脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

中大脳動脈閉塞モデルの皮質線条体スライスモデルにおけるアシドーシス治療の全体的な目標は、脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護効果を研究することです。この方法は、アシドーシスのポストコンディショニングが虚血性脳損傷をどのように保護するかという重要な質問に答え、脳卒中治療の新しい戦略を開発するのに役立ちます。この手法の主な利点は、広く利用可能な実験モデルを使用して、アシドーシスのポストコンディショニングの神経保護を研究できることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるYarong Zhengです。まず、首を切られたマウスの頭蓋骨から細いヘラで脳を取り出し、5%の二酸化炭素と95%の酸素で平衡化された氷冷の通常のACSFを含むビーカーに慎重に落とします。凍結沈殿物接着剤をビブラトンプレートに2つのストリップで塗布します。.

ブレードから最も遠い接着剤ストリップに3パーセントのアガロースを一片置き、脳を支えます。次に、鉗子を使用して脳を濾紙に移します。前頭ポールと小脳を刃で切り取ります。

脳組織を自由糊の上に垂直に置き、脳をアガロースに寄りかからせます。氷冷したACSFをカッティングリザーバーに追加して脳を沈め、アイスホルダー領域に氷を追加します。貯留層内のACSFを5%の二酸化炭素と95%の酸素で泡立てたままにします。

ビブラトンを400ミクロンセクションを切断するように設定し、脳を切断刃に対して正しく配置した後、スタートストップボタンを押して自動切断を開始します。先端がカットされたパスツールピペットを使用して、5つの脳スライスを1つずつ移し、5%の二酸化炭素と95%の酸素で泡立った氷冷した通常のACSFのティッシュホルダーに入れます。室温で30分後、脳スライスを摂氏37度の水浴に10分間入れて、シナプス機能を回復させます。

グルコースフリーのACSFと酸性のACSFを摂氏37度のウォーターバスに入れ、5%の二酸化炭素と95%の窒素、20%の二酸化炭素と80%の酸素で溶液をそれぞれ30分間泡立てます。5つの脳スライスのうち4つを予熱した摂氏37度のグルコースフリーACSFに慎重に移し、15分間インキュベートします。酸性プレコンディショニングの時間枠を調べるには、1 つのスライスをグルコースを含まない ACSF から直接酸性 ACSF に移し、他の 3 つのスライスを通常の ACSF に移して再灌流します。

3分後、酸性ACSFのスライスを通常のACSFに移します。次に、通常のACSFで5分後、通常のACSFからスライスの1つを酸性ACSFのティッシュホルダーに3分間移します。再灌流の15分後に同じ方法で別のスライスを移します。

グルコースフリーACSFに配置されたが酸性ACSFには配置されなかった残りのスライスは、酸素グルコース欠乏グループとして設定されます。ACSFからのスライスをTTC溶液を含む24ウェルプレートのウェルに移します。溶液中のスライスを伸ばします。

次に、摂氏37度で浅瀬の浴中で30分間インキュベートします。次に、スライスをホイルで覆われた清潔で重量を量った1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移し、スライスの乾燥重量を測定します。秤量後、エタノールとジメチルスルホキシドの1対1の溶液を10対1の体積対重量比でチューブに添加することにより、ホルマザンを抽出します。

光を避けて24時間インキュベートします。翌日、エタノールジメチルスルホキシド溶液をチューブから96ウェルプレートに移し、プレートリーダーを使用して490ナノメートルでの吸光度を測定します。まず、つま先のつま先つまみ反射がないことにより、適切な麻酔を確認します。

次に、LDFプローブを頭蓋骨に取り付けた麻酔マウスを仰臥位に置き、滅菌綿糸を使用して固定します。首の剃った皮膚を75%エチルアルコールで消毒します。次に、首の正中周囲の皮膚を鈍く切開した後、鉗子で軟部組織を解剖して血管を露出させます。

露出した組織に生理食塩水を1滴加えて、水分を保ちます。次に、眼科用鉗子を使用して、周囲の組織と迷走神経から総頸動脈を解剖します。迷走神経を傷つけないように注意してください。

総頸動脈の遠位端にマイクロ血管クランプを配置します。そして、近位端で6-0シルク縫合糸でデッドノットを結びます。次に、一時的な縫合糸としてクランプの近位に緩い結び目を結びます。

次に、マイクロ眼科用ハサミを使用して、2つの結び目の間に小さな縦方向の切開を行い、デッドノットにできるだけ近づけます。次に、12ミリメートルの先端が鈍いモノフィラメントを切開部から動脈内腔に挿入し、数ミリメートル進めます。モノフィラメントの先端の周りの緩い結び目を締めてから、クランプを取り外します。

次に、眼科用鉗子を使用して、LDFソフトウェアが血流の急激な減少を示すまで、フィラメントを内頸動脈に進めます。オクルージョンの開始時間を記録します。次に、LDFプローブを切断し、マウスを摂氏30度のインキュベーターに1時間閉塞させます。

閉塞開始から55分後、イソフルランで動物を再麻酔し、動物を以前と同じように配置します。次に、首の切開部を開き、総頸動脈を再露出させます。閉塞期間後、眼科用鉗子を使用してフィラメントを静かに引き出し、再灌流を達成します。

次に、結び目を締めて、一時的な縫合糸を永久縫合糸に変えます。アシドーシス治療では、ノーズコーンから吸入するガスを20%の二酸化炭素、20%の酸素、60%の窒素に5分間交換します。.切開部を中断した外科的縫合糸で閉じた後、マウスが意識を取り戻すまで、マウスを摂氏30度の加熱ケージに入れます。

このヒストグラムは、このビデオで示されているように、酸素グルコース欠乏および酸性ポストコンディショニング後の皮質スライスで実施されたTTCアッセイの結果を示しています。3分間のアシドーシス治療は、治療がすぐに開始された場合、または酸素グルコース欠乏の5分後に開始された場合は神経保護的であったが、スライスが15分間再灌流された場合は神経保護的であった。マウスを60分間の中大脳動脈閉塞に供し、再灌流後5分、50分、または100分後に20%二酸化炭素を5分間吸入して治療した。

梗塞の量は、黒点線で示されているように、再灌流の24時間後に染色した2つ、3つ、5つのトリフェニルテトラゾリウム塩酸塩によって定量されました。このヒストグラムは、各条件の梗塞体積の割合を示しています。酸性ポストコンディショニングからの神経防御は、再灌流後50分に発症時間が遅れた場合でも強固でした。

しかし、100分後に開始されたアシドーシス治療は虚血性損傷をブロックしませんでした。ビデオを見た後、脳スライスのOGDモデルとマウスのMSOモデルでアシドーシスポストコンディショニングの神経保護を研究する方法についてよく理解しているはずです。手順を試みる際には、アシドーシスの延長と持続時間が保護効果を再現するために非常に重要であることを覚えておくことが重要です。