Name: 全身免疫組織化学的方法を用いて胆道の内腔を調べる Suncus murinus (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ全身免疫組織化学法を用いてSuncus murinusの胆道における神経分布を可視化する方法です。小型または不規則な内臓器官の神経支配を解析する際に有効な技術であり、操作が簡単で成功率が高い利点があります。

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著者には謝辞はありません。

すべての実験手順は、東京都大学機関動物管理委員会（IACUC）によって承認された。動物は、実験動物のケアおよび使用のためのガイドおよびカナダ動物飼育評議会の実験動物のケアおよび使用のためのガイドに従って収容および処理された。東京都大学フロンティアヘルスサイエンス学科Functional Morphology Laboratoryで飼育維持されている動物を使用しました。 1.動物のケアと住居<ol><li>閉鎖した繁殖コロニーからS. murinus 7頭（体重が70〜90gの雌3頭、雄4頭）を得る。 </li><li>紙ストリップを含む木製の巣箱を備えたプラスチックケージに離乳後（出生後20日）個別にS. murinusをケージに入れる。慣習的に調整された動物の部屋に入れてください：23-27℃、湿度コントロールなし、そして12:12時間の明暗サイクル。供給業者イーグル・マス・ペレットと水を自由に与えます。 </li></ol> 2.組織の準備<ol><li> 4％（w / v）パラホルムアルデヒド（PFA）を調製するために、PFA40gを0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）1000mLに溶解する。ヒュームの棚で、溶液が透明になるまでボルテックスで混合する。 4％PFA O / Nは4℃で保管してください。 注意：PFAを取り扱う際は、適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。 </li><li>動物を灌流して固定するために、それをエーテルで麻酔し、次にそれにsomnopentyl（ペントバルビタールナトリウム、0.6mL / kg体重）の腹腔内注射を与える。 </li><li>動物が完全に麻酔された後、メスで腹腔を開き、腹部の真ん中に3cmの長さの腹部切開部を作ります。腹部大動脈の切開部のすぐ上のレベルで腹部大動脈にカテーテルを腸骨動脈に挿入する。 </li><li>ソノノペンチルを注射する（ペントバルビタール体重1kgあたり1.0mL）。完全な安楽死後、0.01M PBS（pH 7.4）で灌流し、次いで煙霧棚で4％PFAで灌流する。 </li><li>灌流後、白いネオプレンラテックス（希薄白色ネオプレンラテックス3：2、蒸留水（DW））を2〜3mL注入して血管に標識する。 </li><li>肝臓、胆嚢、総胆管、十二指腸、膵臓などの腹部の器官を関連する神経や血管から抽出する。 </li><li>約12 mLの青色ネオプレンラテックス（希釈した白色ネオプレンラテックス10 mLに1滴の青色インクを加える）を胆嚢に注入して、胆管系を標識する。 </li><li>全マウント免疫染色のために、4℃で4％PFAで一晩固定してください。 注意：PFAは有毒です。 PFAの直接取り扱いは避けてください。 PFAはヒューム棚に使用する必要があります。 </li></ol> 3.全身免疫組織化学注：プロトコールを通して、洗浄、抗体インキュベーション、および着色を含む、the標本は、室温または4℃でゆっくりとロッキングして、ナットレーター上に留まらなければなりません。 <ol><li> 1日目：潜在的な内因性ペルオキシダーゼの酵素処理および不活性化 <ol><li>調製した試験片をDW 4xで室温で1時間、適切な大きさのガラスバイアル中で洗浄する。 PFAを取り除くために検体をナレーターで静かに揺する。溶液を交換する際には、試料に損傷を与えないでください。 </li><li> 1％（w / v）のオルト過ヨウ素酸を調製するには、100mLのDW中に1gのオルト過ヨウ素酸を溶解する。 </li><li>内因性ペルオキシダーゼ反応を防ぐために、1％オルト過ヨウ素酸中で20分間RTで検体をインキュベートする。 </li><li> 0.004gのパパインを0.025mol / Lのトリス - 塩酸緩衝液（pH7.6）100mLに溶解して0.004％（w / v）のパパインを調製する。 </li><li> DWで10分間RTで検体を洗浄する。 </li><li>穏やかに振盪しながら恒温槽中で37℃で2時間、新たに調製した0.004％パパインで検体をインキュベートする。 </li><li> Dを用いて検体を洗浄するWで50〜60分間RTでインキュベートした。 </li><li>試料を4％CO / Nで4％PFAに保存する。 </li></ol></li><li> 2日目：酵素処理 <ol><li>保管した試験片をDWで4時間、室温で1時間洗浄する。 </li><li>穏やかに振盪しながら恒温槽中で37℃で2時間、新たに調製した0.004％パパインで検体をインキュベートする。 </li><li> DWで50〜60分間RTで標本を洗浄する。試料を4％CO / Nで4％PFAに保存する。 </li></ol></li><li> 3日目：凍結処理 <ol><li>上記のように、保存した試験片を室温で1時間、DW 4xで洗浄する。 </li><li> 2.5g、5gおよび10gのスクロースをそれぞれ0.01M PBS（100mLのPBS中に溶解することにより2.5％（w / v）、5％（w / v）および10％ pH7.4）。 </li><li> 2.5％（w / v）、5％（w / v）および10％（w / v）スクロースにそれぞれ30分間浸漬する。 </li><li>試料を-20℃で30〜60分間凍結し、RTで完全に解凍する。サイクルを3回繰り返す。 </li><li>上2％Triton X-100（v / v）を補充し、2mLのTriton X-100を100mLの0.01M PBS（pH 7.4）に加える。 </li><li> 4％CO / Nで2％Triton X-100に検体を保存する。 </li></ol></li><li> 4日目：一次抗体インキュベーション <ol><li>ウシ血清アルブミン（BSA）0.2g、トリトンX-100 0.3ml、アジ化ナトリウム0.1gを0.01M PBS（pH 7.4）100mlに溶解して、一次抗体の希釈液を調製する。 注意：アジ化ナトリウムは急性毒性があります。吸入および接触は避けなければならない。適切なPPEを着用してください。 </li><li>上記の希釈バッファー（ステップ3.4.1）で1：600の一次抗体（NFP）を希釈する。検体をNFP抗体と4℃で3〜6日間インキュベートし、検体をナテーター上で静かに揺り動かします。より大きな検体は、 インキュベーション時間の増加を必要とする。 </li></ol></li><li> 二次抗体インキュベーション <ol><li>未結合の一次抗体を除去するために、RTでそれぞれ1時間、PBS 4x中で検体を洗浄する。 </li&gt; <li> 0.2gのBSAと0.3mLのTriton X-100を100mLの0.01M PBS（pH 7.4）に溶解することにより、二次抗体のための希釈溶液を調製する。 </li><li>希釈バッファー（ステップ3.5.2）で二次抗体（ペルオキシダーゼ結合、アフィニティー精製ヒツジ抗マウスIgG-HRP）を1：600希釈する。検体を2次抗体と4℃で3日間インキュベートし、検体をナイトレーター上で静かに揺り動かします。 </li></ol></li><li> 着色 <ol><li>溶液を暗所に保ち、ヒューム皿の下で0.05 mol / L Tris-HCl緩衝液（pH 7.6）100 mLに3,3&#39;-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（DAB）0.002 gを加えてDAB着色溶液を調製する。 </li><li> PBSで4℃で1時間、標本を室温で洗浄する。 </li><li>新たに調製したDAB着色溶液に30％H 2 O 210μLを添加し、4℃/ Nでまたは3日間インキュベートする。 </li><li>反応をplaで停止する最適染色強度に達したときに、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBS中で標本を染色する。 注：西洋ワサビペルオキシダーゼを阻害するので、このステップまでアジ化ナトリウムを使用しないでください。 </li></ol></li><li> 染色組織のイメージング <ol><li>慎重に、検体をPBSを含むペトリ皿（高さ5cm、直径10cm）に移す。実体顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、全マウント画像をキャプチャします。 注：完全にマウントされた組織は、透明なガラス皿上のPBSに完全に浸した状態で撮像する必要があります。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+hypoglossal+nerve+in+the+chick+embryo+as+observed+by+the+whole-mount+nerve+staining+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method.</a> Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+the+avian+vagus+nerve+with+special+reference+to+the+morphological+innervation+of+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung.</a> Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+avian+trigeminal+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of avian trigeminal nerves.</a> Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anatomy+of+innervation+of+the+gallbladder+in+humans+and+Suncus+murinus+with+special+reference+to+morphological+understanding+of+gallstone+formation+after+gastrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy.</a> World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+the+pancreas+in+the+house+musk+shrew%2C+Suncus+murinus%2C+with+special+reference+to+the+blood+supply+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15782096">Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures.</a> Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4087648/">Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy.</a> World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).</li>
<li>Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26179953">Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study.</a> Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+proteins+in+axonal+regeneration+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases.</a> Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).</li>
<li>Wyatt, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+the+sphincter+of+Oddi+to+the+stomach%2C+duodenum+and+gall-bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder.</a> J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).</li>
<li>Mawe, G. M., Kennedy, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+neurons+provide+nicotinic+fast+synaptic+input+to+sphincter+of+Oddi+neurons+in+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig.</a> Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).</li>
<li>Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+neuropeptidergic+properties+of+the+duodenal+neurons+projecting+to+the+gallbladder+in+the+golden+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster.</a> Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).</li>
<li>Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+nerve+cells+from+the+duodenum+to+the+sphincter+of+Oddi+and+gallbladder+of+the+Australian+possum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum.</a> Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).</li>
<li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. (62), e4042(2012).</li>
</ol>

