Name: 検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぶ蛍光トモグラフィーによるマウス腸管マクロファージ浸潤の可視化法。DSS誘導大腸炎モデルで疾患活動性を非侵襲的に定量的に評価し、炎症性腸疾患の治療研究に応用する。

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優れたテクニカル サポート、さんソニア Dufentester、さんエルケ ・ ウェーバーと夫人クローディア Niepagenkämper に感謝します。

すべての動物実験は、Landesamt für Natur、ドイツ動物保護法 (Tierschutzgesetz) によると環 und Verbraucherschutz (LANUV) ノルトライン ・ ヴェストファーレン州によって承認されました。
1. 材料と実験のセットアップ
<ol>
	<li>動物の世話。
	<ol>
		<li>20-25 g の体重で (例えばC57BL/6) に任意の DSS 感受性系統の性別と年齢をマッチさせたマウスを使用します。</li>
		<li>ローカル動物のケアのガイドラインに従ってマウス実験群とハウスあたり少なくとも 5 つ以上のマウスを計画します。</li>
		<li>ダイエットとオートクレーブ飲料水広告自由標準的な齧歯動物の食事を提供します。</li>
		<li>標準的な食事を削除し、腔内自動蛍光を減らすためにスキャンする前に、少なくとも 3 日間無料のアルファルファの食事でそれを置き換えます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>急性 DSS 誘発大腸炎の誘導。
	<ol>
		<li>DSS の 2 g を溶解 (分子量 40,000 〜 ダ) 2% (w/v ソリューション) を取得するオートクレーブ飲料水 100 ml。</li>
		<li>DSS ソリューション専用のマウスの酒の電源を記入し、推定 5 mL 1 日あたりマウスごとの液体の。コントロール マウス10DSS せず同じ飲料水を提供します。 注: は、実験の終わりまで毎日マウスを監視します。初期体重の 20% 以上を失うことまたはそれが瀕死になるマウスを安楽死させる (すなわち、永続的に減少の動き、姿勢を猫背、コートを建てる不自然な呼吸法、著しく) 動物に該当するローカルのガイドラインによると福祉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛍光を介した断層レントゲン写真撮影の準備。
	<ol>
		<li>目的とする抗体 (例えばラット抗マウス F4/80) 蛍光色素をラベル (例えばCyanine7、λ励起: 750 nm、λ放出: 776 nm) 製造元のプロトコルで説明したよう。適切な透析膜で浄化された抗体の dialyze (細孔サイズ &#60; 50 100 kDa) 少なくとも 2 時間または一晩の 0.15 M 塩化ナトリウムの 1 L に対して。<ol>
			<li>0.1 M NaHCO3の 1 L に抗体を転送し、少なくとも 2 時間の dialyze。</li>
			<li>ジメチルスルホキシド (DMSO) で蛍光染料の必要な量を解散 (抗体の 10.8 mg μ L/) 抗体溶液を加えると。20 モル過剰色素とタンパク質比は 1:3 を達成するために蛍光染料を使用します。</li>
			<li>1 h. 無標号の抗体を削除は、0.15 M ナトリウムの 1 L に対して透析か PD 10 脱塩カラムを使用して、4 ° C で暗闇の中でインキュベートし、生体内でアプリケーションのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で解決します。</li>
			<li>吸光光度法による最終的な抗体濃度とラベリングの比率を決定します。</li>
			<li>250 330 nm の吸収でタンパク質濃度を測定し、染料による追加吸収を検討します。280 に極大吸収を修正 750 で最大の吸収の 11% (タンパク質) nm nm (次の手順) Cyanine7 の分類のため。</li>
			<li>測定 250 800 nm (通常 1:10) 化合物の希釈と 750 Cyanine7 の濃度を抽出 nm。</li>
			<li>として色素とタンパク質比を決定する: 染料/抗体 = 750 で最大吸収 nm/200,000/(280 最大吸収 nm - 750 で最大吸収 x 0.11 nm)/170,000。</li>
			<li>4 ° C で抗体溶液を保持し、注入前に漂白を避けるために光からシールドします。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>それが使用されるまで注入と光からの盾の直前に滅菌注射器に必要な抗体の解決の容積を読み込みます。</li>
		<li>プローブ注入の最適なタイミングとトレーサー動態に応じて、スキャンの手順を決定します。</li>
		<li>酸素吸入 1.5 2.5% イソフルランを用いたマウスを麻酔安全標識抗体の尾静脈注射用専用落を置くか。</li>
		<li>フルレングスの抗体、標識抗体、少なくとも 24 h、スキャンする前にマウス大腸炎における抗マウス F4/80 マクロファージ可視化などを注入します。マウスを静脈注射 (静注) 尾経由で 2.0 nmol の色素に対応する額の標識抗体を静脈。</li>
