Name: 脳Microslicesの興奮毒性刺激インビトロ脳卒中のモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶ脳マイクロスライスを用いた興奮毒性刺激による脳卒中のインビトロモデル構築法。成熟した脳組織の細胞相互作用を保持しながら、動物使用量を削減して脳損傷の分子メカニズムを研究できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会、ハンター医学研究所、およびニューカッスル大学からの研究資金によってサポートされていました。

すべての手順は、NSW動物研究法、NSW動物研究の規制、およびのための実践オーストラリアコードを含む、関連するガイドラインと規則によれば、だけでなく、ニューカッスル大学動物実験倫理委員会から承認を得て実施しているお手入れと科学的目的のための動物の使用。 1。脳組織の解剖<ol><li>断頭により12週齢の雄性ラットを生け贄に捧げる。ラットは魅力的で断頭により屠殺され得るか、最初の70％のN 2と30％O 2中イソフルラン（5％誘導1.5〜2％で維持）で麻酔し、次いで、断頭することができる。 </li><li>可能な限り迅速に頭蓋骨から脳を削除（理想的には、これは2分未満で実行する必要があります）。 </li><li>フリーハンド切開によって皮質を除去します。舞するように、切開は、可能な限り少ない脳への損傷、可能な最小時間で実行されるべきであるスライスの整合性をntain。 </li><li>任意の残留皮膚を除去するために、 等毛皮、血液、37℃のKrebs緩衝液（118 mM塩化ナトリウム、4.7mMの塩化カリウム、1.3mMの塩化カルシウムを少量の（3-5）中脳を浸す1.2mMのリン酸二水素カリウム、1.2mMの硫酸マグネシウム、25mMの炭酸水素ナトリウム、11.7 mMグルコース、95％酸素/ 5％二酸化炭素（カルボゲン）、pH7.4で平衡化した0.03 mMのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA））。 </li></ol> 2。 Microslicesの調製<ol><li>濾紙2スライスが配置され、暖かいクレブス緩衝液で湿らされた上でマッキルウェーンチョッパーのステージに脳を置きます。脳と暖かいクレブス緩衝液で湿らせた濾紙を維持しますが、そう濡れていない脳の周りにスライドさせる可能性があります紙の表面上のフリーの液体があった。 </li><li> 250μmの冠状切片に脳をスライス。栄養素、酸素、および第廃棄物として通常、血液供給と交換されるのは、孤立した神経組織内の組織を包囲する流体と交換され、スライスのサイズが適切な酸素と栄養交換が発生することができるように、厚さが400μm以下であってはならない。 </li><li>マッキルウェーン段階を90°回転。 </li><li> 250μmの矢状スライスに脳をスライス。本明細書では、これらの脳切片（組織の厚さに応じて可変長の250ミクロン×25​​0ミクロンスライス）microslicesと呼ばれる。 </li><li> 10〜15ミリリットルを37℃クレブス緩衝液（使用クレブス緩衝液の量は組織の量に依存します）と丸底チューブにmicroslicesを配置します。 </li></ol> 3。 Microslicesの平衡化<ol><li>静かに、個々のmicroslicesが中断されるまで攪拌した後、彼らは重力下で沈降させる。 </li><li>慎重に新鮮な37℃に起因する浮遊細胞破片に曇っされる、上清を除去し、10ミリリットルを追加クレブスは、チューブにバッファ。 </li><li>破片の大半を除去することになるであろう、この洗浄操作を4回繰り返します。 </li><li>これに続いて、穏やかに振とう/反転に37℃でmicroslicesを平衡化し、合計で1時間ごとに15分を緩衝クレブスを変更してください。 </li><li>このとき、2ミリリットルの新鮮な37℃のKrebs緩衝液を追加し、平底ポリスチレン15〜20 microslices（microslice懸濁液150μl）を作成できる平滑化エッジ（エキストラワイドボアピペットチップを用いて5 mlチューブP1000チップの端から〜2ミリメートルカット）。各microsliceは含酸素雰囲気から数ミリメートルより一層ならないように、単層チューブの底に均等にmicroslicesを広げた。 </li></ol> 4。興奮毒性刺激<ol><li> 37℃でmicroslicesをインキュベートし、継続的に位置されるガスラインを使用し、150μlのmicroslice懸濁液の表面にカーボゲン渡す（機械的破壊を避けるため）だけでmicroslice懸濁液の表面の上方編。 </li><li> 150μlの5 mMのグルタミン酸+100μMのクレブス緩衝液中のグリシン（興奮毒性刺激：最終濃度2.5 mMのグルタミン酸+50μMのグリシン）のいずれかでmicroslicesを治療または150（無刺激コントロール）を単独でクレブス緩衝液を含有した。種々の刺激は、このステップにおいて使用することができる（これらに限定されないが、AMPA、NMDA +グリシン、KClを脱分極し、酸素/グルコース枯渇）。 </li><li>様々な時間刺激後（0、30、60、90、120、及び300秒）でインキュベーション溶液を除去し、氷冷均質化緩衝液（30mMのトリス、pH7.4、1mMのエチレングリコールを300μlと交換し四酢酸、4 mMのEDTA、100μMモリブデン酸アンモニウム、5mMのピロリン酸ナトリウム、25mMのフッ化ナトリウム、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、1mMのphenylmethanesulfonylfluoride、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 </li><li>ガラステフロンダウンスホモジナイザーを用いて、氷上でmicroslicesを均質（20ストローク、700回転）。 </li><li>ストア-80℃でホモジネート、 等の様々なシグナル伝達分子、細胞死の分子は、ウェスタンブロットによって測定することができる。 </li></ol>