著者らは、利益相反を宣言していない。

この研究は、ニューロフィラメントタンパク質に対する抗体を用いて肝外胆道の神経支配を視覚化するための実験手順を説明している。このプロトコルは、KurataniおよびTanaka 1,2,3によって記述されたプロトコルから適合させた。 この実験では、全マウント染色法が2〜3週間続くので、各実験のタイムラインを計画します。組織を入れた容器は、凍結/解凍プロセスを除いて、常にナットで回転させる必要があります。特に、一次抗体および二次抗体とのインキュベーション中、試験片を反応液に均一に曝露するために、検体をナッターで回転させながら冷蔵保存室にセットした。 1％（w / v）オルト過ヨウ素酸、0.004％（w / v）パパイン、および一次/二次抗生物質のための希釈バッファーダイスは各実験ごとに新しく作らなければならない。プロトコール全体を通して、溶液を交換する際に試料に触れたり損傷したりしないように、溶液は鉗子15で取り除かれる代わりに注ぎ出されるべきである。 PFAで固定した後、サンプル...

家のムスクシュル、 Suncus murinusは、InsectivoraとSoricidae目に属する。この小さな哺乳類は東南アジア全域に分布しており、人間の住居や牛のペンの近くにある家や草地に生息しています4 。この種は、マウス、ラット、ウサギのような他の実験動物と比べてヒトに類似した一般的な形態学的特徴を示す。以前、膵臓6 、大十二指腸乳頭7 、幽門8 、胆嚢5 、および肝外胆道9の末梢神経を標識するために、 S.ムリナスニューロフィラメントタンパク質（NFP）に対する末梢ニューロンマーカーを用いた全マウント免疫染色を用いた。 NFPは、成熟した神経細胞骨格の一部である巨大分子複合体である。神経フィラメント関連タンパク質NFPとザイソソームとの間の相互作用を媒介する。酵素機能およびリンカータンパク質の構造はいずれもNFP 10によって調節される。 NFP複合体は、NF-L（70kDa）、NF-M（150-160kDa）、およびNF-H（200kDa）の3つのポリペプチドからなる。 NFPは、中枢神経系および末梢神経系の両方におけるニューロンの軸索に見出され得る。抗ヒトNFP抗体は、中枢神経系および末梢神経系の軸索を標識することが示されている。解剖学的および電気生理学的研究により、括約筋、胆嚢および近位胃腸管が11,12,13,14に接続されていることが示された。しかしながら、それらのニューロン結合の形態学的特徴はまだ定義されていない。 この研究は、 S. murinus bilの神経支配を標識するための全マウント免疫組織化学的染色法の使用を実証しているNFP抗体を用いたiary tract。

<table><tbody><tr><td>オルト過酸化酸</td><td>和光</td><td>162-00732</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>和光</td><td>164-00172</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>和光</td><td>010-15131</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>ナカライ テスク</td><td>312-33</td><td></td></tr><tr><td>ニューロフィラメントタンパク質 (NFP) 抗体</td><td>Dako</td><td>M0762, lot 089, clone: 2F11</td><td></td></tr><tr><td>peroxidase-conjugated親和性精製羊抗マウスIgG-HRP</td><td>MBL</td><td>コード 330</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩 (DAB)</td> <td>和光</td><td>349-00903</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma</td><td>I-0125</td><td></td></tr></tbody></table>

