Name: ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶヒト僧帽弁からのタンパク質抽出法。プロテオーム解析に適した効率的なワークフローを確立し、心臓弁膜疾患の病態メカニズム解明や新規診断マーカー・治療標的の同定に貢献します。

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イタリアの保健省はこの研究を支持した（RC 2013-BIO 15）。彼女の優れた技術的支援のためにBarbara Micheliに感謝します。

このプロトコルでは、正常な心エコー検査のパラメーターにかかわらず、技術的または機能的理由のために、臓器移植から除外された多臓器ドナーからの多臓器外植片（4〜12時間の冷虚血時間、平均6±2時間）の間にヒト心臓を収集する。彼らは、大動脈弁および肺動脈弁の銀行業務のために、ミラノの心血管組織バンクMonzino Cardiologic Centre（ミラノ、イタリア）に送られる。僧帽弁後小葉は臨床目的では使用されないので、ドナーの親族からインフォームドコンセントが得られた後、大動脈弁および肺動脈弁の隔離中に収集される。移植および研究のための組織は、親の同意の後にのみ収集される。倫理委員会のガイドラインに従い、人間の臨床使用（ すなわち、微生物学的、機能的および血清学的問題）に適していない場合にのみ、同意書上で心臓組織の使用を認可する（またはしない）モンティーノ心臓病センター。 1.僧帽弁の準備<ol><li>臓器の外植後（冷虚血時間は4〜12時間）、できるだけ早くヒト僧帽弁を採取する。 </li><li>クリーンルームでは、冷たい（4℃）溶液（ すなわち、生理食塩水または平衡培地EurocollinsまたはWisconsin）を含む輸送用バッグから心臓を取り除く。それをバケツに入れて、バルブの準備を進めるために、バイオセーフティキャビネット（バイオハザード気流、クラスA、グッドマニュファクチャリングプラクティス（GMP）分類）に入れてください。 </li><li>キャビネット内の滅菌使い捨てドレープに心臓を置きます。滅菌使い捨てメスを使用して、心臓をその主軸に対して垂直に、心尖部から約4cm離れた左右の心室のレベルで完全に切断する。 </li><li>左心房の屋根を表示するために、上行大動脈と肺動脈を動かす。 </li><li>滅菌オートクレーブ可能な鉗子とピックを使用して、左耳の周りを僧帽弁を目に見えるようにし、大きな僧帽弁尖（前側）と小さい僧帽弁葉（後側）を識別することを可能にする。 注：前側および後側の交連は、前尖および後部の境界を画定する。 </li><li>滅菌オートクレーブ可能なはさみおよび非外傷性の鉗子を使用して、左心房および僧帽弁全体の周囲の心室壁の厚さを切開する。 </li><li>大動脈弁の連続性を確認する。 注：左心室には、僧帽弁全体と腱索が含まれています。 </li><li>前僧帽弁小葉を後僧帽弁小葉から分離し、後尖を脳室の挿入に沿って切断する（交連）。 </li><li> 生理食塩水中の後弁膜を洗浄する。リーフレットを小片（&lt;1 cm 2 ）に切断し、個々にアルミホイルで包んでください。液体窒素でそれらをスナップフリーズする。 注意：液体窒素を使用する場合は、組織の安全手順に従ってください。 <ol><li>手順の最後に、70％イソプロピルアルコール溶液と6％過酸化水素水でキャビネットのテーブルを衛生化してください。 </li></ol></li></ol> 2.タンパク質抽出<ol><li>鉗子を使用して、液体窒素に保存されたサンプルをピックアップし、直ちにアルミ箔に包みながらドライアイス上に置きます。移送中にサンプルを融解させないでください。 </li><li>粉砕する前に、液体窒素（約500mL）を入れたDewarフラスコに入れることによって、粉砕システム（ 例えば、 CryoGrinder）の磁器/ジルコニウムモルタルおよび乳棒を試料とともに冷やす。 注意：液体窒素を使用するときは、組織の安全手順に従ってください。 </li><li>ドライアイスを入れたポリスチレンボックスに乳鉢と乳棒を入れます。サンプルをアルミホイルから取り出し、モルタルに入れます。 </li><li> グラインドt彼は乳棒を回転させるためにドライバーを使用して、モルタルに対して大きな乳棒で15-20回サンプリングします。粉砕プロセスの間、予め冷却したスパチュラの先端と試料を混合する。 <ol><li>小さな乳棒で繰り返します。 </li></ol></li><li> チューブを反転させ、モルタルの上に置き、それらを一緒に反転させてサンプルをチューブに移動させることによって、前に計量したチューブ（ 例えば、 15mL遠心チューブ）に地上サンプルを移す。予備冷却されたスパチュラを使用して、モルタルからすべての材料を回収する。 <ol><li>移送中のサンプル解凍を避けるために、サンプルをドライアイス上に置いてください。 </li></ol></li><li>サンプルの正味重量を計算する。 </li><li>各サンプルの後に乳鉢と乳棒をきれいにし、オートクレーブまたは200°Cで2時間加熱することによってそれらを除染する。 </li><li>粉末サンプルを遠心分離管からホモジナイザーのガラス管に転倒させて移す。 </li><li>ろ過された尿素バフを加える10mgの粉末組織につき200μLの尿素緩衝液をガラス管に添加した（8M尿素、2Mチオ尿素、4％w / v CHAPS、20mMトリス、および55mMジチオトレイトール）。 注記：遠心チューブに残っている残留粉末サンプルは、計算された量の尿素バッファーの一部を使用して回収することができます。 </li><li>ホウケイ酸ガラス乳鉢およびポリテトラフルオロエチレン（PTFE）乳棒を備えた撹拌機を用いて試料を均質化する。サンプルをゆっくりと捻るような動き（1,500 rpm）で10回押します。 </li><li>上清を回収し、それを清潔な1.7mL遠心管に移す。新たな尿素緩衝液で残りの試料を再度抽出し、最初の抽出の間に使用した容量の半分を加える。 </li><li>手順2.10を繰り返します。 </li><li>上清を回収し、それをステップ2.11の上清と合わせる。合わせた上清をチューブローテーター上に30分間置く。 </li><li> 13,000 xgおよび4℃で30分間チューブを遠心分離する。 </li><li>上清を回収するBradfordタンパク質アッセイを用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質濃度を測定する。サンプルを使用するまで-80℃で保存します。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコールの1つの重要なステップは、試料を凍結させ、粉砕システムを冷却するために液体窒素を使用することである。液体窒素の使用は生物分解を防ぎ、パウダー化を効率的に行うことができますが、安全な取り扱いのためには特別な訓練が必要です。 このプロトコールでは、標準的なモルタルおよび乳棒から小さなサンプルを回収することが困難であるため、サンプル粉砕用の粉砕システムが特徴です。この場合、小さな試料はモルタル表面上に微細な粉末として広がり、収集が困難になる。別の利点は、グラインダが電動化され、再現可能な方法でより多くのサンプルを処理することができ、疲労を増やさないことである。粉砕機の使用に関する1つの制限は、乳棒がモルタルに対して効果的に押されるためには小さくなければならない試料のサイズ（100mg以下）であることである。さらに、粉砕機の構成要素は、洗浄のための使用の間に室温に温めなければならない<html> g。結果として、手順は時間がかかり、多くのサンプルが毎日処理される場合、多くのセットが必要となる。 さらなる重要なステップは...

