄養飢餓および防御に関連しているミトファジー12 。細胞のROSとミトコンドリアの形態機能との複雑な関係を考えると、両者は理想的には生存細胞中で同時に定量されるべきである。これを正確に行うために、蛍光プローブCM-H 2 DCFDA（ROS）およびTMRM（ミトコンドリアΔΨmおよび形態学）で染色された付着細胞培養の自動化された広視野顕微鏡法および画像分析に基づいて、高含量画像アッセイを開発した。高含量イメージングとは、sp複数の相補的マーカーおよび自動画像解析を用いた細胞表現型に関する非同時期に豊富な（ すなわち 、多数の記述的特徴）情報。自動顕微鏡検査と組み合わせると、多くの試料を並行してスクリーニングすることができ（ すなわちハイスループット）、アッセイの統計力を高めることができます。実際、プロトコルの主な資産は、同一細胞内の複数のパラメータの同時定量化が可能であり、これは多数の細胞および条件についての定量化を可能にすることである。 プロトコルは8つの部分に分かれています（以下のプロトコールで詳細に説明されています）。1）96穴プレートに細胞を播種する。 2）ストック溶液、作業溶液およびイメージングバッファーの調製; 3）顕微鏡のセットアップ。 4）細胞にCM-H 2 DCFDAおよびTMRMを負荷する。 5）基礎的なROSレベルおよびミトコンドリアの形態機能を測定するための最初のライブイメージングラウンド; 6） tert-ブチルの添加後のラウンド2回目のイメージング誘導されたROSレベルを測定するための過酸化物（TBHP） 7）自動画像解析。 8）データ分析、品質管理、視覚化。 このアッセイは、もともとは正常ヒト真皮線維芽細胞（NHDF）のために開発されたものである。これらの細胞は大きく平らであるため、2Dワイドフィールド画像13,14におけるミトコンドリアの形態を評価するのに適しています。しかしながら、わずかな改変を加えれば、この方法は他の接着細胞タイプにも適用可能である。さらに、CM-H 2 DCFDAとTMRMの組み合わせの次に、ワークフローは、異なる分子特異性1,15を有する様々な蛍光色素対に準拠する。

<table><tbody><tr><td>試薬</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩(TMRM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA(一般酸化ストレスインジケータ)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>C6827</td><td></td></tr>ジ<tr><td>メチルスルホキシ</td><td>ドシグマ)アルドリッチ</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96ウェルガラス底マイクロウェルプレート630 &micro;L-ブラック 0.17 mm 低ガラス蓋付き</td><td>ブルックス ライフサイエンス システム</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS フェノール レッド 500 mL</td><td>ロンザ</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース L-グルタミン</td><td>ロンザ</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩ブフェッド生理食塩水 (PBS) w/o Ca および Mg</td><td>ロンザ</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>ロンザ</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-バーセン (EDTA) 溶液</td><td>ロンザ</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 フラグメント ロバ 抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>ジャクソン</td><td>711-166-152</td><td>フラットフィールド画像取得用抗体</td></tr><tr><td>アレクサ フルオア 488 アフィニピュア F(ab')2 フラグメント ロバ 抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>ジャクソン</td><td>711-546-152</td><td>フラットフィールド画像取得用抗体</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti eclipse 広視野顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パーフェクトフォーカスシステム (PFS)</td><td>ニコン</td><td></td><td>ハードウェアベースオートフォーカスシステム</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X objective</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>/企業</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module</td><td>Nikon</td><td></td><td>このソフトウェアは、顕微鏡を操縦し、自動画像取得プロトタイプ</td></tr><tr><td>ImageJ(FIJI)バージョン2.0.0-rc-43 / 1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>RStudioバージョン1.0.44</td>、<td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rバージョン3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr>をプログラム/実行するために使用されます</tbody></table>

