検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー
December 15th, 2017
ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。
この標的特異的なin vivoイメージングアプローチの全体的な目標は、炎症性腸疾患における疾患活動の分子マーカーを可視化することです。この方法は、炎症性腸疾患の分野における重要な疑問や、実験的治療薬や特定の細胞イベントが炎症に及ぼす影響に関する関連する治療研究に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、疾患の活動性を縦断的かつ非侵襲的に監視できることです。
この方法は炎症性疾患への洞察を提供することができますが、癌や免疫関連疾患などの他の疾患の研究にも適用できます。大腸炎を誘発するには、実験マウスの飲用供給量を 2 グラムのデキストラン硫酸ナトリウム (DSS) で満たし、100 ミリリットルのオートクレーブ滅菌飲料水に溶解し、マウス 1 匹あたり 1 日あたり 5 ミリリットルの水と推定します。スキャンの24時間前に、目的の抗体カクテルを光から保護された滅菌シリンジにロードし、抗体を実験動物の尾静脈に静脈内注射します。
実験当日は、電気カミソリを使用して実験動物の腹部の毛皮を剃り、光の反射と吸収を最小限に抑えます。定義された厚さと吸収特性を持つ組織模倣ファントムを使用して、目的の抗体溶液の特定の容量をファントムに充填し、FMTデバイスで蛍光を測定します。次に、獣医用蛍光媒介断層撮影装置、または小動物用の FMT デバイスで、「新規研究」をクリックし、イメージングパラメータや線量など、関連するトレーサーを研究の説明に含めます。
実験計画に従って研究グループを作成し、各グループに適切な数の動物を装備します。システムがトレーサーコンストラクト用に較正されたら、最初に麻酔をかけたマウスを仰臥位にして、摂氏42度の加熱可能な検査カセットに入れます。カセットをイメージングシステムに挿入し、対応する研究グループから適切なサンプルを選択します。
トレーサー濃度の値が適切に計算されていることを確認するために、投与されたトレーサーを選択し、スキャンに適した波長で蛍光反射率画像を取得します。[画像を取得] をクリックしてスキャンフィールドの概要を説明し、スキャンフィールドが蛍光反射画像にオーバーレイとして表示されることを確認します。スキャンフィールドが関心領域を囲むまで調整し、エラーや残りの毛皮の領域を避けるように注意してください。
画像ターゲットに応じて、スキャンフィールドの解像度を選択して、スキャンフィールド内の画像データポイントの数を設定します。次に、[スキャン]をクリックして、選択した波長で画像取得を開始します。スキャンの最後に、動物をカセットから取り出して、ケージに戻る前に動物が監視して完全に回復できるようにします。
その後、FMTは、実験的に適切な場合に、さまざまな時点で繰り返すことができます。取得した画像を分析するには、適切なイメージング解析ソフトウェアを開き、最初のスキャンの生データを選択します。再構成ツールを使用して、蛍光分布の3Dマップを作成します。
すべてのスキャンが適切な再構成データセットに追加されたら、目的の最初のデータセットを開きます。選択した個々の実験動物に対して実行されたすべてのスキャンが表示されます。適切なスキャンを選択し、[ロード]をクリックします。
トレーサー分布の3D再構成は、最初に取得した蛍光反射率画像のオーバーレイとして表示されます。次に、再構築された3Dマップ上で非特異的なラベル蓄積の焦点を特定し、測定ツールを使用して関心領域を選択します。その後、ソフトウェアは、対象領域の蛍光強度と、スキャンがキャリブレーションされたトレーサーのピコモル量測定値を生成します。
この実験では、マウスF4/80に対する蛍光標識抗体を用いて、活性化されたマクロファージを直接可視化しました。非大腸炎性対照動物と比較して、大腸マウスの結腸における蛍光媒介断層撮影法により、蛍光トレーサーの有意な蓄積が測定され、大腸炎動物における単球浸潤および活性マクロファージへの分化の増加が示された。逆に、非特異的蛍光標識IgG抗体の適用では、大腸炎または非大腸炎の対照群のいずれにおいても、腹部または腸で検出可能な蛍光応答は認められず、F4/80抗体のプローブ-標的相互作用の特異性が実証されました。
Ex vivo 測定により、外植結腸における F4/80 指向性トレーサー蓄積が得られたことから、in vivo で検出された F4/80 トレーサーシグナル蓄積の結腸起源がさらに検証されました。実際、結合抗体の計算量は、組織学的に決定された浸潤マクロファージの数とよく相関しており、特定のトレーサーによるin vivoイメージングが局所的な疾患活動性を示す可能性があることが確認されています。一度マスターすると、適切に実行されれば、数分以内に実行および分析できます。
特定の抗体ベースのトレーサーの作製を含む調製ステップには、通常2〜3日かかります。このような実験手順を計画する際には、抗体と動物疾患モデルの両方について、適切で信頼性の高いコントロールを含めることが重要です。この手順に続いて、大腸内視鏡検査やフローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、追加の質問に答え、データを検証および定量化することができます。
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概要
この研究は、炎症性腸疾患における疾患活動性の分子マーカーを可視化する標的特異的in vivoイメージングアプローチを提示します。定量的3次元断層撮影評価を活用し、研究は結腸炎のマウスモデルにおける腸マクロファージ浸潤に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫学
- 炎症性腸疾患
背景
- 標的特異的プローブは分子メカニズムを分析するための革新的なツールです。
- 様々な疾患におけるタンパク質発現の研究に使用できます。
- この方法により、疾患活動性の経時的および非侵襲的モニタリングが可能になります。
- 炎症性疾患、がん、免疫関連疾患に適用できます。
研究目的
- 炎症性腸疾患における疾患活動性の分子マーカーを可視化する。
- 炎症に関連する治療研究の重要な疑問に答える。
- 実験的治療薬が炎症に与える影響を評価する。
使用方法
- デキストランスルファートナトリウム（DSS）を用いた結腸炎の誘発。
- 実験用マウスへの抗体カクテルの静脈内投与。
- マクロファージ浸潤のイメージングのための蛍光媒介トモグラフィー。
- in vivoでの疾患活動性の経時的モニタリング。
主要な結果
- 腸マクロファージ浸潤の成功的な可視化。
- 疾患活動性の非侵襲的モニタリング能力の実証。
- 結腸炎における炎症のダイナミクスへの洞察の提供。
- 他の疾患の研究への潜在的応用が特定されました。
結論
- 標的特異的イメージングアプローチは炎症性腸疾患の研究に効果的です。
- この方法は疾患メカニズムと治療効果の理解を深めることができます。
- 将来の研究で、他の炎症性および免疫関連疾患への応用を拡大することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