最近の証拠は、mRNA合成後に生じる多くの調節機構の役割の理解を変化させている。実際、翻訳、転写後およびタンパク質分解プロセスは、タンパク質の存在量および機能を調節することができる。転写産物レベルがタンパク質存在量の主な決定因子であると仮定して、mRNA濃度が対応するタンパク質のプロキシであると言うドグマは部分的に改訂されている。細胞1,2内のタンパク質を調節するために起こる。 さらに、タンパク質は最終的に細胞の機能を決定し、したがって自己分泌、傍分泌および内分泌因子に応答して動的変化を起こすことができるその表現型を指示する。血液媒介メディエーター;温度;薬物治療;病気が発症する。このように、タンパク質レベルに焦点を当てた発現解析は、プロテオームの特徴を明らかにするとともに、疾患病因の一部として起こる重大な変化を解明するのに有用である3 。 したがって、既存の技術的課題にもかかわらず、プロテオミクスが健康状態や病状を明らかにする機会が大いにあります。プロテオミクスが貢献できる研究の特に有望な分野には、以下のものが含まれる：任意のレベル（ すなわち、細胞全体または組織、細胞内コンパートメントおよび生物学的液体）におけるタンパク質発現の変化の同定;疾患の診断および予後に有用な新規なバイオマーカーの同定、検証および検証;薬効と毒性の評価だけでなく、治療目的でも使用できる新しいタンパク質標的の同定4 。 複雑さを捉えるプロテオームは技術的な課題である。現在のプロテオミクスツールは、変化したタンパク質レベルの同定、定量化、および検証のための大規模で高スループットの分析を行う機会を提供する。さらに、最も豊富なタンパク質によって引き起こされる干渉を回避することを目的とする分画および濃縮技術の導入は、最も豊富でないタンパク質を含むことによってタンパク質同定を改善した。最後に、プロテオミクスは、タンパク質機能の重要なモジュレーターとして徐々に出現する翻訳後修飾の分析によって補完されてきた。 しかし、分析中の生物標本における試料調製およびタンパク質回収は、プロテオミクスのワークフローにおける制限的なステップのままであり、潜在的な落とし穴の可能性を高めます5 。実際、最適化されなければならない分子生物学技術の大部分において、最初のステップは、組織ホモジナイズイオンおよび細胞溶解、特に増幅方法が存在しない低濃度のタンパク質の分析中に起こる。さらに、タンパク質の化学的性質は、それら自身の回復に影響を及ぼす可能性がある。例えば、高度に疎水性のタンパク質の分析は、等電点電気泳動の間に容易に沈殿するため、膜貫通タンパク質はほとんど不溶性であるため、非常に難しい（参考文献5で検討されている）。さらに、組織組成の変動性は、普遍的な抽出方法を開発する上で重要な障壁となる。最後に、臨床検体のほとんどすべてが限られているため、最小限の検体量で最大の回収率と再現性でタンパク質を調製することが不可欠です。 この研究は、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである、正常ヒト心臓僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化されたプロトコールを記載する。正常な僧帽弁は、心臓の左心房と左心室との間に横たわるレックス構造（ 図1 ）。心房から心室への血流を制御し、逆流を防止し、全身への適正な酸素供給を保証し、それによって十分な心拍出量を維持するのに重要な役割を果たす。しかし、それはしばしば細胞性が低く、主に細胞外マトリックス中の成分が少ない「不活性」組織であると考えられている。これは、正常な状態では、常在性の弁間質細胞（VIC）が低いタンパク質生合成速度で静止表現型を示すためである7 。 しかしながら、病理学的状態では、海綿体におけるVICの数が増加し、それらのタンパク質合成が他の機能的および表現型の変化と共に活性化されることが実証されている8 。したがって、驚くべきことではない文献は、増加した数の活性化VICが同定されたタンパク質の比較的高い数を説明し得る病理学的僧帽弁9,10の分析に焦点を当てている。 結論として、本プロトコールは、僧帽弁タンパク質成分の研究を通して、僧帽弁疾患に関与する病原機構の理解を発展させるのに役立つ可能性がある。事実、根底にある病理学的プロセスのより深い理解は、現在の介入適応症が血行力学的考察に主に基づいている弁疾患の臨床管理を改善するのに役立つ可能性がある。

