全身免疫組織化学的方法を用いて胆道の内腔を調べる Suncus murinus
June 15th, 2017
Suncus murinusの肝外胆管における神経フィラメントタンパク質の発現を視覚化するための全身免疫組織化学的アプローチ。ここに表示されます。このプロトコルは、 S. murinusまたは他の種のすべての内臓器官の神経支配を分析するために使用することができる。
この手順の全体的な目標は、Suncus murinusの胆道内の神経分布を視覚化するために、ホールマウント免疫組織化学染色を採用することです。この方法は、多くの種、特に標準的な方法では評価が困難な不規則な臓器や小さな臓器の内臓の神経分布を分析するために使用できます。この手法の主な利点は、操作が簡単なことです。
複雑な手続きを必要とせず、高い成功率を誇っています。私と一緒に手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYidan Daiと研究員のShuang-Qin Yiです。まず、ヒュームキャビネットで個々のPBSと4%パラホルムアルデヒド灌流で動物を洗い流します。
次に、灌流カテーテルを介して腹部大動脈に2〜3ミリリットルの白いネオプレンラテックスを注入し、血管にラベルを付けます。そして、関心のあるすべての組織にラベルが付けられたら、腹部の臓器とそれに関連する神経と血管を抽出します。次に、約0.1ミリリットルの青色ネオプレンラテックスを胆嚢に注入して胆道系を標識し、組織を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で一晩後固定して、ホールマウント免疫染色を行います。
翌朝、サンプルをガラスバイアルに移し、ニューテーターで蒸留水で1時間の室温洗浄を4回行います。最後の洗浄後、新たに調製した1%オルソ過ヨウ酸に組織を室温で20分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ反応を防ぎます。次に、サンプルを蒸留水で室温で10分間洗浄し、続いて、新たに調製した0.004%パピヨンで37°C恒温水浴で2時間インキュベートします。
インキュベーションの終わりに、標本を蒸留水で50〜60分間洗浄します。次に、組織を4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で一晩保存します。翌朝、先ほど示したように蒸留水でサンプルを洗浄し、その後、新たに調製したパピヨンでさらに2時間インキュベートします。
サンプルを蒸留水でさらに50〜60分間洗浄した後、4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。3日目の朝、蒸留水で組織を4回洗浄した後、30分間のスクロースインキュベーションを3回連続して上昇させます。その後、サンプルをマイナス20°Cで30〜60分間凍結し、室温で完全に解凍します。
3回目の凍結融解サイクルの後、サンプルを2%Triton X-100に移し、摂氏4度の一晩インキュベーションを行います。翌朝、サンプルを目的の一次抗体の容器に移し、ニューテーター上で摂氏4度で3〜6日間穏やかに揺さぶります。適切な標識期間の後、結合していない一次抗体を室温でPBSで1時間4回洗浄して取り出し、適切な二次抗体で3日間、摂氏4度で穏やかに揺さぶって試料を標識します。
二次抗体標識期間の終了時に、検体をPBSで4回洗浄します。次に、組織を10マイクロリットルの30%過酸化水素で、新たに調製した0.002%DAB着色溶液100ミリリットルで摂氏4度で16〜72時間、穏やかに揺さぶってインキュベートします。最適な染色強度に達したら、標本をPBS中の0.04%アジ化ナトリウムに移して、着色反応を停止します。
次に、新鮮なPBSが入った10cmのシャーレにサンプルを慎重に浸し、実体顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して組織の全体のマウント画像をキャプチャします。肝外胆道の神経支配の可視化に加えて、ニューロフィラメント陽性神経線維に対する抗体による標識により、食道に沿って胃に入る迷走神経の走行密度と分布密度を明確に特定することもできます。胆嚢の血管を白いネオプレンラテックスで標識すると、周囲の組織とは対照的に薄い神経線維症が明らかになり、眼底よりも胆嚢の首に神経支配の密度が高くなります。
上部胆管には、不規則で密集した神経ネットワークを形成し、胆道上および胆道内に密集して存在する細い神経束と、胆道の表面に平行に分布する厚い神経束の2種類の神経束が標識されています。総胆管を青色のネオプレンラテックスで、血管を白色のネオプレンラテックスで標識すると、総胆管の端にある細い神経線維と十二指腸乳頭領域を視覚化できます。この手順を試す前に、プロセス全体が完了するまでに2〜3週間かかるため、各実験のタイムラインを再生するように注意してください。
溶液を交換するときに試料を傷つけないように、鉗子で試料を取り除くのではなく、常に溶液を注いでください。このビデオを見た後、このテクニックをさまざまな内臓内のさまざまな神経のラベリングに適用できるようになるはずです。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、サンクス・ムリヌスの肝外胆道におけるニューロフィラメント蛋白質発現を視覚化するためのホルマリン固定全身組織免疫組織化学的アプローチを紹介します。この方法により、特に小さいまたは不規則な内臓器官の神経分布の分析が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫組織化学
- 内臓器官分析
背景
- ホルマリン固定全身組織免疫組織化学は、神経分布を視覚化する技術です。
- サンクス・ムリヌスは内臓器官の神経支配を研究するためのモデル生物として機能します。
- この方法は、標準的な技術で評価が難しい小さいまたは不規則な器官に有利です。
- このプロトコルは簡単で、高い成功率を持ちます。
研究の目的
- サンクス・ムリヌスの胆道内の神経分布を視覚化する。
- 様々な内臓器官の神経支配を分析するための信頼できる方法を提供する。
- 教育目的で手順を実演する。
使用された方法
- 動物をPBSと4%パラホルムアルデヒドでフラッシングし、注入します。
- ホルマリン固定全身組織免疫組織化学染色。
- ニューロフィラメント蛋白質発現の視覚化。
- 大学院生と研究員による実演。
主な結果
- 胆道内の神経分布の成功的な視覚化。
- 小さいおよび不規則な器官に対する方法の有効性の実証。
- ホルマリン固定全身組織免疫組織化学技術の高い成功率。
結論
- ホルマリン固定全身組織免疫組織化学法は神経分布の分析に有効です。
- この技術はサンクス・ムリヌス以外の様々な種に適用できます。