<ol><li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+challenges+and+opportunities+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li>
<li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cAMP%2FPKA+and+MAPK+signaling+in+neuronal+cells+is+dependent+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage.</a> Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).</li>
<li>Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effect+of+protein+synthesis+inhibitors+on+potassium+deficiency-induced+apoptotic+cell+death+in+immature+and+mature+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures.</a> J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).</li>
<li>Kristensen, B. W., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+excitotoxic+profiles+of+ATPA%2C+AMPA%2C+KA+and+NMDA+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).</li>
<li>Lecrux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+hypertensive+rats+are+highly+vulnerable+to+AMPA-induced+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions.</a> Stroke. 38, 3007-3015 (2007).</li>
<li>Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+influx+pathways%2C+not+calcium+load%2C+determine+neuronal+vulnerability+to+calcium+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity.</a> J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).</li>
<li>Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+central+nervous+system+models+of+mechanically+induced+trauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).</li>
<li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Neurochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Practical Neurochemistry.</a> , Churchill Livingstone. London. (1975).</li>
<li>Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha+CaMKII+is+differentially+regulated+in+brain+regions+that+exhibit+differing+sensitivities+to+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3H%5DMK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca%282%2B%29-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li>
<li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li>
<li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurment+of+the+ADP%3AATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability%2C+necrosis+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li>
<li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+tissue+metabolism%3A+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase%2C+and+in+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li>
<li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li>
</ol>

著者は、彼らがこの原稿内で行わ作品のいずれかについて、利害関係のないことを宣言します。

ここで、無傷の成熟した脳組織における興奮毒性及び虚血媒介性細胞死に関与する分子メカニズムを調べるために使用できるmicroslicesの生成のためのインビトロ技術が記載されている。この技術は、生存組織（ 図1-3）、すなわち、より大きな器官型スライス15に代謝的に類似しているが生成される。さらに、このmicrosliceモデルは密接に生体内 10 での興奮毒性媒介脳損傷後に観察される応答に対応。 AMPA、NMDA、またはグルタミン酸で脳microslicesのインビトロでの刺激での 90秒は、生体内 10 での閉塞の90秒周期などの分子（ 例えば CaMKIIの、GluN2B、およびGluA1）、様々で同じ応答を誘導する。これは、本明細書に記載microsliceモデルは、虚血、興奮毒性に関与する分子機構を調査するために使用することができる有効な方法であることをさらに検証を提供ITY媒介細胞死。...