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

反応性酸素種（ROS）は、遺伝子発現、移動、分化および増殖を含む必須の細胞プロセスを調節する。しかしながら、過剰なROSレベルは、酸化ストレスの状態を誘導し、DNA、脂質およびタンパク質に対する不可逆的な酸化的損傷を伴う。したがって、ROSの定量化は、細胞の健康状態の直接プロキシミティを提供する。ミトコンドリアはROSの主要な細胞供給源および標的の1つであるため、同じ細胞におけるミトコンドリア機能とROS産生の共同分析は、病態生理学的条件における相互接続の理解を深める上で極めて重要です。したがって、細胞内ROSレベル、ミトコンドリア膜電位（ΔΨm）およびミトコンドリア形態の同時定量のために、高含量顕微鏡法に基づく戦略が開発された。これは、自動化された広視野蛍光顕微鏡法およびマルチウエルプレートで増殖させた生着細胞の画像解析および染色dを、細胞透過性蛍光レポーター分子CM-H 2 DCFDA（ROS）およびTMRM（ΔΨmおよびミトコンドリア形態）と比較した。蛍光測定法またはフローサイトメトリーとは対照的に、この戦略は、実験刺激の前後の両方で、時空間分解能の高い個々の細胞のレベルでの細胞内パラメータの定量化を可能にする。重要なことに、この方法の画像ベースの性質は、信号強度に加えて形態学的パラメータを抽出することを可能にする。組合せ特徴セットは、亜集団、細胞タイプおよび/または処置間の差異を検出するための探索的および統計的多変量データ分析に使用される。ここでは、アッセイの詳細な説明を、化学摂動後の細胞状態間の明白な識別の可能性を証明する実験例と共に提供する。

アッセイはいくつかの対照実験を用いてベンチマークされており、その結果はSieprath et al。 1 。要するに、CM-H 2 DCFDAおよびTMRMの細胞内ROSおよびΔψmの外から誘導された変化に対する蛍光応答を定量化して、ダイナミックレンジを決定した。 CM-H 2 DCFDAについて、NHDFは、10μM〜160μMの範囲のTBHPの濃度を増加させて処理した場合、蛍光シグナルの線形増加を示した。同様に、TMRMについて、NHDF細胞は、1〜10μg/μLの範囲内の増加する濃度のオリゴマイシン（ΔΨm過分極を誘発する）で処理した場合、ミトコンドリア蛍光の線形増加を実証した。逆に、ΔΨmの脱分極を誘発する抗生物質であるバリノマイシンのリアルタイム添加は、徐々に、定量的になったTMRM蛍光の明らかな減少。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

この論文は、細胞透過性蛍光レポーター分子5-（および - ）を使用して、生存接着細胞において、細胞内ROSレベル、ならびにミトコンドリア膜電位および形態（ミトコンドリア形態機能とも併せて参照される）の同時定量化のための、 6） - クロロメチル-2 &#39;、7&#39;-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（CM-H 2 DCFDA）およびテトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）。