- このプロトコルは研究者にとってシンプルで利用しやすいです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This whole-mount immunohistochemical method enables visualization of nerve distribution in visceral organs, supporting target validation in neurogastroenterology and autonomic nervous system research. By providing high-resolution mapping of innervation patterns in small or irregular organs, it aids mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in biliary tract function. The approach offers predictive confidence for early discovery programs focused on neural modulation of visceral organ physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to vagal and visceral nerve function in biliary tract regulation.
- Operational Value: Provides a reliable method for functional target validation through direct visualization of neurofilament-positive nerve fiber distribution.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying neural pathway involvement in biliary tract homeostasis and disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline innervation maps in the biliary tract.
- Quantitative Output: Enables measurement of nerve fiber density and distribution patterns, supporting assay standardization and reproducibility.
- Platform Reuse: Adaptable to other neuronal antibodies, allowing scalable application across visceral organ systems after initial optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling consistent innervation analysis from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by clarifying neural contributions to biliary tract function in preclinical models.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural innervation changes with functional readouts in translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for neuro-modulatory approaches to biliary and visceral organ disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing nerve distribution in the biliary tract and associated organs like esophagus and stomach.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preparation and high-success-rate immunostaining, enabling reliable compound effect evaluation on neural structures.
- Analytics: Generates quantitative neuroanatomical data on nerve bundle density and distribution, aiding comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling consistent innervation assessment across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology platform for visceral organ innervation studies, adaptable to multiple species and neuronal markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neural control of visceral organs.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a straightforward protocol with high success rate, minimizing technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clear neural anatomy data, reducing late-stage biological risk in neuro-visceral therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated innervation patterns in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, tissue dissection, and confocal or stereo microscopy for whole-mount imaging.
- Dependent on access to primary and secondary antibodies, enzymatic inactivation reagents, and DAB substrate for colorimetric detection.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, permeabilization (e.g., Triton X-100), and antibody incubation conditions across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying to different visceral organs or species, particularly regarding antibody optimization and permeabilization times.
- Limited by the two- to three-week timeline per experiment, requiring planning for longitudinal studies.