脳卒中の最も一般的な形態は、脳血管が閉塞したときに発生なる虚血性脳卒中である。血流の停止に起因する組織虚血は、膜興奮性神経伝達物質の放出、細胞死経路1の活性化をもたらす細胞内カルシウムの持続的上昇、の広範な脱分極を引き起こす。このプロセスは、「興奮毒性」と呼ばれ、ストローク2など、病態の多様によって産生される神経細胞死に関与する一般的な経路であるされています。興奮毒性および他の神経細胞死カスケードに関与するシグナル伝達経路の阻害は、脳卒中後の神経損傷を制限するための魅力的なアプローチである。 全動物系を使用した場合興奮毒性および虚血性脳卒中に関与する正確な分子機構を同定することは困難であり得る。このような、一次胚および「ニューロン様」（ 例えば neuroblastoとしてミリアン​​ペアおよび腺癌）は、細胞培養システムがしばしば使用される不死化。これらのモデルの主な利点は、比較的費用対効果の高い、それらは操作が容易であることと、細胞死が容易に測定および定量することができる。しかしながら、シグナル伝達経路、培養3,4使用される条件、および未成熟ニューロンによって変更され、行が異なる受容体を発現し、 成熟脳5-8と比較した場合にシグナル伝達分子ができ不死化することができる。 （共培養システムが使用される場合、または2つ）のインタクトな脳組織が互いに相互作用する様々な細胞型を含有する、不均一であるのに対し、さらに、培養されたニューロンは、一つの細胞型の検査を可能にする。器官型スライス培養系（脳組織の薄い外植片）もまた使用され、それらは、インビボで見出されるように、これらのモデルは、細胞の不均一な集団の研究を可能にする。この技術を使用しかし、組織の限られた量のスライスができ、各動物から得ることができる限り不死化細胞株として培養すること、および長期培養する培地は、スライスの経路と受容体のシグナル伝達における変化をもたらすことができるわけではありません。成熟した脳器官スライスを生成するために使用することができる一方で、未成熟脳からのスライスを培養により適しており、より一般的に利用される。ニューロンのシグナル伝達経路を検討することができる使いやすい無傷の成熟した脳を、模倣し又は表現するモデルを開発する必要性がある。 ここでは、興奮毒性または虚血性傷害後の細胞死に関与する分子メカニズムを解明するために使用することができる無傷の神経組織を含むインビトロ技術が記載されている。この技術は、実験を行うために必要な動物の数を減少させる再現性があり、より大きな器官型スライスに代謝的に同様の様式で挙動する生存可能な組織を生成する。さらに、神経回路、細胞間相互作用、およびシナプス後COmpartmentは、部分的にそのまま残ります。使用生理的バッファーは、「再シール」に、細胞膜を可能にし、元の膜抵抗9を回復するために、細胞を可能にします。この脳切片モデルを忠実に媒介される興奮毒性脳損傷10以下の観察された反応を模倣することができ、脳卒中に関与する分子メカニズムを調べるために使用できる。

<table><tbody><tr><td>ギロチン</td><td></td><td></td><td>動物の首を切るために使用される</td></tr><tr><td>手術器具</td><td></td><td></td><td>鉗子、はさみ、ピンセット、<>など、脳の除去と解剖のために</td></tr><tr><td>マキルウェインの</td><td>チョッパー マキルウェインのチョッパーは、Mickle Engineering、Harvard Apparatus、Campden Instruments、Ted Pellaなどのさまざまな企業によって製造/配布されています。</td><td></td><td>100-400 &#181 を生成するために使用されます。m脳セクション。</td></tr><tr><td>丸底プラスチックチューブ</td><td>グライナー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td>ティッシュを37°に保つため;C</td></tr><tr><td>加湿器/曝気装置</td><td></td><td></td><td>加湿された酸素化された環境でマイクロスライスを保持するために使用されます</td></tr><tr><td>平底ポリスチレンチューブ</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce ホモジナイザー</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脳microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

全動物系を使用した場合、虚血性脳卒中のような神経病理学的症状に関与する分子メカニズムを調べることは困難であることができる。このように、第一級または「神経様」細胞培養システムは、一般的に利用される。これらのシステムで動作することが比較的容易であり、（例えば、細胞死のような）種々の機能的転帰を容易に定量化することができる有用なモデル系（例えば、興奮毒性により媒介される細胞死経路のような）培養した未熟ニューロンにおける調べ結果および経路であるが、必然的に成熟した脳において観察されたものと同じ、または無傷組織に含まれていない。したがって、成熟した神経組織における細胞機構を調べることができるモデルを開発する必要がある。我々は、無傷の神経組織における分子経路の様々な調査するために使用することができるインビトロ技術を開発した。本明細書に記載された技術は、ラット皮質組織を利用するが、この技術は、組織を使用するように適合させることができるまたは脳領域（例えば、海馬、線条体など ）（例えば、マウス、ウサギ、モルモット、およびニワトリなど）様々な種から。さらに、刺激/治療の様々な（例えば、興奮毒性、阻害剤の投与等 ） を使用することができる。結論として、本明細書に記載の脳切片モデルは、興奮毒性媒介性脳損傷に関与する分子メカニズムの様々な調べるために使用することができる。

この手順を使用して生成されたMicroslicesは、生存可能であり、種々の種（例えば、ラット、マウス、およびニワトリ）がmicroslicesを生成するために使用することができる。生存率の独立した三つの対策が利用されてきた：呼吸速度（ 図1）、アデニンヌクレオチド比（ 図2）、および組織カリウム含量（ 図3）。これらの対策を使用して、microslices少なくとも2時間後の生成のために生存し続けることが実証されている。 microslicesは、種々の刺激に続いて、種々のシグナル伝達分子を調べるために使用できる脳（ 例えば、KClを脱分極[ 図4]、AMPA、NMDA、グルタミン酸刺激10）と、複数の脳領域間のシグナル伝達分子、細胞の応答を比較するためにも使用することができる（ 図4）。さらに、これらの分子上の様々な阻害剤/薬物治療の効果も調べることができる（例えば、キ...