<table><tbody><tr><td>生理食塩水</td><td></td><td></td><td>0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>バランスの取れた臓器の輸送媒体。400 mLのEurocollins Aと100 mLのEurocollins Bを組み合わせて、バランスの取れた培地を得ます Eurocollins</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>Balanced organ's transport medium.400mLのユーロコリンズAと100mLのユーロコリンズBを組み合わせて、バランスの取れた培地を得る ユーロコリンズ</td></tr><tr><td>ウィスコンシン</td><td>ブリッジライフ</td><td>RM/N 4081</td><td>バランスの取れた臓器の輸送媒体</td></tr><tr><td>バイオハザード垂直流空気</td><td>バーディノーラ</td><td></td><td>クラスA GMP分類</td></tr><tr><td>デュワーフラスコ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>ナルジーン 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>クライオグラインダーシステム</td><td>OPS診断</td><td>CG 08-01</td><td>乳鉢、乳棒、ドライバーを含むグラインダーシステム</td></tr><tr><td>ステンレス製鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製ヘラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨て滅菌メス</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製ハサミ</td><td></td><td></td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>ステンレス製ピック</td><td></td><td></td><td>オートクレーブ可能</td></tr><tr><td>使い捨て滅菌ドレープ</td><td>Mon&Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td></td><td></td><td></td>による滅菌液</tr><tr><td>過酸化</td><td></td><td></td>水素による滅菌液 <td>6% 過酸化水素</td></tr><tr><td>マイクロピペット、1 mL、チップ</td><td></td><td></td><td></td>付き</tr><tr><td>15 mL 遠心分離管</td><td>VWR 国際</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 遠心分離管</td><td>VWR国際</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>尿素緩衝液</td><td></td><td></td><td>8 M尿素、2 Mチオ尿素、4 % w / v CHAPS、20 mM Trizma、55 mM ジチオトレイトール</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Σaldrich</td><td>U6504-1KG</td><td>尿素緩衝液に使用する</td></tr><tr><td>チオ尿素</td><td>Σaldrich</td><td>T8656</td><td>尿素緩衝液</td></tr>に使用する <tr><td>CHAPS</td><td>Σaldrich</td><td>C3023-5GR</td><td>尿素緩衝液に使用する</td></tr><tr><td>ジチオトレイトール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D0632-5G</td><td>尿素緩衝液</td></tr><tr><td>シリンジ 50 mL</td><td>PIC</td><td></td><td>尿素緩衝液</td></tr><tr><td>0.22 &micro のろ過に使用。mフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGP033RB</td><td>尿素緩衝液</td></tr><tr><td>PFTE乳棒、2mL</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Potter-Elvehjemホモジナイザーの一部</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスモルタル</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Potter-Elvehjemホモジナイザーの一部</td></tr><tr><td>攪拌</td>機 <td>VELP scientifica</td><td>Stirrer DLH</td><td>Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>ブラッドフォードタンパク質アッセイによる均質化に使用されます</td><td>バイオ・ラッドの研究所</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>チューブローテーター</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンボックス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td>1.7 mL遠心チューブの遠心分離用(13,000 x g</td></tr><tr><td>Freezer -80&deg);C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精密バランス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td><td></td><td>滅菌用</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td>用極低温手袋</tr><tr><td>手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロ仕様の強制換気と自然空気対流オーブン</td><td></td><td></td><td>滅菌用</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X solution</td></tr><tr><td>ProteoExtract Protein Precipitation Kit</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td></td><td>www.cytoscape.org version 2.7</td><td>Gene Ontology analysis</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>version 3.0.3</td><td>プラグイン遺伝子オントロジー解析用</td></tr><tr><td>AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus</td><td>Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>CryABに対するマウスモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>Septin-11抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>セプチン-11に対するウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>FHL1</td>抗体 <td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>FHL-1</td></tr><tr><td>Dermatopontin抗体に対する</td>ウサギポリクローナル抗体<td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin</td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0.5ML</td><td>免疫ブロッティング用二次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG HRP</td><td>バイオ・ラッド ラボラト</td>リー <td>170-5046</td><td>免疫ブロッティング用二次抗体</td></tr></tbody></table>