		<li>使用同様に標識非特異的抗体 (例えば、ラット IgG または一次抗体遺産に対応する別のアイソタイプ) 線量のアイソタイプ コントロールとして特定のプローブと同等。 注:生体内での結果をスキャン制御化合物の注入を画像データ特定のプローブの解釈のための参考資料として提供することができます後。</li>
		<li>光の反射・吸収を最小限に抑えるため腹部の動物の毛皮を剃る電気かみそりを使用します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 技術的な装置
<ol>
	<li>小動物蛍光 (図 4) の獣医蛍光を介したトモグラフィ (FMT) デバイスを使用します。</li>
	<li>「新研究」をクリックしてしてプロジェクトごとに新しい研究を作成ボタンをクリックし、、撮像パラメーターおよび将来の参考のための線量を含む関連するトレーサー研究説明に含めます。</li>
	<li>この研究の中で「新しい研究グループ」をクリックするとそれぞれの研究デザイン (例えば、特定のトレースと非特異的アイソタイプ コントロール) によると研究グループを作成するボタン。動物のそれぞれの番号を持つ各研究グループを装備します。</li>
	<li>トレーサーの構成要素のシステムを調整します。<ol>
		<li>ラベルのバリエーションの正規化し、大井データから定量的測定を有効にするのにトレーサーの各バッチのキャリブレーションを実行します。</li>
		<li>個々 のシステムの校正用測定器メーカーのガイダンスに従ってください。「新しいトレーサーを追加」を選択する、システムは手順のガイドを提供します。応用抗体溶液の希釈と計算される絶対プローブのトレーサー濃度を提供します。</li>
		<li>FMT、(重要な組織に似ている)、定義済みの厚さと吸収特性の組織模倣ファントムを使用し、使用される抗体の溶液の体積でそれを埋めます。FMT のデバイスでこれを測定します。 注: 将来体内測定から絶対トレーサー濃度を計算するのに指定されたプローブは、一緒に指定された濃度の基準値の測定は、システムが使用されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>スリーブ検査カセットを使用し温度 42 ° C 注: これは、検査中に低体温になるからマウスを防ぎます。</li>
</ol>
3. 動物の麻酔
<ol>
	<li>1.5-2% vol % イソフルラン ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) マウスを麻酔する 1.5 L O2最低の連続的な流れを使用してください。</li></ol>簡単に麻酔の深さをコントロールし、スタッフの露出を最小限に抑えるため齧歯動物麻酔 (イソフルラン気化器) の特別に設計された吸入システムを使用します。
	<li>防漏誘導チャンバーにマウスを置き、イソフルラン供給 (100% (v/v)、酸素 3 L/分で 5 vol %) 用気化器入れます。リカンベントと無意識になるまで、マウスを監視します。</li>
	<li>100 %v/v、1.5 の vol %、検査中に動きの人工物を最小限に抑えるために 1.5 L/分の酸素投与のノーズコーンを介して連続イソフルラン吸入とトモグラフィーの検討カセットに配置します。5 分よりも長く持続する手順、角膜の損傷を防ぐためマウスの目に眼軟膏を適用します。</li>
	<li>反射神経をチェックすることによって麻酔の深さを評価します。その背面にマウスを置く麻酔で十分な場合、マウスがにしないでください。その足の指の間そっとマウスをピンチします。麻酔は十分ですが、脚は撤退 (外科的許容範囲のステージ) をできません。</li>

4. 蛍光を介した断層レントゲン写真撮影スキャン
注: 適応、この FMT システムに固有の次の詳細については、必要に応じて、代替蛍光反射イメージング デバイスまたは FMT システムの研究 (材料の表を参照してください)。
<ol>
	<li>検査カセットにその背中に麻酔下のマウスを置きます。</li>
	<li>スキャンの手順を実行します。<ol>
		<li>イメージング システムにカセットを挿入し、連続的な麻酔を確実にすぐにそれを閉じます。以前作成した研究グループから適切なサンプルを選択します。トレーサー濃度の値は正しく計算するドロップ ダウン メニューから管理されるトレーサーを選択します。</li>
		<li>適切な波長の蛍光反射率画像を取得 (720 nm Cyanine7) スキャン計画・概要」イメージの取得」ボタンをクリックしてスキャン フィールド。</li>
		<li>スキャン フィールド蛍光反射イメージ上のオーバーレイとして表示されますを参照してください。(例えば、コロンまたは腹部)、関心の領域に調整空気または残りの毛皮の領域を回避します。イメージ ターゲットに応じて画像数データ ポイント スキャン フィールド内から選択して設定粗い右側のメニューの中、細かいスキャン フィールドの解像度に。 注意: は、細かいスキャン フィールド可能性があります大幅に長くスキャン時間を犠牲にしてより良い空間分解能を提供することに注意します。</li>
