真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

このプロトコールは、インビボでの肺白血球接着および毛細血管灌流を画像化するための外科的調製および真空安定化系の使用を詳細に記載している。この技術の主な利点は、最小限の物理的外傷で無傷のミラーリング肺の安定した高解像度の生体内画像化を可能にすることである。まず、真空チャネルの汚染を避けながら、真空グリースの薄い層を外輪の上部に投与してイメージングウィンドウを準備します。

清潔な8mmのガラスカバースリップを窓に置き、静かに押し下げてシールを作成します。イメージングウィンドウを、デジタル圧力計を取り付け、50〜60ミリメートルの水銀常吸引を提供できる真空ポンプに接続します。20ゲージの気管内カニューレに長さの光ファイバーケーブルを通し、先端をリドカインHCLに浸します。

麻酔後、上部切歯が鏡面鏡の隙間に収まるように、修正された耳鏡を挿入します。喉頭蓋と声帯がはっきりと見えるまでスコープと舌の位置を調整します。スペキュラムの隙間に光ファイバケーブルを挿入し、小さな円形の動きを使用して声帯間のケーブルを通し、次に光ファイバケーブルをガイドとして使用して、カニューレを気管に静かにスライドさせてマウスを挿管します。

1.5%イソフルランで換気を開始後、ペダル反射の検査で麻酔の深さを確認してください。カニューレを医療用テープで鼻に固定します。ラベリングテープを使用して、右前足を9時位置の加熱パッドに固定し、左後足を尾方向に伸ばして6時位置に固定します。

布テープを使用して、左前足を12時の位置まで軽く伸ばし、テープのもう一方の端をバイタル内顕微鏡プラットフォームの上部に固定し、直腸温度プローブと足パルスオキシメーターを適用して、実験を通してバイタルサインを監視します。マウスを手術の準備をするには、胸郭と腹部を70%のアルコールワイプで滅菌し、ミネラルオイルの軽いコートを塗布してマウスの左側の髪を湿らせます。胸郭の底部付近に小さな切開を行って下層の筋肉層を露出させ、最初の切開部を延長し、鈍い解剖を使用して胸郭を露出させます。

止血鉗子を用いて、解剖した上皮組織と脂肪組織をつかみ、手術領域の外側に置きます。白血球および血流を蛍光標識するために、ローダミン6GおよびFITCアルブミンのボーラスあたり2.5ミリリットルを尾静脈を介して投与する。歯付き鉗子を使用して、吸気終了時に肺の基部の位置にすぐ下の肋骨をつかむ。

鉗子をわずかに引っ込めて肋骨を肺から引き離し、肋骨を切って気胸を誘発します。切開部を両方向に横方向に伸ばし、肺に触れないように注意してください。次に高い肋骨を鈍い鉗子でつかみ、肺が胸壁から落ちるようにわずかに引っ込めます。

肺が外れない場合は、胸壁を肺に軽く押し当てて、肺を根底にある胸膜に付着させ、より簡単に脱落させます。最終的に胸骨まで、そして肺の頂点が露出するまで頭蓋に元の切開を続ける。綿のアプリケーターとガーゼを使用して、発生する出血を弱めます。

胸郭を上げて胸腔の背側側面に肋間血管を露出させ、肺を傷つけないように注意し、脊柱の近くの最も下側の肋間血管を焼灼し、隣接する肋骨を切断する。頭蓋を動かし、最終的には、焼灼と切断の繰り返しパターンを使用して、胸郭の約1×2センチメートルの部分を切除する。イメージングの準備をするには、生体内顕微鏡プラットフォームを顕微鏡ステージに移し、イメージングウィンドウを露出した肺の真上に配置します。

マイクロマニピュレータを使用して、イメージングウィンドウが肺表面に付着して安定するまで慎重に下げます。肺微小循環を視覚化するには、20倍の対物レンズと標準のFITCおよびローダミンフィルターセットを備えた広視野蛍光顕微鏡を使用します。白黒CCDカメラを使用して、最適なコントラストでビデオを録画します。

FITCフィルターセットを使用して、血流の収束パターンに基づいて肺会場を特定し、会場に焦点を合わせた状態で30秒のビデオを録画した後、ローダミンフィルターセットを使用して同じ視野で記録を繰り返して白血球を視覚化します。肺動脈を見つけるには、FITCフィルターセットを使用して、血流の発散パターンを持つ血管を識別し、30秒のビデオを録画します。ローダミンフィルターセットを使用して同じ視野で記録を繰り返し、白血球を視覚化します。

関心のある毛細血管領域を見つけるには、FITCフィルターセットを使用して、肺胞と毛細血管の領域を識別し、より大きな血管と交差していない毛細血管を識別し、30秒のビデオを録画します。ローダミンフィルターセットを使用して同じ視野で記録を繰り返し、白血球を視覚化します。このビデオは、緑色の矢印で示されているように、肺会場内の血流のFITCイメージングを描いています。

ローダミンイメージングは、赤い矢印で示された2つの付着性白血球を用いて、同じ会場内の白血球の可視化を可能にする。これらの方法は、関心のある肺動脈および毛細血管領域と同様の現象を視覚化するためにも適用された。微小循環パラメータの定量化を実証するために、マウスを鼻腔内LPSで処置し、肺炎症を誘導した。

肺施設における白血球の密輸は、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける分析された内皮領域を表す概説された領域とともにここに示されている。白血球接着および転がりは、LPS処理マウスにおいて増加した。肺動脈における白血球のトラフィッキングは、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける分析された内皮領域を表す概説された領域と共にここに示されている。

白血球接着はLPS処理マウスにおいて高かった。この図は、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける肺毛細血管内の白血球接着を示す。白血球接着は、LPS処置マウスにおいてナイーブと比較してより高いことが示された。

この図は、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける肺毛細血管の灌流を示す。機能的毛細血管密度は、LPS処置マウスにおいてナイーブと比較して低いことが示された。このプロトコルには多くの挑戦的な側面があります。

プラットフォーム上でのマウスの位置を最適化することは、外科的およびイメージングステップをはるかに再現性の高いものにすることができる簡単なステップです。この手順は、幅広い研究パラメータおよび顕微鏡アプローチに適応可能である。したがって、それは健康な状態と罹患状態の両方における肺微小循環のさらなる研究を促進するべきである。