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

細胞のプロテオームの解析は、複雑な生物システムに存在するタンパク質の大規模な同定と定量を可能にする技術の開発による疾患の根底にある分子メカニズムを解明するのに役立ちます。プロテオームアプローチから得られた知識は、疾病の根底にある病原性メカニズムをより良く理解し、新規の診断および予後の疾患マーカーの同定を可能にする。しかし、心臓僧帽弁は、プロテオグリカンおよびコラーゲン富化細胞外マトリックスの細胞性が低いため、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである。これは、全体的なプロテオーム分析のためにタンパク質を抽出することを困難にする。この研究は、定量的プロテオミクスおよびイムノブロッティングのような後続のタンパク質分析と互換性のあるプロトコールを記載する。これにより、データの関連性を考慮することができますgタンパク質の発現を、定量的mRNA発現および非定量的免疫組織化学的分析に関するデータと比較した。実際、これらのアプローチは、一緒に実施されると、mRNAから翻訳後タンパク質改変まで、疾患の根底にある分子メカニズムのより包括的な理解につながるであろう。したがって、この方法は、心臓弁の生理病理学の研究に関心のある研究者に関連する可能性がある。

ウレア緩衝液中のタンパク質の抽出および溶解は、等電点電気泳動（2次元電気泳動（2-DE） 11および液相等電点電気泳動（IEF） 12 ）に基づくプロテオーム法およびLaemmli緩衝液13での希釈後のイムノブロッティングプロテアーゼ阻害剤カクテル14を含有する。 ゲルフリー質量分析法（ すなわち、データ非依存性質量分析（LC / MS E ）および2次元LC / MS E （2D-LC / MS E ）に結合された液体クロマトグラフィー）尿素およびチオ尿素を除去するためにさらに処理される必要があり、これはその後のタンパク質消化および液体クロマトグラフィー分離を妨害する可能性がある...

