細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価
June 18th, 2020
このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。
テキスタイルにおける現在のプロトコル評価者は、細胞内コンパートメント特異的な方法で酸化還元状態が変化する。我々のプロトコルは、より良い理解を可能にし、酸化ストレスのすべての生理学的または病的生理学的メカニズムを監視する。この技術により、シグナル発現レベル、写真漂白、検出感度の差を相殺するために、比率メトリック出力を使用して、無傷細胞のタイル眼硫化物比を無停止で定量できます。
このプロトコルは、植物中の細菌を含む様々な生物に適用することができる。実験の1日目に、コンフルエント乳癌細胞株の細胞を2分間治療し、EDTAでは0.2、5%のトリップの2ミリリットルで治療する。細胞が剥離し始めると、完全な培地の6ミリリットルで反応を逮捕し、遠心分離によって細胞を沈下する。
ペレットを5ミリリットルの新鮮な完全な培地に再び懸濁し、細胞を数え、完全な培地の1ミリリットル当たり1.5倍から5番目の細胞に希釈します。次に、6ウェルプレートで1ミリリットル当たりの5番目の細胞に1.5倍の10回を播種し、細胞培養インキュベーター内の細胞を一晩インキュベートする。または、ウイルス行GFPの導入を追加しません。
翌朝、1~100マイクロリットルの12.5、25、および50マイクロリットルを10倍希釈して、1ミリリットル当たり10番目のプラーク形成単位に加え、ウイルス浸食GFP溶液を加えず、完全培地に添加する。適切なウェルまたは6ウェルプレートに加えて、それぞれ50、100、および200の感染多重度を有する細胞をトランスデュースする。すべてのサンプルのウェルズがウイルスで導入されたら、細胞を16〜24時間細胞培養インキュベーターに戻します。
翌日、蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、上清を培地に置き換え、ウイルスを使用せずに細胞をさらに24時間回復させる。最適な伝達効率を決定するには、フローサイトメトリーにより細胞の蛍光強度と形態を評価します。バイオセーフティレベル2認定生物学的安全キャビネット内で、エアロゾルや飛沫からの感染を引き起こす可能性のあるすべての手順を必ず実施してください。
細胞の酸化還元状態を評価するために、翌朝、細胞および6ウェルプレートの適切なウェルを1時間10マイクロモルモル過酸化水素でインキュベートし、EDTA当たり0.2 5%点滴の750マイクロリットルで細胞を剥離する前に、実証された。ウェルあたり完全な媒体の2ミリリットルで反応を停止し、個々の15ミリリットルの円錐管の各条件の上清を引っ張ります。遠心分離によって細胞を沈め、遠心分離によってPBSの500マイクロリットルでペレットを2回洗浄する。
2回目の洗浄後、細胞懸濁液を40マイクロメートルメッシュでろ過し、氷上のフローサイトメトリー適合チューブにフィルターをかけます。フローサイトメーターソフトウェアで、感染制御サンプルのゼロ多重度を実行します。次に過酸化水素と未処理の細胞を分析します。
これは、示された式を使用して、行GFPの酸化と減少形態の間の平均蛍光強度比の計算を可能にする。フローサイトメトリーにより多数の細胞を選択するための格言戦略を以下に示す。フローサイトメトリーは、行GFP分析のための線量応答曲線および感染入力の最も効率的な多重度を決定するためにも使用することができる。
感染の多重度によれば、本代表分析における用量応答曲線は、200の多重度の感染が最も高い道路GFP発現を与えたが、細胞形態は細胞毒性を示唆する作用があった。そこで、最適な伝達効率は、100の感染の多重度であると判断した。このレドックス状態解析では、酸化および減少した行GFP平均蛍光強度は、車両および4つの10マイクロモル陽性対照過酸化水素処理のフローサイトメトリー分析から得られた。
重ね合わせたヒストグラムは、過酸化水素10マイクロモルおよびビークル処理群の細胞数の変化を表すか、または減少して酸化された侵食GFPである。この分析のために酸化された行と減少した行GFPの比率を計算すると、10マイクロモル過酸化水素が車両処理と比較して行GFPの酸化の3倍の増加を引き起こしたことが明らかになった。正確なセル番号を持つことは、MRIの計算と再現性にとって重要です。
再現性のある結果を得るためには、研究者は、均質な懸濁液を得るために徹底的に抗ウイルス溶液を混合する必要があります。このプロトコルは、研究者がリアルタイムで正常な細胞プロセスと疾患の進行の広い範囲の不可欠な部分として急速な酸化還元変化を研究することを可能にします。
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概要
このプロトコルは、酸化還元感受性蛍光プローブを使用して細胞内の細胞小器官特異的な酸化還元状態を評価する方法を説明しています。この技術により、完全な細胞内の酸化還元状態を非破壊的に定量化することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 酸化還元生物学
- 酸化ストレス
背景
- 酸化還元状態を理解することは、酸化ストレスを研究する上で重要です。
- 酸化還元感受性プローブは細胞のメカニズムについての洞察を提供します。
- 酸化還元状態の変化は生理的または病態生理学的状態を示す可能性があります。
- この方法は様々な生物に適用できます。
研究の目的
- 細胞内の酸化ストレスのモニタリングを可能にします。
- 酸化還元状態を定量化する非破壊的な方法を提供します。
- 酸化条件に対する細胞の反応の理解を深めます。
使用される方法
- 酸化還元感受性蛍光プローブの使用。
- 信号差を相殺するためのラティオメトリック分析。
- がん細胞を含む様々な細胞タイプへのプロトコルの適用。
- サンプル準備のための細胞処理と遠心分離。
主な結果
- 完全な細胞内の酸化還元状態の定量化に成功しました。
- 異なる細胞タイプ間での適用可能性を実証しました。
- 酸化ストレスの生理学的メカニズムについての洞察を提供しました。
- リアルタイムでの酸化還元変化のモニタリングを可能にしました。
結論
- このプロトコルは細胞内の酸化還元状態を評価するのに効果的です。
- 酸化ストレスメカニズムの研究に価値あるツールを提供します。
- この方法は様々な研究用途に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