全身免疫組織化学的方法を用いて胆道の内腔を調べる<em&gt; suncus murinus</em

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

この研究は、 Suncus murinus（ S. murinus）における胆道の神経支配を標識するためにニューロフィラメントタンパク質抗体を使用して、全マウント免疫組織化学染色方法を詳細に説明する&#160; ）。最初に、検体をS. murinusから解剖し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した。第2に、酵素処理および潜在的な内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行った。次いで、試験片を一次抗体である抗神経フィラメントタンパク質抗体に3-6日間曝露した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体とインキュベートした。呈色反応は、検体を3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）基質と反応させることによって明らかにした。この方法は、すべての内臓器官の神経支配を分析するために適用することができる。さらに、このプロトコールは、他のニューロン抗体を試験するために適合させることもできるが、抗体の最適化最初に行う必要があります。この方法はもともとKuratani and Tanaka 1,2,3によって導入された。

図1〜4は、 S. murinusの肝外胆管におけるNFP陽性神経線維の典型的な結果を示す。 （ 図1 ）、胆嚢（ 図2 ）、上部胆管（ 図3 ）、および十二指腸乳頭領域（ 図4 ）の画像全体において、NFPに対する抗体は高い特異性および最小限度を再現可能に標識したバックグラウンド。 形状および大きさにかかわらず、標本のすべての組織について、被験者の神経を同時に染色することができる。肝外胆管の神経支配に加えて、食道および胃の迷走神経の走りおよび分布密度は明白に示された（ 図1 ）。 <p cl胆嚢...

Suncus murinusの肝外胆管における神経フィラメントタンパク質の発現を視覚化するための全身免疫組織化学的アプローチ。ここに表示されます。このプロトコルは、 S. murinusまたは他の種のすべての内臓器官の神経支配を分析するために使用することができる。

全身免疫組織化学的方法を用いて胆道の内腔を調べる<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

この手順の全般的な目的は、全層免疫組織化学染色を用いて、ナンジャクシガシラ（Suncus murinus）の胆道内における神経分布を可視化することです。この手法は、多くの種の内臓器官、特に標準的な方法では評価が困難な不規則な形状の器官や小さな器官の神経分布を解析するために利用できます。本手法の主な利点は、操作が簡便であることです。複雑な手順を必要とせず、成功率が高い方法です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるYidan DaiとリサーチフェローのShuang-Qin Yiが行います。まず、ドラフトチャンバー内で、動物にPBSおよび4%パラホルムアルデヒドを用いて個別に灌流を行います。次に、血管を標識するため、白色のネオプレンラテックス2～3 mLを灌流カテーテル経由で腹大動脈に注入します。目的とするすべての組織の標識が完了したら、腹部臓器およびそれに関連する神経と血管を摘出します。その後、胆道系を標識するために青色のネオプレンラテックス約0.1 mLを胆嚢に注入し、ホールマウント免疫染色に向けて、組織を4%パラホルムアルデヒド中で4 °C、一晩後固定します。翌朝、サンプルをガラスバイアルに移し、ニューテーターを用いて蒸留水で室温にて1時間の洗浄を4回行います。最後の洗浄後、組織を新しく調製した1% orthoperiodic acid中で室温にて20分間インキュベートし、内在性ペルオキシダーゼ反応を抑制します。次に、サンプルを蒸留水で室温にて10分間洗浄し、続いて新しく調製した0.004% papillon中で、37 degrees Celsiusの恒温水槽にて緩やかに揺らしながら2時間インキュベートします。インキュベーションの終了後、検体を蒸留水で50〜60分間洗浄します。その後、組織を4%パラホルムアルデヒド中で4°Cで一晩保存します。翌朝、先ほど示したようにサンプルを蒸留水で洗浄し、続いて、新しく調製したpapillon中でさらに2時間インキュベーションします。サンプルを蒸留水でさらに50〜60分間洗浄し、続いて4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。3日目の朝に、組織を蒸留水で4回洗浄し、その後、濃度を段階的に上げた3種類のスクロース溶液にそれぞれ30分ずつ順次浸漬します。次に、サンプルを-20°Cで30〜60分間冷凍し、その後、室温で完全に融解させます。3回目の凍結融解サイクルの後、サンプルを2% Triton X-100に移し、4°Cで一晩インキュベートします。翌朝、サンプルを目的の一次抗体が入った容器に移し、検体のサイズに応じて3日から6日間、ニューテーターを用いて4°Cで緩やかに揺らしながら反応させます。適切なラベル化期間の後、室温のPBSで1時間×4回の洗浄を行い、未結合の一次抗体を除去します。その後、適切な二次抗体を用いて、4°Cで緩やかに揺らしながら3日間ラベル化します。二次抗体によるラベル化期間の終了後、検体をPBSで4回洗浄します。次に、組織を、新鮮に調製した0.002% DAB発色液100 mLに30% 過酸化水素を10 µL加えた溶液に入れ、4°Cで16～72時間、緩やかに揺らしながらインキュベートします。最適な染色強度に達したら、検体をPBS中の0.04% アジ化ナトリウムに移し、発色反応を停止させます。次に、新鮮なPBSを入れた10センチメートルのペトリ皿にサンプルを慎重に浸し、実体顕微鏡に装着したカメラを用いて組織のホールマウント画像を作成します。肝外胆道系の神経支配の可視化に加え、ニューロフィラメント陽性神経線維に対する抗体でラベル化することで、食道に沿って胃へと至る迷走神経の走行と分布密度を明確に同定することが可能になります。胆嚢の血管を白色ネオプレンラテックスでラベル化すると、周囲の組織に対して高いコントラストで細い神経線維が明らかになり、胆嚢底部よりも胆嚢頸部において高い神経支配密度が観察されます。上部胆管では、2種類の神経束が標識されます。1つは胆管上および内部に密着して走行し、不規則で緻密な神経ネットワークを形成する細い神経束であり、もう1つは胆管表面に平行に分布するより太い神経束です。総胆管を青色のネオプレンラテックスで、血管を白色のネオプレンラテックスで標識することで、総胆管末端および十二指腸乳頭付近の細い神経線維を可視化できます。この手順を試みる前に、全工程の完了に2〜3週間を要するため、各実験のタイムラインを十分に計画してください。溶液を交換する際、検体に損傷を与えないよう、ピンセットで検体を取り出すのではなく、常に溶液を注ぎ出して捨ててください。このビデオを視聴することで、さまざまな内臓器官内の広範な神経の標識にこの技術を応用できるようになります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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マウスにおけるカハール（ICC）ネットワークの間質細胞の可視化