ヒト僧帽弁のタンパク質組成は、未分化であり、その分析は細胞密度が低く、したがって低タンパク質生合成によって複雑であるため、まだ未知である。この研究は、僧帽弁プロテオームの分析のためにタンパク質を効率的に抽出するためのプロトコールを提供する。

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

この手順の全体的な目的は、プロテオーム解析に適したタンパク質をヒト心臓の僧帽弁から効率的に抽出することです。この手法は、心臓弁疾患の分野における病原性メカニズムの解明に寄与し、新規の診断および予後マーカー、そして期待される治療ターゲットの特定を可能にする可能性があります。本プロトコルの主な利点は、多くの分析アプリケーションに対応した効率的な抽出ワークフローを提供することにあります。その結果、心臓の僧帽弁プロテオームのより詳細な特性評価が可能になります。さらに、このプロトコルは、ヒトの弁と酷似しており、弁機能評価の実験モデルとして用いられているブタ僧帽弁などの他の系にも適用できます。実験手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者である Stefania Ghilardi が行います。ヒト僧帽弁を準備するには、4～12時間の冷虚血状態にある摘出心から開始します。クリーンルームで、輸送バッグから心臓を取り出し、滅菌済みのバケットに入れます。次に、心臓をバイオセーフティキャビネットに移します。そこで、使い捨てメスを用い、心尖部から約4cmの左心室および右心室の高さで、長軸に対して垂直に切断します。次に、心臓を滅菌ドレープの上に置きます。その後、上行大動脈と肺動脈を脇に寄せ、左心房 छतにアクセスします。左心房の天井部分において、ピンセットとピックを用いて左心耳の周囲を切開し、僧帽弁を露出させます。僧帽弁は完全に左心室内に収まっています。したがって、僧帽弁の前尖（大弁尖）と後尖（小弁尖）を露出させてください。前外側および後内側交連によって、前方領域と後方領域の境界が定義されます。次に、はさみと非外傷性ピンセットを用いて、左心房および僧帽弁を囲む心室壁の厚みを剥離します。この剥離操作中に、僧帽弁・大動脈弁連続性を確認してください。次に、後尖を縁取る交連に沿って切断し、僧帽弁前尖を後尖から分離します。処置が完了したら、キャビネットの作業台を70% isopropyl alcohol溶液および6% hydrogen peroxide溶液で消毒します。その後、僧帽弁後尖を生理食塩水で洗浄します。次に、弁を1平方センチメートル未満の小さな断片に切り分けます。各断片を個別にアルミホイルで包み、液体窒素で急冷します。タンパク質抽出を開始するには、ピンセットでサンプルを液体窒素から取り出し、直ちにドライアイス上に置きます。サンプルを解凍させないでください。次に、液体窒素を満たしたデュワー瓶に、乳鉢、乳棒、およびサンプルを入れます。液体窒素を使用してサンプルを凍結させ、粉砕システムを冷却させることが極めて重要です。この工程により生物学的分解を防ぎ、効率的な粉砕が可能になりますが、安全に扱うには技術的なトレーニングが必要です。急速冷凍後、乳鉢と乳棒をドライアイスを入れたポリスチレン製ボックスに入れます。また、スパチュラもドライアイスの上に置きます。次に、サンプルをホイルから取り出し、乳鉢に入れます。そして、その上に大きな乳棒を配置します。ドライバーで乳棒を回転させ、サンプルを15〜20回研磨します。研磨しながら、冷却したスパチュラの先端でサンプルを混ぜ合わせます。大きな乳棒を使用した後、より小さな乳棒を用いて研磨工程を繰り返します。効率的なタンパク質抽出には、微粉末を得ることが極めて重要です。次に、粉末化したサンプルを質量が既知の15 millileter遠心チューブに移します。その後、乳鉢に残っている物質をコールドスパチュラを用いてチューブ内に集めます。サンプルが入ったチューブをドライアイス上に保持し、速やかにサンプルの質量を測定します。次に、サンプルをガラス製ホモジナイザーチューブに移します。その後、サンプル10 mgにつき200 µLの尿素バッファーを加えます。その際、尿素バッファーの分注液を用いてチューブ内の残渣を洗い出し、回収してください。次に、1,500 rpmで回転する電動PTFEペッスルを用いてサンプルを均質化します。ペッスルをひねるようにしながら、ゆっくりとサンプルに10回押し付けます。続いて、粘性のある黄色の超上清をガラスピペットを用いて清潔な1.7 milliliter遠心チューブに移します。次に、残りのサンプルに対して、尿素量を半分にしてホモジナイズを繰り返します。上清を回収し、前回の回収分と合わせます。その後、チューブをチューブローテーターに設置し、30分間回転させます。30分後、チューブを冷却遠心機にセットし、13,000 Gで30分間遠心分離します。その後、上清を回収します。そして、Bradford法を用いてタンパク質濃度を測定します。規定のプロトコルを実施後、いくつかの追加処理を行い、さまざまな方法を用いてタンパク質抽出物を解析しました。二次元電気泳動、液相等電点電気泳動、液体クロマトグラフィー質量分析、および2次元液体クロマトグラフィー質量分析により、僧帽弁組織から計422種類のタンパク質が同定されました。これら422種類のタンパク質は、Gene Ontology解析を用いて分類されました。細胞外領域には、いくつかの予想されたタンパク質に加え、その他の細胞内および細胞表面タンパク質が含まれていました。その多くは僧帽弁において初めて同定されたものでした。これまで僧帽弁で同定されていなかったこれら4つのタンパク質の存在は、3つの独立したサンプルを用いて抗体により確認されました。使用するタンパク質は、Septin-11、Four and a half LIM domains protein one、Dermatoponin、およびalpha crystalline Bです。このビデオを視聴することで、同定および定量のために心臓の僧帽弁からタンパク質を抽出する方法を十分に理解できるはずです。このプロトコルを習得し、適切に実施すれば、ほぼ2時間で完了させることができます。本手順において、高いタンパク質完全性を維持しつつ最大の収量を得るためには、移送中のいかなる段階においてもサンプルを融解させないことが極めて重要です。

