全身免疫組織化学的方法を用いて胆道の内腔を調べる Suncus murinus

この手順の全体的な目標は、Suncus murinusの胆道内の神経分布を視覚化するために、ホールマウント免疫組織化学染色を採用することです。この方法は、多くの種、特に標準的な方法では評価が困難な不規則な臓器や小さな臓器の内臓の神経分布を分析するために使用できます。この手法の主な利点は、操作が簡単なことです。

複雑な手続きを必要とせず、高い成功率を誇っています。私と一緒に手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYidan Daiと研究員のShuang-Qin Yiです。まず、ヒュームキャビネットで個々のPBSと4%パラホルムアルデヒド灌流で動物を洗い流します。

次に、灌流カテーテルを介して腹部大動脈に2〜3ミリリットルの白いネオプレンラテックスを注入し、血管にラベルを付けます。そして、関心のあるすべての組織にラベルが付けられたら、腹部の臓器とそれに関連する神経と血管を抽出します。次に、約0.1ミリリットルの青色ネオプレンラテックスを胆嚢に注入して胆道系を標識し、組織を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で一晩後固定して、ホールマウント免疫染色を行います。

翌朝、サンプルをガラスバイアルに移し、ニューテーターで蒸留水で1時間の室温洗浄を4回行います。最後の洗浄後、新たに調製した1%オルソ過ヨウ酸に組織を室温で20分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ反応を防ぎます。次に、サンプルを蒸留水で室温で10分間洗浄し、続いて、新たに調製した0.004%パピヨンで37°C恒温水浴で2時間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、標本を蒸留水で50〜60分間洗浄します。次に、組織を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で一晩保存します。翌朝、先ほど示したように蒸留水でサンプルを洗浄し、その後、新たに調製したパピヨンでさらに2時間インキュベートします。

サンプルを蒸留水でさらに50〜60分間洗浄した後、4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。3日目の朝、蒸留水で組織を4回洗浄した後、30分間のスクロースインキュベーションを3回連続して上昇させます。その後、サンプルをマイナス20°Cで30〜60分間凍結し、室温で完全に解凍します。

3回目の凍結融解サイクルの後、サンプルを2%Triton X-100に移し、摂氏4度の一晩インキュベーションを行います。翌朝、サンプルを目的の一次抗体の容器に移し、ニューテーター上で摂氏4度で3〜6日間穏やかに揺さぶります。適切な標識期間の後、結合していない一次抗体を室温でPBSで1時間4回洗浄して取り出し、適切な二次抗体で3日間、摂氏4度で穏やかに揺さぶって試料を標識します。

二次抗体標識期間の終了時に、検体をPBSで4回洗浄します。次に、組織を10マイクロリットルの30%過酸化水素で、新たに調製した0.002%DAB着色溶液100ミリリットルで摂氏4度で16〜72時間、穏やかに揺さぶってインキュベートします。最適な染色強度に達したら、標本をPBS中の0.04%アジ化ナトリウムに移して、着色反応を停止します。

次に、新鮮なPBSが入った10cmのシャーレにサンプルを慎重に浸し、実体顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して組織の全体のマウント画像をキャプチャします。肝外胆道の神経支配の可視化に加えて、ニューロフィラメント陽性神経線維に対する抗体による標識により、食道に沿って胃に入る迷走神経の走行密度と分布密度を明確に特定することもできます。胆嚢の血管を白いネオプレンラテックスで標識すると、周囲の組織とは対照的に薄い神経線維症が明らかになり、眼底よりも胆嚢の首に神経支配の密度が高くなります。

上部胆管には、不規則で密集した神経ネットワークを形成し、胆道上および胆道内に密集して存在する細い神経束と、胆道の表面に平行に分布する厚い神経束の2種類の神経束が標識されています。総胆管を青色のネオプレンラテックスで、血管を白色のネオプレンラテックスで標識すると、総胆管の端にある細い神経線維と十二指腸乳頭領域を視覚化できます。この手順を試す前に、プロセス全体が完了するまでに2〜3週間かかるため、各実験のタイムラインを再生するように注意してください。

溶液を交換するときに試料を傷つけないように、鉗子で試料を取り除くのではなく、常に溶液を注いでください。このビデオを見た後、このテクニックをさまざまな内臓内のさまざまな神経のラベリングに適用できるようになるはずです。