		<li>「スキャン」をクリックして選択した波長のデータ/画像の取得を開始します。 注: 腹部全体の中細スキャンのスキャン時間; 約 5 分になります今回は、各データ ポイントは個別に励起レーザーに照らされたされ生じる蛍光性が記録されます。</li>
		<li>スキャンの終わりにイメージングのカセットから動物を削除し、ケージに戻ってそれを置く前に完全回復する動物を許可します。</li>
		<li>実験中にさまざまな時点で必要と認められる場合は FMT を繰り返します (0、5、および 9-10 日間など(試験終了))、しかし、バック グラウンド蛍光信号を増加させる体内の抗体の蓄積を考慮します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. スキャン後
<ol>
	<li>個室ケージ赤光地球温暖化ランプの下でペーパー タオルの上にマウスを置きし、完全復旧までの不快感や苦痛の兆候をマウスを監視します。いつ完全に目を覚まし、それぞれのケージに戻るには、マウスを置きます。</li>
	<li>100% (v/v) の用量でアイソレータへの CO2の配信実験の終わりにマウス、100 vol % と 3 L/分を安楽死させます。高濃度 CO2の突然の暴露は、苦痛を引き起こす可能性がありますと、CO2で商工会議所をあらかじめ記入しないでください。マウスが急激な頚部転位などの安楽死のそれに続くセカンダリ モードによる呼吸を停止した後は、死を確認します。</li>
	<li>腹部の開腹手術で大腸を外植体し、手順に従って 4.2.1 - 4.2.4 explanted コロンの前のヴィヴォスキャンを実行します。縦 Metzenbaum 外科はさみを使用して各コロンを開き、さらに分析のためにそれを準備する前に生理食塩液を徹底的にすすいでください。</li>
	<li>メスを使用すると、遠位結腸から 0.5 cm の断片を切り取り、すぐに 1.5 mL クライオ チューブで。凍結液体窒素で-70 ° c 店さらに使用 (例えばミエロペルオキシダーゼ (MPO) 測定) まで。</li>
	<li>木の棒を使用し、組織学的解析の粘膜の外側 (「スイスロール技法」) との近位端に遠位から残り縦に開かれているコロンをロールアップします。定着剤で準備を配置 (材料の表を参照してください)、-80 ° C14で凍結します。</li>
</ol>
6. データ再構築と解釈
<ol>
	<li>それぞれは、イメージング ソフトウェアの再構成ツールを使用して、raw 画像データから蛍光分布の 3次元マップを作成スキャンはスキャンしたときに、自動的に再構築ツールに追加する関数"キューに追加復興"が選択されます。<ol>
		<li>それ以外の場合、それぞれの研究の下のドロップ ダウン メニューからスキャンを選択し研究グループ、スキャンを右クリックし、「復興に追加」を選択</li>
	</ol>
	</li>
	<li>詳細な分析、解析ソフトウェアにデータ セットを読み込みます。上部バーのドロップ ダウン メニューからそれぞれの研究を選択し、右側のメニューから [研究グループと個々 の動物この動物のため実行するスキャンのすべてが表示されます。正しいスキャンを選択し、「読み込み」をクリックしてください 注: トレーサー分布の三次元左側の当初取得蛍光反射率画像のオーバーレイとして表示されます。モデルを回転の分析を容易に拡大することができます。</li>
	<li>非特異的ラベル蓄積 (例えば肝臓や尿膀胱) 再建された 3 D マップ上の病巣を特定し、ターゲット組織 (例えば腸や腸) から区別するため。</li>
	<li>一番上のバーからターゲットの最も適切な ROI 形状を選択します。解析ソフトウェアのそれぞれの測定ツールを配置することによって利益 (率 ROI) の領域としてラベル対象組織ソフトウェアがモルのスキャンが済んでトレーサー量、投資収益率と同様、(ピコ) の蛍光強度を提供します。</li>
	<li>(組織) の炎症性の浸潤との相関関係の疾患活動性の評価のために最も適した相当として ROI サイズに正規化された、適切な投資収益率でトレーサーの合計量を選択します。 注: 特定のモデルの代表として適切な場合は、投資収益率の他の機能を選択できます。</li>
</ol>
7。Ex Vivo解析
<ol>
	<li>ヘマトキシリンとエオシン染色と蛍光抗体法。
	<ol>
		<li>70% のエタノール (エタノール); 2 分でそれらを配置することによって、セクションを deparaffinize します。その後水ですすいでください。5 分のヘマトキシリン液で染色し、その後 10 分間ぬるま湯ですすいでください。</li>
		<li>エオシン溶液 2 分間で対比染色、蒸留水ですすぎ、もう一度蒸留水ですすぎ。</li>
		<li>場所 70 %etoh、96 %etoh、99% エタノール、およびキシレン (2 回) が脱水し、セクションをクリア各 2 分の。メディアを樹脂製マウントをマウントします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛍光抗体法。
	<ol>
		<li>螢光抗体の汚損のため以前に取得した組織切片 (「スイスロール」) を使用し、7 μ m の低温カット セクションを準備します。</li>
