脳Microslicesの興奮毒性刺激インビトロ脳卒中のモデル

我々は、興奮毒性媒介性脳損傷に関与する分子メカニズムを調べるために使用できる脳切片モデルを開発した。この技術は、生存可能な成熟した脳組織を生成し、部分的に無傷の神経回路、細胞間相互作用、およびシナプス後区画を維持しながら、実験に必要な動物の数を減少させる。

この手順の全体的な目標は、脳のマイクロスライスに細胞傷害性刺激を適用して、in vitro 脳卒中モデルを作成することです。これは、最初に新たに分離された脳からマイクロスライスを準備することによって達成されます。2番目のステップは、穏やかな攪拌でマイクロスライスを平衡化することです。

平衡化すると、マイクロスライスはさまざまな実験的操作を受ける準備が整います。最終的に、結果は、マイクロスライスが生成後少なくとも2時間生存可能であることを示しています。初代胚性ニューロン培養などの他の既存の技術に対する私たちの技術の主な利点は、私たちの技術が複数の細胞タイプを含む成熟した脳組織のスライスを利用しているため、無傷の脳組織をより代表していることです。

最初のステップは、新鮮な脳組織を取得することです。脳を少量の温かいクレブスバッファーに浸します。残った皮膚、毛皮、血液を取り除くには、温かいクレブスバッファーで湿らせた2枚の濾紙でマックルウェインチョッパーを準備します。

準備ができたら、脳をチョッパーのステージに置きます。脳と濾紙を温かいクレブバッファーで湿らせながら、脳が滑らないように働きます。表面に液体が溜まりすぎないようにしてください。

脳を250マイクロメートルの冠状切片にスライスします。次に、ステージを90度回転させ、250マイクロメートルの矢状スライスを作成します。このステップの後、脳の切片はマイクロスライスと呼ばれます。

マイクロスライスを丸い底の2つに置き、10〜15ミリリットルの温かいクレブバッファーを入れます。個々のマイクロスライスが懸濁するまでチューブを静かに攪拌し、重力下で沈殿させます。懸濁した細胞の破片により濁る上清を慎重に取り除き、10ミリリットルの新鮮で温かいクリープバッファーをチューブに加えます。

完全に洗浄したら、洗浄手順を4回繰り返して、破片の大部分を取り除きます。マイクロスライスを摂氏37度で穏やかに振ったり反転させたりして平衡化し、クレブスバッファーを15分ごとに合計1時間交換します。この時間の後、2ミリリットルの新鮮な37°Cのクレブス緩衝液を追加し、15〜20マイクロスライスを平底ポリスチレン5ミリリットルチューブに移します。

滑らかなエッジを備えた非常に幅の広いピペットチップを使用して、各マイクロスライスが酸素化された雰囲気から数ミリメートル離れないように、マイクロスライスを単層でチューブの基部に均等に広げます。適切に配置されたら、マイクロスライスを摂氏37度の水浴でインキュベートして、マイクロスライスに適切な酸素供給を提供します。最良の結果を得るためには、マイクロスライスが直接ガスと接触する機械的な中断を避けるために、ガスラインが表面のすぐ上に位置して、マイクロスライス懸濁液上にカルボゲンを連続的に通過させます。

マイクロスライスを正しく通気することが重要です。ガスラインは、マイクロサイト懸濁液の表面から適切な距離で配置することが重要です。複数のラインを融合させることで、複数の刺激を与えることができます。

同時に、さまざまな刺激を使用できます。この例では、マイクロスライスはAMPA刺激を受けます。マイクロスライスを細胞傷害性刺激またはクレブスバッファーのみで処理します。

刺激群のコントロール用。刺激後のさまざまな時間にインキュベーション溶液を取り出し、目的の時点で300マイクロリットルの氷冷均質化バッファーと交換します。刺激後、ガラステフロンダウンホモジナイザーを使用して氷上のマイクロスライスを均質化し、さらなる分析の準備が整うまで摂氏マイナス80度で均質なものを保存します。

呼吸数は、ニワトリの前脳から採取されたマイクロスライスが生成後最大2時間生存可能であることを示しています。マイクロスライスに見られる高いA TPレベルと低いA DPレベルも、生細胞の特徴です。この例では、組織のカリウム含有量を測定し、解剖後のバックグラウンドのすぐ上にあることがわかりましたが、クレブス緩衝液とのインキュベーションで増加したため、WABEおよびEGTAの添加により組織のカリウム含有量が減少し、マイクロスライスが通常活発にカリウムを送り込み、レベルが死んだ組織または間質性空間に閉じ込められたカリウムによるものではないことを示しました。

ここでは、雄ラットの線条体と感覚皮質からマイクロスライスを生成し、高カリウムクレブスバッファーを使用して脱分極しました。接着剤のN two Bリン酸化の速度は、皮質と線条体の間で異なりましたが、接着剤のA 1のリン酸化の速度は2つの領域間で類似していました。このテクニックを習得すると、正しく実行すれば約2時間で完了できます。