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

このハイコンテンツ顕微鏡ベースの手法の全体的な目的は、ミトコンドリアの形態機能と細胞内の活性酸素種レベルを同時に定量化し、さまざまな実験的摂動にさらされた細胞株の堅牢なレドックスフィンガープリントを確立することです。本手法は、病原性条件下または化合物処理によって酸化ストレスが誘発されるか、またミトコンドリアの形態と機能がどの程度影響を受けるかといった、レドックス生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、すべてのパラメータを同一の細胞内で同時に測定できることです。手順を開始するために、薄い連続的なポリスチレンまたはガラス底を持つ黒色96ウェルプレートの60個の内側ウェルに、8,000～10,000個のヒト真皮線維芽細胞を播種します。異なる条件、処理、または細胞株を使用する場合は、プレート効果を最小限に抑えるため、播種位置をプレート上に均等に分散させてください。次に、焦点調整に使用するために、ウェルB01にさらに8,000～10,000個の細胞を播種します。その後、ウェル間および周囲環境との勾配を最小限に抑えるため、外周の空のウェルに培地を満たします。細胞が部分的に凝集して増殖するのを防ぐため、プレートを3回軽くタッピングしてからインキュベーターに戻します。細胞を24時間、またはコンフルエンシーが70%に達するまで培養します。その後、実験の処理情報をsetupという名前のスプレッドシートに保存します。顕微鏡をセットアップするには、まずソフトウェアを使用してXYステージのキャリブレーションを行います。次に、撮影ソフトウェアを使用して、マルチウェルプレート用のイメージングプロトコルを作成します。このプロトコルでは、96ウェルプレートの設定された位置および選択したウェルの自動キャプチャが可能です。まず、ソフトウェア内で提供されている利用可能なプレートの一覧から、適切な種類のマルチウェルプレートを選択してください。または、プレートとウェルの寸法を用いてマルチウェルプレートのフォーマットを定義してください。次に、外側の4つのコーナーウェルのうち2つのコーナーを指定して、ウェルプレートの位置合わせを行います。その後、取得が必要なウェルを選択し、連続波長取得で構成される取得プロトコルを定義します。GFPチャンネルが最初に設定されていることを確認してください。次に、定義した取得プロトコルを用いて、選択した各ウェルの中心付近に配置される、重なりのない4枚の等間隔の画像を撮影するためのウェルプレートループを定義します。このステップで、CM-H2DCFDAおよびTMRMストック溶液をHBSS HEPESバッファーに添加し、60ウェル分の染色溶液を調製します。次に、プレートを一度の滑らかな動作で逆さまにし、細胞から培養液を捨てます。細胞をHHバッファーで2回緩やかに洗浄します。フォーカス調整に使用した細胞が入っているウェルA01を忘れないようにしてください。洗浄ステップの合間にHHバッファーを廃棄します。次に、各ウェルに染色液を100 µLずつ添加し、CM-H2DCFDAおよびTMRMで細胞をロードします。ここでも、ウェルA01を忘れないようにしてください。室温、暗所で25分間細胞をインキュベートします。25分後、100 µLのHH緩衝液で細胞を2回洗浄し、60個の内部ウェルすべてに100 µLのHH緩衝液を加えます。実際の測定を行うために、プレートを顕微鏡にセットします。次に、ハードウェアベースのオートフォーカスシステムをオンにし、ウェルB01とTMRMチャネルを用いて、鮮明な画像が得られるまでオートフォーカスオフセットを調整します。続いて、イメージングプロトコルを実行します。得られた画像データセットにより、基底状態のROSレベル、ミトコンドリア膜電位、およびミトコンドリア形態に関する情報を得ることができます。次に、誘導されたROSレベルを測定するため、96ウェルプレートを顕微鏡から慎重に取り出します。各ウェルに40 µMのTBHP溶液を100 µL加え、TBHPがCM-H2DCFDAと完全に反応するまで少なくとも3分間待機します。この間に、ウェルA01に抗体ワーキングソリューションを100 µL加えます。その後、プレートを顕微鏡に再度セットし、ウェルB01を用いて焦点を確認します。次に、最初のイメージングラウンドと同じイメージングプロトコルを用いて、同様の位置を撮影します。得られた画像データセットから、誘導されたROSレベルに関する情報を得ることができます。続いて、ウェルA01でフラットフィールド画像を撮影します。信号がダイナミックレンジ内に十分収まっていることを確認してください。そのためには、取得設定を調整します。その後、取得したデータセットを、標準化された命名法を用いて個別のTIFFファイルとして単一のフォルダにエクスポートします。これには、プレート、TBHP処理の前後、ウェル、視野、およびチャンネルへの言及が含まれ、それぞれアンダースコアで区切られています。また、フラットフィールド画像を、標準化された命名法を用いて個別のTIFFファイルとして同じフォルダに保存してください。このステップでは、画像処理ソフトウェアを開き、redox metricsマクロセットをインストールします。次に、Sボタンをクリックしてセットアップインターフェースを開き、解析設定を行います。画像タイプ、チャンネル数、およびフラットフィールド画像の取得に使用したウェルを選択してください。その後、どのチャンネルに細胞またはミトコンドリアが含まれているかを示します。「background（背景）」および「enhance（強調）」のチェックボックスを選択し、それぞれ背景減算とコントラスト制限適応ヒストグラム平均化を実行します。