我々は、興奮毒性媒介性脳損傷に関与する分子メカニズムを調べるために使用できる脳切片モデルを開発した。この技術は、生存可能な成熟した脳組織を生成し、部分的に無傷の神経回路、細胞間相互作用、およびシナプス後区画を維持しながら、実験に必要な動物の数を減少させる。

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

この手順の全体的な目的は、脳のマイクロスライスに細胞毒性刺激を加え、in vitroでの脳卒中モデルを作製することです。まず、新鮮に摘出した脳からマイクロスライスを調製します。次に、緩やかな撹拌を行い、マイクロスライスを平衡化させます。平衡状態に達した後、マイクロスライスはさまざまな実験的操作を行う準備が整います。最終的な結果から、マイクロスライスは作製後少なくとも2時間は生存可能であることが示されました。初代胚 neuronal cultures などの既存の他の手法に対する本手法の主な利点は、成熟した脳組織のスライスを利用することであり、そこには複数の細胞型が含まれているため、無傷の脳組織をより正確に代表している点にあります。最初のステップは、新鮮な脳組織を入手することです。脳を少量の温めたKrebs緩衝液に浸します。残存している皮膚、被毛、または血液を除去するため、温めたKrebs緩衝液で湿らせた2枚のフィルターペーパーを用いてマックルウェインチョッパーを準備します。準備ができたら、脳をチョッパーのステージ上に置きます。脳が滑るのを防ぐため、作業中は温かいCrebs緩衝液で脳とフィルターペーパーを湿らせた状態に保ってください。表面に液体が溜まりすぎないように注意してください。脳を250 µmの冠状断セクションにスライスします。次に、ステージを90度回転させ、250 µmの矢状断スライスを作成します。この手順の後、脳セクションはマイクロスライスと呼ばれます。マイクロスライスを、10〜15 mLの温めたCrebs緩衝液が入った丸底チューブに入れます。個々のマイクロスライスが懸濁するまでチューブを穏やかに撹拌し、その後、重力で沈降させます。懸濁した細胞破片により白濁している上清を慎重に取り除き、チューブに10 mLの新鮮な温めたCrebs緩衝液を加えます。洗浄手順を4回繰り返し、十分に洗浄して大部分の破片を除去します。マイクロスライスを37°Cで緩やかに揺らすか転倒混和させて平衡化させ、計1時間、15分ごとにKrebs緩衝液を交換します。その後、37°Cの新鮮なKrebs緩衝液を2 mL加え、15〜20枚のマイクロスライスを平底のポリスチレン製5 mLチューブに移します。縁が滑らかな幅広のピペットチップを使用し、各マイクロスライスが酸素供給された大気から数ミリメートル以内に収まるよう、チューブの底にマイクロスライスを単層で均一に広げます。適切に配置した後、マイクロスライスに十分な酸素を供給するため、37 °Cのウォーターバスでインキュベートします。最良の結果を得るために、ガスラインを液面直上に配置し、ガスがマイクロスライスに直接接触して物理的に損傷することを避けながら、マイクロスライスの懸濁液にカルボジェンを絶えず通気させます。マイクロスライスの通気を適切に行うことが極めて重要です。ガスラインをマイクロサイト懸濁液の表面から適切な距離に配置することが重要です。複数のラインを統合することで、複数の刺激を同時に行うことが可能です。同時に、さまざまな刺激を用いることができます。この例では、マイクロスライスにAMPA刺激を与えます。マイクロスライスに細胞毒性刺激を与えるか、またはKrebs緩衝液のみで処理してください。刺激群のコントロールとして、刺激後の任意の時点でインキュベーション溶液を除去し、300 µLの氷冷ホモジナイズ緩衝液に置き換えます。刺激後、ガラス製テフロン製ホモジナイザーを用いてマイクロスライスを氷上でホモジナイズし、さらなる解析を行うまで-80 °Cで保存します。呼吸速度の測定結果から、ニワトルの前脳から採取したマイクロスライスは、作製後最大2時間は生存していることが示されています。また、マイクロスライスで検出された高いATPレベルと低いADPレベルも、生存細胞の特徴です。この例では、組織内のカリウム含量を測定したところ、解剖直後は背景値よりわずかに高い程度でしたが、Krebs緩衝液でインキュベートすると上昇しました。さらに、WABEおよびEGTAを添加すると組織内のカリウム含量が低下したことから、マイクロスライスが通常は能動的にカリウムを汲み上げていること、およびそのレベルが死細胞や細胞間隙にトラップされたカリウムによるものではないことが実証されました。ここでは、雄ラットの線条体および感覚皮質からマイクロスライスを作成し、高カリウムKrebs緩衝液を用いて脱分極させました。GluN2Bのリン酸化速度は皮質と線条体で異なっていましたが、GluA1のリン酸化速度は2つの領域間で同様でした。この手法を習得すれば、正しく実施した場合、約2時間で完了させることができます。