		<li>10 分 5.0% ラット血清中のアセトン固定と冷凍コロン セクションをブロックし、希薄 (1/500 v/v) ビオチン化初代ラット抗マウス F4/80 抗体一晩インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で三度のセクションを洗浄し、PBS/BSA のストレプトアビジン FITC (1: 100 v/v) と孵化 (0.1 %w/v) 4 ° C でオーバー ナイト</li>
		<li>TBS の各セクションを洗って 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、1: 1000 v/v) コントラストを達成するために染まります。共焦点顕微鏡蛍光画像を分析 (フィルター キューブ N2.1 励起フィルター 515 560; 40 倍の倍率表の材料を参照) と高出力フィールドごと F4/80-陽性細胞をカウントします。 注: は、生体内でFMT と事後組織解析免疫組織染色や蛍光染色、意図されていたターゲットによってなどを結合するときに同じクローンとフォーマットの抗体を使用してください。F4/80 陽性マクロファージ体内と体外の検出、さまざまな形式が使用されました。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MPO コロン サンプルの測定。
	<ol>
		<li>新鮮な取得、PBS 洗浄コロン サンプルや MPO 測定のため解凍試験片に使用します。すべてのサンプルの重量を量るし、組織を均質化、ELISA、換散バッファーのキット (材料の表を参照してください) 組織の mg 当たり換散バッファーの 20 μ L のボリュームで。</li>
		<li>15 超音波 s (超音波周波数: 20 kHz、電力: 70 W) 200 x g と 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心力と</li>
		<li>市販 ELISA キット (材料の表を参照) の使用のメーカー説明によると。重複のテストを実行します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

医療イメージング技術は、近年急速に進化してきたが我々 はまだ開発のごく初期の段階で炎症性プロセスまたは他の病気と同様、腫瘍を検出する当社の能力に制限されます。ただし、これは理解腫瘍の成長、侵略、または転移開発および炎症性疾患と変性、心血管及び免疫疾患の開発の細胞プロセスに重要です。伝統的なイメージング技術は、身体的または生理学的なパラメーターに依存して中、分子イメージングは、体内の特定の分子マーカー20の可視化を実現。 にします。
小動物イメージング用蛍光を介したイメージング、超音波、核駆動型のアプローチ (例えば、sイングル光子放射型断層撮影 (SPECT)、陽電子放出断層撮影 (PET)) を特定を視覚化する使用ことができます。分子標的の構造。最も利用可能なトレーサーのバックボーンとしてフルレングス抗体の使用には、長期的なラベル、長い循環回と遅い組織浸透遅延トレーサー アプリケーション後のイメージングの時間が必要です。したがって、典型的なイメージング放射性核種は、生体内イメージ...

動物モデルは、科学的な研究で広く使用されて、多くの非侵襲的な手順が存在するモニターの疾患活動性と活力を体重の増減の定量化や血液、尿、糞便の分析など。ただし、これらは個体間変動予告も間接代理パラメーターのみです。彼らはよく反復的な時点でシリアルの観察を防ぐ組織標本の事後分析によって補完する必要があります、生理や病理組織学的観察を処理で体内を直接します。断面イメージング、光学イメージング、および内視鏡検査は、これらのプロセスの直接可視化を実現し、同じ動物1の反復的な解析ができますクロスを含む高度な小動物イメージング技術が浮上しています。,2,3。 さらに、繰り返し同じ動物の疾患のさまざまな状態を監視する可能性、必要な動物の倫理の観点から望ましいと考えられる動物の数を減らします。
生体内蛍光イメージングのためにいくつか別の光イメージング技術が存在します。もともと、共焦点レーザー顕微鏡を用いて地表および地下の蛍光イベント4,5を研究します。最近では、ただし、三次元組織の定量的評価を可能にする断層システム先進6をされています。これが単色光源7検波器、低吸収を提供する近赤外線 (NIR) スペクトルで発光する蛍光プローブの開発によって達成されました。伝統的な断面解析イメージングしながらコンピューター断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)、超音波 (米国)、ほとんど物理的なパラメーターに依存して、形態を視覚化するなど光イメージングすることができます追加情報を提供します。基になる分子プロセスに内因性あるいは外因性蛍光プローブ8をの。
分子生物学の進歩は、ターゲットの増加する数のスマートかつターゲットを絞った蛍光分子プローブの生成を促進に貢献しています。たとえば、受容体を介した取り込みと特定のターゲット領域における分布視覚化できます carbocyanine 誘導体標識抗体9を使用しています。体のそうでなければアクセスできない領域に特定のトレーサーとして機能するラベル付けできますが、利用可能な抗体の豊富な腫瘍と神経変性のモデル分子・細胞のプロセスに前例のない洞察を提供します。心血管系、免疫学的、および炎症性疾患7。
