光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

このプロトコルの全体的な目標は、マウスの心臓を化学的に透明化し、誘発された心不整脈を誘発して、蛍光ライトシート顕微鏡による白血球性心浸潤の全臓器の視覚化を行うことです。この方法は、細胞分解能レベルでのプロテーゼと構造に関する全臓器研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、臓器全体の炎症の定量化と局在化の両方を可能にすることです。

神経学的補綴物に詳細な内部を与えます。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、枯渇モジュールにおける心不整脈の細胞的説明を特定するための可視化ツールが緊急に必要だったときでした。8〜10週齢のマウスから心臓を露出させた後、21ゲージのカテーテルを使用して右心室を貫通します。

大動脈を切開して血液が排出されるようにしてから、5ミリリットルのPBSとEDTAをゆっくりと一定の圧力で灌流します。PBS EDTAに従い、5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを使用します。灌流の終わりに、鋸歯状の鉗子を使用して固定された心臓をそっとつかみ、臓器を少し上に引っ張ってすべての組織接続を切断します。

出入りする動脈と静脈を含みます。次に、心臓を新鮮な4%PFAで4時間保存して、さらに固定します。組織を脱水するには、気泡の形成を防ぐために、チューブ回転子上で一定の低速回転を伴う、暗闇の中で黒い5ミリリットルポリプロピレン反応チューブで、上昇エタノールシリーズで心臓をインキュベートします。

次に、98%ジベンジルエーテルインキュベーションで組織を清澄化し、一晩中一定の回転を行います。ライトシート蛍光顕微鏡法を実施するには、まず脱水アガロースブロックを標準サンプルホルダーに置き、サンプルを所定の位置に保持します。次に、サンプルをサンプルホルダーに移します。

次に、サンプルホルダーを適切なサイズのジベンジルエーテル充填キュベットに移します。適切な励起フィルターと蛍光フィルターの設定を使用して、目的の蛍光シグナルを検出します。したがって、サンプルの正しい位置決めと固定は、イメージング中のシャドウイングの影響を最小限に抑えるための基本です。

さらに、試料が緩んでいると、動くアーチファクトが発生し、後処理中に照らしにくくなります。すべての画像が必要になったら、適切な3Dおよび4D画像処理解析ソフトウェアを開き、surpassを選択します。「ファイル」を選択して開き、最初に取得したチャンネルのデータを含むフォルダを選択して、画像スタックを開きます。

編集を選択してチャンネルを追加し、取得した適切な蛍光チャンネルデータを追加します。次に、[編集]をクリックして画像のプロパティを選択し、x、y、zボクセルの寸法を修正します。新しく開いたウィンドウでパラメータを調整します。

蛍光シグナルを調整するには、まず編集メニューを開き、表示調整を選択します。新しいウィンドウには、開いているすべてのチャネルが表示されます。自家蛍光チャンネルをグレースケールに変更するには、自家蛍光チャンネルを選択し、白色の表示スタイルを選択して、「OK」をクリックします。

次に、グリッドを削除してビューを調整します。次に、ズームインして 1 つのチャンネルの選択を解除します。次に、ブラックレベル値を調整して、サンプル構造、信号強度、およびコントラストを表さない不要なバックグラウンド信号を除外します。

抗体の定位チャネルを、改訂された自家蛍光チャネルのシグナルに対して調整します。チャネルモードを設定すると、ファイアして抗体シグナルの可視化をヒートマップカラールックアップテーブルに設定します。次に、ブレンドモードを選択して、組織構造を詳細に視覚化します。

オルガンを仮想的に切り開くには、3Dシーンをエクスポートする前に、オブジェクトリストのクリッピングプレーンアイコンを選択します。黄色のフレームと白いスピンドルマニピュレーターが画像ビューに表示されます。マウスを使用して、細い方の端でスピンドルを回転させ、クリッピング平面の向きを変更し、スピンドルの厚い中央部分を動かして目的のクリッピングの深さを選択します。

次に、それぞれのチェックボックスをオフにして、フレームとマニピュレータを非表示にし、目的のスナップショットを作成します。2つの蛍光チャネルシグナルで構成される画像スタック全体を取得すると、人工的な3Dレンダリングが引き出され、白血球の分布がヒートマップビューに表示されます。ジフテリア毒素処理動物による心臓の強く炎症を起こした領域は、赤みがかった白っぽい外観で知覚できます。

特に、心房心室束やプルキンエ線維などの心臓伝導系の領域に顕著です。対照的に、制御されたPBSで治療された動物の心臓は、この炎症のパターンを示しません。この手法を習得すると、採取からコンピューター支援によるレンディフィケーションまで、4〜5日でターゲット臓器のデジタルレディ分析が可能になります。

その開発後、この技術は、エメノロジーの分野の研究者がマウス臓器全体の細胞分布パターンを探求する道を開きました。これは、さまざまな病態生理学的疾患プロテーゼの分析および治療において老化する可能性があります。このビデオを見れば、蛍光ライトシート顕微鏡法用のマウス臓器全体の調製方法と、3Dデータスタックの生成と処理方法について十分に理解できるはずです。