次に、細胞のガウシアンブラーおよびミトコンドリアのラプラシアン強調のためのσ（シグマ）値を定義します。自動閾値設定アルゴリズムを選択し、サイズ除外制限の範囲を入力してください。次に、取得したデータセットからいくつかの画像を選択して開き、メニューのCボタンまたはMボタンをクリックして、それぞれ細胞またはミトコンドリアのセグメンテーション設定をテストします。その後、ハッシュボタンをクリックし、対象の画像フォルダを選択して、フォルダ内のバッチ解析を実行します。設定を確認し、OKを押してください。バッチ解析の後、「V」ボタンをクリックして画像が含まれるフォルダを選択し、検証スタックでセグメンテーションのパフォーマンスを視覚的に確認します。検証スタックを順に確認し、セグメンテーションが成功したかを確認してください。抽出されたデータの初期解析は、付属のShinyアプリケーションによって自動的に行われます。これにより、結果を迅速に解釈することができます。まず、R Studioでアプリケーションを開きます。外部ブラウザで実行することを選択してください。入力ページで、結果ファイルが格納されているディレクトリを選択してください。このディレクトリにセットアップファイルが含まれていることを確認してください。結果ファイルとセットアップ情報は、自動的にインポート、コンパイルされ、視覚化されます。実験セットアップページでは、実験のレイアウトが表示されます。次のページでは、各プレートごとのROSレベルおよび複数のミトコンドリアパラメータが表示されます。ドロップダウンメニューを使用して、可視化したいプレートを選択してください。データはマルチウェルプレート形式のほか、外れ値をウェル番号および画像番号でラベル付けしたボックスプロットで表示されます。結果の全実験ページでは、すべてのプレートを統合した標準化結果が、基本的な統計解析とともに示されます。入力ページを通じてドロップファイルが提供された場合は、指定されたデータポイントが除外されます。クラスター解析ページでは、5つのパラメータのデータに基づいた主成分分析を用いて、感度の高いレドックスプロファイルが作成されます。最後に、データダウンロードページで、処理および再編成されたデータを保存し、後で使用することが可能です。ここでは、ヒト真皮線維芽細胞にHIVプロテアーゼ阻害剤のサキナビルを投与した実験結果を示しています。記載したプロトコルを用いた結果、基底レベルおよび誘導後の ROS レベルの両方において有意な増加が検出されました。DMSO で処理した対照細胞と比較して、サキナビルはミトコンドリアの形態機能にも有意な影響を及ぼしました。ミトコンドリアのピクセルあたりの平均TMRM信号として測定されたミトコンドリア膜電位が有意に上昇しました。加えて、個々のミトコンドリアの円形度の増加と平均サイズの縮小によって定量的に示されるように、ミトコンドリアは高度に断片化したパターンを示しました。上述のパラメータを主成分分析を用いて統合したところ、コントロール群とサキナビル投与群は、そのレドックス指紋（redox fingerprints）によって明確に区別することができました。この手順を行う際は、照明自体が酸化ストレスの原因となることに留意することが重要です。したがって、露光条件を最小限に抑え、実験全体を通して一定に保つ必要があります。この手法を習得すれば、1日で最大20枚の96ウェルプレートの染色および画像取得が可能です。2回目のイメージングラウンドの後、細胞を固定して、後続の免疫蛍光染色に使用することができます。これにより、同一の細胞において測定されるパラメータ数を増やし、さらなる疑問の解消が可能になります。このビデオを視聴した後、ハイコンテンツ顕微鏡を用いて、接着細胞培養におけるROSとミトコンドリアの形態機能の複合測定ができるようになるはずです。

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同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

出典: Katsalifis, A., et al.レシオメトリック指標を用いた初代ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオン酸化還元状態のライブイメージングJ. Vis.

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2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。...

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ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

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ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価

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学ぶハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング手法。蛍光レポーターでROSとミトコンドリア形態機能を同時定量し、ヒト真皮線維芽細胞で実験条件ごとの酸化ストレスとミトコンドリア健康状態を評価する。

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

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