本研究では大腸炎のマウスモデルにおける蛍光を介したトモグラフィの使用をについて説明します。デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導大腸炎、炎症性腸疾患 (IBD)10のような腸の炎症の標準化学物質誘発マウス モデル。腸炎症11の開発に生来の免疫システムの貢献を評価するために特に便利です。採用、アクティブ化、および単球やマクロファージの浸潤は、IBD の病因の重要なステップを表す、採用の可視化や浸潤の動態が、たとえばの効果をモニターします。12の臨床設定で、潜在的な治療剤。我々 は DSS 大腸炎の誘導をについて説明し、単球/マクロファージ マーカー F4/80 の具体的な可視化の蛍光分子トモグラフィーを用いた消化管粘膜へのマクロファージ浸潤の断層撮影による評価を示します13さらに、抗体はラベリング; などの補助および補足的な手順を示す。実験のセットアップ;疾患活動指標など従来の読み出しとの相関関係で、得られた画像の分析と解釈流れ cytometry と組織学的解析および免疫組織化学。我々 は、この手法との比較その他の画像診断装置の制限をについて説明します。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alfalfa-free diet</td><td>Harlan Laboritories, Madison, USA</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Leverkusen, Germany</td><td>80469764</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulphate sodium (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ - アルドリッチ、ダイゼンホーフェン、ドイツ</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100V/V</td><td>Abbott、ヴィースバーデン、ドイツ</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ - アルドリッチ、ダイゼンホーフェン、ドイツ</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek コンパウンド&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Netherlands</td><td>4583</td><td>組織学的分析用固定剤</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate powder</td><td>Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Standard diet</td><td>Altromin, Lage, Germany</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Netherlands</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Hemoccult (guaiac paper test)</td><td>Beckmann Coulter, Germany</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody</td><td>Serotec, Oxford, UK</td><td>MCA497B</td><td></td></tr><tr><td>Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1&nbsp;</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg Germany</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa546</td><td>Molecular Probes, Darmstadt, Germany</td><td>S-11225</td><td>励起/発光最大:&nbsp; 556/573nm</td></tr><tr><td>抗CD11b ラット抗マウス抗体 TC</td><td>Calteg, Burlingame, USA</td><td>R2b06</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse F4/80 antibody</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>123102</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Germany</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Germany</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Cy7 NHS Ester</td><td>GE