検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー
2017年12月15日
ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。
この標的特異的なin vivoイメージング手法の総合的な目的は、炎症性腸疾患における疾患活動性の分子マーカーを可視化することです。本手法は、炎症性腸疾患の分野における重要な疑問への回答や、実験的治療法または特定の細胞事象が炎症に及ぼす影響に関する治療研究に寄与します。この技術の主な利点は、疾患活動性を非侵襲的に、かつ経時的にモニタリングできることです。
この手法は炎症性疾患の知見を得るために有用ですが、がんや免疫関連疾患などの他の疾患の研究にも適用可能です。大腸炎を誘導するために、100 mLのオートクレーブ滅菌した飲用水に2 gのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を溶解し、実験用マウスの飲用水として提供します。なお、1匹あたり1日5 mLの飲水量を想定してください。スキャンを行う24時間前に、目的の抗体カクテルを遮光した滅菌シリンジに充填し、実験動物の尾静脈に静脈内投与します。
実験当日、光の反射と吸収を最小限に抑えるため、電気シェーバーを用いて実験動物の腹部の被毛を剃毛します。厚さと吸収特性が定義された組織模倣ファントムを使用し、目的の抗体溶液を規定量でファントムに充填して、FMT装置で蛍光を測定します。次に、小動物用蛍光分子断層撮影（FMT）装置で「New Study」をクリックし、イメージングパラメータや投与量を含む関連トレーサーをスタディ記述欄に入力します。
実験計画に従って研究グループを作成し、各グループに適切な数の動物を割り当てます。トレーサー構築物のシステム校正が完了したら、麻酔をかけた最初のマウスを仰臥位にして42 °Cの加熱可能な検査カセットに配置します。カセットをイメージングシステムに挿入し、対応する研究グループから適切なサンプルを選択します。
投与したトレーサーを選択してトレーサー濃度の値が正しく算出されるようにし、スキャンの適切な波長で蛍光反射像を取得します。「Acquire Image」をクリックしてスキャン領域を囲み、蛍光反射像上にスキャン領域がオーバーレイとして表示されることを確認します。エラーが発生する箇所や被毛が残っている領域を避けるように注意しながら、関心領域を囲むまでスキャン領域を調整します。
イメージターゲットに応じて、スキャンフィールド内の画像データポイント数を設定するためのスキャンフィールド解像度を選択します。次に、[Scan]をクリックし、選択した波長で画像取得を開始します。スキャンの終了後、動物をカセットから取り出し、ケージに戻す前にモニタリングを行いながら動物を完全に回復させます。
その後、実験的に適切と思われるさまざまな時点でFMTを繰り返します。取得した画像を解析するには、適切な画像解析ソフトウェアを開き、最初のスキャンの生データを選択します。再構成ツールを使用して、蛍光分布の3Dマップを作成します。
すべてのスキャンを適切な再構成データセットに追加したら、目的の最初のデータセットを開きます。選択した個々の実験動物に対して行われたすべてのスキャンが表示されます。適切なスキャンを選択し、[Load]をクリックしてください。
トレーサー分布の3D再構築画像が、最初に取得した蛍光反射画像の上にオーバーレイとして表示されます。次に、再構築された3Dマップ上で非特異的なラベル蓄積の焦点を確認し、測定ツールを使用して関心領域（ROI）を選択します。すると、ソフトウェアが関心領域の蛍光強度を算出し、あわせてスキャン時に校正されたトレーサーのピコモル量測定値を生成します。
本実験では、活性化マクロファージを直接視覚化するために、マウスF4/80に対する蛍光標識抗体を用いた。蛍光介在断層撮影により、非炎症性コントロール動物と比較して、大腸炎モデルマウスの大腸において蛍光トレーサーの蓄積が著しく増加していることが測定された。これは、大腸炎動物において単球の浸潤および活性化マクロファージへの分化が増加していることを示している。対照的に、非特異的な蛍光標識IgG抗体を適用したところ、大腸炎群および非炎症性コントロール群のいずれにおいても、腹部または腸管に検出可能な蛍光反応は認められず、F4/80抗体のプローブと標的との相互作用の特異性が証明された。
摘出した結腸におけるF4/80標的トレーサー蓄積のex vivo測定により、in vivoで検出されたF4/80トレーサー信号の蓄積が結腸由来であることがさらに検証されました。実際に、算出された抗体結合量は組織学的に決定された浸潤マクロファージ数と良好に相関しており、特異的トレーサーを用いたin vivoイメージングが局所の疾患活動性の指標となり得ることが確認されました。適切に実施すれば、習得後は数分以内に操作と解析を完了させることができます。
特異的抗体ベースのトレーサーの作製を含む準備手順には、通常2〜3日かかります。このような実験手順を計画する際は、抗体と動物疾患モデルの両方について、適切で信頼性の高いコントロールを組み込むことが重要です。本手順に続き、大腸内視鏡検査やフローサイトメトリーなどの他の手法を実施することで、さらなる疑問を解消し、データの検証および定量化を行うことができます。
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概要
本研究では、炎症性腸疾患における疾患活動性の分子マーカーを可視化するための、標的特異的なin vivoイメージング手法を提示します。定量的三次元トモグラフィー評価を用いることで、大腸炎マウスモデルにおける腸管へのマクロファージ浸潤に焦点を当てて検討します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 炎症性腸疾患
背景
- 標的特異的プローブは、分子メカニズムを解析するための革新的なツールです。
- これらは、さまざまな疾患におけるタンパク質発現の研究に使用できます。
- この手法により、疾患活性の縦断的かつ非侵襲的なモニタリングが可能になります。
- 炎症性疾患、癌、および免疫関連疾患に適用可能です。
研究の目的
- 炎症性腸疾患における疾患活動性の分子マーカーを可視化する。
- 炎症に関連する治療研究における重要な課題に取り組む。
- 炎症に対する実験的治療の影響を評価する。
使用した手法
- デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を用いた大腸炎の誘導。