生理的な血管新生とそれを欠いている正常な成体血管化哺乳動物の組織を研究するために使用される外科的介入にさらされていません：（i）の開始とテストエージェントの腹腔内投与後の血管新生の開発、との全身投与後の血管新生の（II）修正テストエージェントを選択した。...

ラット間膜の血管新生アッセイ

このビデオは、乳がんのマウスモデルにおける腫瘍標的抗体の生体分布を研究するためのin vivo免疫蛍光局在化(IVIL)技術を示しています。マウスに腫瘍特異的抗体を静脈内注射すると、腫瘍は外科的に単離され、腫瘍組織内の抗体の局在はex...

抗体の生体内分布を研究するためのin vivo免疫蛍光ローカリゼーション法

このビデオでは、胚性マウスの消化管の免疫染色を行い、免疫蛍光法と共焦点顕微鏡を用いてニューロン集団の分布を可視化・解析する様子をご覧いただけます。...

胚性マウス消化管におけるニューロン集団の免疫蛍光染色

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

腸内神経系(ENS)は、腸壁に位置するニューロンとグリアのネットワークで、腸の反射を制御します。このプロトコルは、Ca2+イメージングを使用してENSのライブ調製物中の腸管ニューロンおよびグリアの活動を記録する方法を説明しています。...

腸神経系のその場のCa 2+イメージングに

腸神経系は、腸内で増殖し、移動し、コロニーを形成する神経堤細胞によって形成されます。神経堤細胞は、神経伝達物質の表現型に特異的なマーカーを持つニューロンに分化します。このプロトコルは、腸神経系の神経伝達物質の発現を視覚化するために、マウス胚性胃腸管の解剖、固定、免疫染色を行う技術について説明しています。...

マウス腸神経系の開発を可視化するために免疫染色

心エコー検査は、マウスで多用されます。高価な高分解能超音波デバイスは、この目的のために開発されています。このプロトコルでは、心臓形態を決定する組織学的形態計測学的解析と組み合わせて現実的な心エコー手順について説明します。...

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

マウス肝臓における胆管密度を正確に定量するための、かなりシンプルで敏感な方法を提示する。この方法は、遺伝的および環境修飾子の効果と胆汁病のマウスモデルにおける潜在的な治療法の有効性の決定に役立ちます。...

マウス肝臓における胆管密度の決定

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ...

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

学ぶ全身免疫組織化学法を用いてSuncus murinusの胆道における神経分布を可視化する方法です。小型または不規則な内臓器官の神経支配を解析する際に有効な技術であり、操作が簡単で成功率が高い利点があります。

全身免疫組織化学的方法を用いて胆道の内腔を調べる

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