optimized-protocol-for-extraction-proteins-from-human-mitral

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

若い胚性マウス弁におけるタンパク質発現の解析は、利用可能な組織が限られているために妨げられてきました。この原稿は、ウェスタンブロット解析のために、発生中の胚性マウス弁領域からタンパク質を調製するためのプロトコルを提供します。...

途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

我々は、LC-MS / MSシステムを使用して共調節相互作用タンパク質の精製のための方法を確立しました。...

LC-MS / MS分析を用いた核補因子と相互作用するタンパク質のハイスループット同定のためのタンパク質調製方法

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。...

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

ミトコンドリアは、細菌や細胞質相手から乖離したリボソームを特化しました。HEK 細胞の彼らのネイティブのコンパートメントからの mitoribosomes の取得方法を紹介します。懸濁細胞からミトコンドリアの分離と mitoribosomes...

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

ポリソーム分離灌流マウスの心臓でプロファイリングを実行するためのプロトコルをご紹介します。心の灌流、プロファイリング、ポリソーム Mrna、Mirna、・ ポリソーム...

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

このプロトコルでは、相補的な分析とオミックス技術の天然有機物と異なる生態系における微生物のプロテオミクスの完全にペアの特性で最高潮に達する単一のスループットについて説明します。この方法は、代謝と環境変化への応答を予測する温室効果ガス生産を記述するため重要な変換を識別するための堅牢な比較を許可します。...

シングル スループット複雑な天然有機物の混合物の評価の補完的な高解像度分析の手法

ここでは、洗剤とクマシーブルーへの暴露を最小限に抑えるミトコンドリア supercomplexes...

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

プロテオームスケールでのタンパク質の発見と定量に適合する高品質のミトコンドリア単離のための2段階プロトコルを提示します。私たちのプロトコルは遺伝子工学を必要としないため、あらゆる初代細胞や組織からのミトコンドリアの研究に適しています。...

タンパク質の発見と定量を改善するためのミトコンドリアの2段階タグフリー分離

この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。...

げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離 

学ぶヒト僧帽弁からのタンパク質抽出法。プロテオーム解析に適した効率的なワークフローを確立し、心臓弁膜疾患の病態メカニズム解明や新規診断マーカー・治療標的の同定に貢献します。

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

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