- 実験マウスへの抗体カクテルの静脈内投与。
- マクロファージ浸潤を可視化するための蛍光媒介トモグラフィーによるイメージング。
- in vivoにおける疾患活性の縦断的モニタリング。
主な結果
- 腸管マクロファージ浸潤の可視化に成功した。
- 疾患活動性を非侵襲的にモニタリングできることを実証した。
- 大腸炎における炎症のダイナミクスに関する知見を得た。
- 他の疾患の研究への応用の可能性が示された。
結論
- 標的特異的なイメージングアプローチは、炎症性腸疾患の研究に有効である。
- この手法により、疾患のメカニズムや治療効果への理解を深めることができる。
- 今後の研究により、他の炎症性疾患や免疫関連疾患への応用展開が期待される。
よくある質問
産業界における重要性
マクロファージ浸潤の非侵襲的な縦断的イメージングにより、前臨床モデルにおける炎症反応の早期検出が可能となり、終点解析への依存を減らし、抗炎症療法のメカニズム的なリスク低減を支援します。定量的な3D蛍光媒介トモグラフィーは、ターゲットへの結合や疾患修飾効果に対する予測的な信頼性を提供し、IBD（炎症性腸疾患）および免疫介在性疾患プログラムにおけるgo/no-go決定に寄与します。このアプローチは、in vivoイメージングの読み取り結果と組織病理学的検証を一致させることでトランスレーショナルな連続性を高め、創薬パイプラインにおけるポートフォリオの選別とリソース配分を改善します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：腸管炎症の機能的アウトカムとしてF4/80陽性マクロファージの集積を可視化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：非特異的IgGコントロールでシグナルが出ないことを示すことで、特異的なプローブ・ターゲット相互作用による生物学的リスク低減を裏付ける。
- 予測的価値：in vivoでのトレーサー集積を、ex vivoでの抗体結合および組織学的なマクロファージ数と相関させることで、免疫調節剤スクリーニングにおけるターゲットへの信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 標準化された定量的な3D蛍光マップとピコモル濃度のトレーサー測定値を生成し、潰瘍性大腸炎モデルにおける再現性のある化合物スクリーニングを可能にします。
- 拡張性： 複数の時点にわたる縦断的モニタリングを容易にし、動物使用数を削減するとともに、治療有効性研究における統計的検出力を向上させます。
- プラットフォームの再利用： 大腸内視鏡検査やフローサイトメトリーによるダウンストリーム検証との互換性があり、ターゲット検証およびバイオマーカー整合のための統合的なワークフローをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：IBD（炎症性腸疾患）の病態生理および治療反応性の研究に広く用いられている、DSS誘発コロライト（大腸炎）により腸管炎症をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：非侵襲的イメージングと組織学的エンドポイントを連携させることで、in vivoおよびex vivoの整合性のあるデータに基づいた、リスク調整後の開発推進の決定を可能にします。
- メカニズムによるリスク低減：単球の浸潤およびマクロファージの分化ダイナミクスを追跡し、試験的治療薬の細胞レベルでの作用機序に関する知見を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
蛍光介在トモグラフィーは、標的の検証からリード化合物の同定、そして前臨床段階での有効性試験に至る発見の連続的なプロセスに組み込まれており、特に胃腸管炎症における免疫調節化合物において有用です。
- ディスカバリーバイオロジー：大腸炎モデルにおけるパスウェイ変調の薬力学的リードアウトとしてマクロファージ浸潤を定量化し、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：処理群間およびタイムポイント間での比較を可能にする、アッセイ適用の定量出力（蛍光強度、トレーサー濃度）を提供します。
- アナリティクス：再構成可能な3Dデータセットおよび関心領域（ROI）の測定値を提供し、免疫細胞の局在に対する治療効果の統計的解析を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vivoイメージングをex vivoでの検証に結びつけ、IBD標的候補物質のバイオマーカー整合性と前臨床段階の連続性を強化します。
- エンタープライズ再利用：腸管炎症以外でも、免疫細胞トラッキング、幹細胞研究、腫瘍学モデルに適用可能な、再利用可能なイメージング能力を提示します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：マクロファージ活性の特異的かつ定量的なイメージングにより、メカニズム的な曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：校正されたトレーサー定量化と個体内での縦断的追跡により、再現性と標準化を高めます。
- 戦略的価値：非侵襲的な疾患活性モニタリングに基づいた早期のgo/no-go判断を可能にし、後期の生物学的リスクを低減させることで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：イメージングデータと組織学的データの整合性を通じて、リスク調整後の優先順位付けを支援し、免疫調節薬パイプラインにおける推進基準を精緻化します。
実施上の検討事項
- 蛍光イメージング、トレーサー調製、および静脈注射や麻酔プロトコルのための小動物ハンドリングに関する専門知識が必要です。
- 適切な波長選択と再構成ソフトウェアを備えた、小動物用蛍光分子断層撮影システムの利用が不可欠です。
- 一貫したデータ解釈のためには、イメージングプロトコル、トレーサー投与量、および関心領域（ROI）分析について、チーム間での標準化が必要です。
- 信号干渉を最小限に抑えるため、除毛や腹部イメージングの最適化など、モデルシステムに応じた適応上の検討が含まれます。
- トレーサー調製に2～3日を要することや、特異性を確保するために適切なアイソタイプコントロールおよび疾患コントロールが必要であるといった、実用上の制限があります。