excitotoxic-stimulation-brain-microslices-as-an-vitro-model

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典: Zeynalov, E. et al.、脳卒中誘発性脳浮腫を研究するためのマウスにおけるアルギニン-バソプレシン受容体遮断薬コニバプタンの選択治療経路は、持続IV注入です。J. Vis. 経験。 (2016年)このビデオは、マウスモデルにおけるアルギニン-バソプレシン(AVP)受容体拮抗薬の静脈内送達を示しています。一過性の中大脳動脈閉塞は脳浮腫を誘発するAVP...

マウスモデルにおける脳浮腫を軽減するための受容体遮断薬の静脈内送達

Photothrombosisは、再現性の高い方法で、興味のある分野での小よく区切り梗塞を誘発するための迅速、低侵襲技術です。これは、トランスジェニックマウスの脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。...

Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

ここでは、不可逆的な内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)阻害剤(L-Nio)の局所注射によるマウス白質の病巣性脳卒中の生成方法を紹介します。この技術の潜在的な応用を拡大する2つの定位バリエーション、逆行性ニューロントレーシング、および新鮮な組織の標識と解剖が提示されます。...

軸索変性と白質神経生物学の研究のための皮質下白質ストロークの多彩なマウスモデル

ここでは、鼻皮質海馬の組織性スライスの調製について述べています。徐々に制御された血清の剥奪の下で、これらのスライスは進化するてんかんのような出来事を描写し、てんかん発生の元vivoモデルと考えることができる。このシステムは、自発的な活動のダイナミクスを監視するだけでなく、てんかん発生の過程を通じて神経炎症性の進行を評価するための優れたツールを表します。...

リナル皮質-海馬の組織性スライス培養におけるてんかん発生のモデル

ここで説明するフォトトロンボミックストロークモデルは、感光性染料の投与後にレーザー照明を用いて永久的な微小血管閉塞を誘導することによって無傷の頭蓋骨を通してストロークが生成される。...

マウスにおける脳卒中のモデリング:光血栓症による焦点性皮質病変

このプロトコルは、脳筋結合症(虚血性脳組織の髄面に血管側頭筋皮弁を移植する)の方法を提供することを目的としています-非モヤモヤ急性虚血性脳卒中の治療用。血管新生の増加におけるこのアプローチの有効性は、マウスの一過性中大脳動脈閉塞モデルを使用して評価されます。...

マウスにおける中大脳動脈閉塞性脳卒中後の脳筋シナジア症治療モデル

このプロトコルは、皮質虚血性脳卒中後のNeurod1のウイルス媒介性異所性発現を説明しています。Neurod1は、(1)脳卒中後の亜急性期(7日間)に野生型マウスにCre-Flex...

虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル

本プロトコルには、蛍光発泡スチレン微小球を用いた in vivo 二光子顕微鏡イメージングに最適な慢性頭蓋ウィンドウおよび微小血管塞栓症マウスモデルの段階的アプローチを詳細に記述しています。...

蛍光発泡スチレン微小球を用いた 生体内 2光子顕微鏡用微小血管塞栓症マウスモデル

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

証拠が蓄積され、その虚血プレコンディショニング（PC） - 脳の非損傷虚課題は - その後の損傷虚血への過渡保護を与える。我々はC57BL6 /...

局所脳虚血への早期虚血耐性を誘導するために適切な前処理刺激として二国間の総頚動脈閉塞

学ぶ脳マイクロスライスを用いた興奮毒性刺激による脳卒中のインビトロモデル構築法。成熟した脳組織の細胞相互作用を保持しながら、動物使用量を削減して脳損傷の分子メカニズムを研究できます。

脳Microslicesの興奮毒性刺激

さらに動画を探す