ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

この手順の全体的な目標は、プロテオミクス分析に適した、ヒト心臓僧帽弁からタンパク質を効率的に抽出することです。この方法は、心臓弁膜症の分野における病原性メカニズムの解明に役立つ可能性があり、新たな診断および予後疾患マーカーの特定、そして願わくば治療標的の特定を可能にします。このプロトコールの主な利点は、多くの分析アプリケーションに対応した効率的な抽出ワークフローを提供することです。

その結果、心臓僧帽弁プロテウムのより徹底的な特性評価が得られました。さらに、このプロトコルは、人間の弁に非常によく似ており、弁機能評価の実験モデルで使用されているブタ僧帽弁などの他のシステムにも適用できます。実験手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるStefania Ghilardiです。

ヒト僧帽弁を準備するには、4〜12時間冷え虚血にさらされた摘出した心臓から始めます。クリーンルームで、輸送袋から心臓を取り出し、滅菌したバケツに入れます。次に、心臓をバイオセーフティキャビネットに移します。

そこで、使い捨てメスを使用して、頂点から約4センチメートルの左心室と右心室のレベルで長軸に対して垂直に切断します。次に、心臓を滅菌ドレープに置きます。次に、上行大動脈と肺動脈を脇に移動して、左心房の屋根にアクセスします。

左心房の屋根で、鉗子とピックを使用して左耳介の周りを切断し、僧帽弁を露出させます。僧帽弁は左心室に完全に含まれています。したがって、大僧帽弁尖と小僧帽弁尖を露出させます。

前外側交連と後内側交連は、前部と後部の境界を定義します。次に、はさみと非外傷性鉗子を使用して、左心房と僧帽弁を囲む心室壁の厚さを解剖します。この解剖中に、僧帽弁大動脈弁の連続性を特定します。

次に、後尖を境界とする交連に沿って切断することにより、前僧帽弁尖を後僧帽弁尖から分離します。手順が完了したら、キャビネットのテーブルを70%イソプロピルアルコール溶液と6%過酸化水素溶液で消毒します。次に、僧帽弁の後部弁尖を生理食塩水で洗います。

次に、バルブをそれぞれ1平方センチメートル未満の小さな部分に切ります。ピースを個別にアルミホイルで包み、液体窒素でスナップフリーズします。タンパク質抽出を開始するには、鉗子を使用して液体窒素からサンプルを取り出し、すぐにドライアイスの上に置きます。

サンプルを解凍しないでください。次に、液体窒素で満たされたデュワーフラスコに、乳鉢、関連する乳棒、およびサンプルを置きます。液体窒素は、サンプルを凍結し、グラインダーシステムを冷却するために使用することが重要です。

このステップは生物学的劣化を防ぎ、効率的な粉末化を可能にしますが、安全な取り扱いには技術的なトレーニングが必要です。瞬間凍結したら、乳鉢と乳棒をドライアイスの入ったポリスチレンボックスに入れます。また、ドライアイスの上にヘラを置きます。

次に、サンプルをホイルから取り出し、モルタルにロードします。そして、大きい方の乳棒をその上に置きます。ドライバーを使用して乳棒を回転させ、サンプルを15〜20回粉砕します。

粉砕しながら、冷やしたヘラの先端とサンプルを混ぜます。大きな乳棒を使用した後、小さな乳棒で粉砕プロセスを繰り返します。微粉末を得ることは、効率的なタンパク質抽出にとって重要です。

次に、粉末サンプルを質量がわかっている15ミリリットルの遠心分離チューブに捨てます。次に、冷たいヘラを使用して、残っている材料をモルタルにブラシで塗ります。サンプルの入ったチューブをドライアイスの上に置いて、サンプルの質量を迅速に測定します。

次に、サンプルをガラス製ホモジナイザーチューブに捨てます。次に、サンプル10ミリグラムごとに200マイクロリットルの尿素緩衝液を追加します。これを行う際に、チューブに残った残留物を尿素緩衝アリコートですすいで回復します。

次に、1, 500 rpmで稼働する電動PFTE乳棒を使用してサンプルを均質化します。乳棒をゆっくりとサンプルに押し付け、10回ひねります。次に、ガラスピペットを使用して、粘性のある黄色の上清をきれいな1.7ミリリットルの遠心分離管に移します。

次に、半分の量の尿素を使用して、残りのサンプルで均質化を繰り返します。上清を回収し、以前のコレクションと結合します。次に、チューブをチューブローテーターに30分間置きます。

30分後、チューブを冷たい遠心分離機にロードし、サンプルを13, 000 Gで30分間スピンダウンします。その後、上清を回収します。そして、Bradfordタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。

所定のプロトコールを実施した後、タンパク質抽出物をいくつかの追加処理後に種々の方法を用いて研究した。僧帽弁組織では、二次元電気泳動、液相等電点電気泳動法、液体クロマトグラフィー-質量分析法、および2次元液体クロマトグラフィー-質量分析法により、合計422のタンパク質が同定されました。422のタンパク質は、Gene Ontology解析を使用して分類されました。

細胞外領域には、いくつかの予想されるタンパク質と、他の細胞内および細胞表面タンパク質が含まれていました。その多くは僧帽弁で初めて同定されました。僧帽弁ではこれまで同定されていなかった4つのそのようなタンパク質の存在が、3つのユニークなサンプルの抗体で確認されました。

タンパク質は、セプチン-11、4.5 LIMドメイン、タンパク質1、デルマトポニン、およびアルファ結晶Bです。このプロトコルをマスターすると、適切に実行すれば、ほぼ2時間で完了できます。この手順を試行する際には、高いタンパク質完全性を持つタンパク質の最大収率を得るためには、サンプルがどの移送中にも解凍しないことが重要です。