Healthcare&nbsp;Europe, Freiburg, Germany</td><td>PA17104</td><td></td></tr><tr><td>MPO ELISA</td><td>Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany</td><td>K 6631B</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5 標識抗マウスF4/80抗体</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>123127</td><td>すぐに使用できる標識抗体 (代替)</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience, Waltham, USA</td><td>45-4801-80</td><td>すぐに使用できる標識抗体 (代替)</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline Solution (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>SRE0032</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FMT 2000 In Vivo イメージングシステム</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>True Quant 3.1 イメージング解析ソフトウェア</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMLB Fluorescent Microscope</td><td>Leica,&nbsp; 35578 Wetzlar, Germany&nbsp;</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Bandelin Sonopuls HD 2070</td><td>Bandelin, 12207 Berlin, Germany</td><td>HD 2070</td><td>超音波ホモジナイザー</td></tr><tr><td>使い捨てメス No 10</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z692395-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum はさみ 14cm</td><td>Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany</td><td>22398330</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ 5ml</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen,ドイツ</td><td>Z248010</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ針</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z192368&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgium</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

病気のマウスモデルが科学的な研究に不可欠であります。しかし、内視鏡や断層イメージングなど多くの診断ツールは、動物モデルで日常的には採用されません。従来実験的読み出しは、しばしば事後と前のヴィヴォ分析、個人内のフォロー アップ検査を防止し、必要な研究の動物の数を増やすに依存します。蛍光を介したトモグラフィーできます蛍光プローブの非侵襲的、反復的、定量的な三次元評価です。非常に敏感であり、特異的検出と異なる分子標的の特性評価を可能にする分子のメーカーの使用を許可します。特に、ターゲット プローブは、炎症、自己免疫疾患、感染症、血管疾患、細胞遊走、腫瘍などで遺伝子の活性化および蛋白質の表現の分析のための革新的なツールを表します。この記事で私たちは体内検出と (すなわちF4/80 陽性マクロファージ浸潤) の広く使用されているマウス モデルにおける炎症の評価のこの高度なイメージング技術のステップバイ ステップの手順を提供します。腸の炎症。この手法は免疫細胞と幹細胞の追跡など、他の研究分野でもされる可能性があります。

大腸炎の評価:
DSS 誘発大腸炎は人間の IBD に似ており、減量、直腸出血、表面的な潰瘍、感受性のあるマウス15粘膜損傷につながる腸管炎症の化学物質誘発マウス モデルです。特に自然免疫炎症性腸10,11の開発の貢献の研究に有用です。合併の炎症を誘発する強力にマウスが継続的に実験を通じて DSS を投与します。体重の減少・便潜血は、炎症の臨床指標として使用されました。図 1 aのように、マウスは、水だけを受信制御動物は、体重の大幅な変更を示さなかったに対し、大腸炎、導入後 4 日目から始まる重量を失うことを始めた。さらに、次潜血スコアリング システムを用いて評価した合併動物 (<strong c...

ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

この標的特異的なin vivoイメージング手法の総合的な目的は、炎症性腸疾患における疾患活動性の分子マーカーを可視化することです。本手法は、炎症性腸疾患の分野における重要な疑問への回答や、実験的治療法または特定の細胞事象が炎症に及ぼす影響に関する治療研究に寄与します。この技術の主な利点は、疾患活動性を非侵襲的に、かつ経時的にモニタリングできることです。この手法は炎症性疾患の知見を得るために有用ですが、がんや免疫関連疾患などの他の疾患の研究にも適用可能です。大腸炎を誘導するために、100 mLのオートクレーブ滅菌した飲用水に2 gのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を溶解し、実験用マウスの飲用水として提供します。なお、1匹あたり1日5 mLの飲水量を想定してください。スキャンを行う24時間前に、目的の抗体カクテルを遮光した滅菌シリンジに充填し、実験動物の尾静脈に静脈内投与します。実験当日、光の反射と吸収を最小限に抑えるため、電気シェーバーを用いて実験動物の腹部の被毛を剃毛します。厚さと吸収特性が定義された組織模倣ファントムを使用し、目的の抗体溶液を規定量でファントムに充填して、FMT装置で蛍光を測定します。次に、小動物用蛍光分子断層撮影（FMT）装置で「New Study」をクリックし、イメージングパラメータや投与量を含む関連トレーサーをスタディ記述欄に入力します。実験計画に従って研究グループを作成し、各グループに適切な数の動物を割り当てます。トレーサー構築物のシステム校正が完了したら、麻酔をかけた最初のマウスを仰臥位にして42 °Cの加熱可能な検査カセットに配置します。カセットをイメージングシステムに挿入し、対応する研究グループから適切なサンプルを選択します。投与したトレーサーを選択してトレーサー濃度の値が正しく算出されるようにし、スキャンの適切な波長で蛍光反射像を取得します。「Acquire Image」をクリックしてスキャン領域を囲み、蛍光反射像上にスキャン領域がオーバーレイとして表示されることを確認します。エラーが発生する箇所や被毛が残っている領域を避けるように注意しながら、関心領域を囲むまでスキャン領域を調整します。イメージターゲットに応じて、スキャンフィールド内の画像データポイント数を設定するためのスキャンフィールド解像度を選択します。次に、[Scan]をクリックし、選択した波長で画像取得を開始します。スキャンの終了後、動物をカセットから取り出し、ケージに戻す前にモニタリングを行いながら動物を完全に回復させます。その後、実験的に適切と思われるさまざまな時点でFMTを繰り返します。取得した画像を解析するには、適切な画像解析ソフトウェアを開き、最初のスキャンの生データを選択します。再構成ツールを使用して、蛍光分布の3Dマップを作成します。すべてのスキャンを適切な再構成データセットに追加したら、目的の最初のデータセットを開きます。選択した個々の実験動物に対して行われたすべてのスキャンが表示されます。適切なスキャンを選択し、[Load]をクリックしてください。トレーサー分布の3D再構築画像が、最初に取得した蛍光反射画像の上にオーバーレイとして表示されます。次に、再構築された3Dマップ上で非特異的なラベル蓄積の焦点を確認し、測定ツールを使用して関心領域（ROI）を選択します。すると、ソフトウェアが関心領域の蛍光強度を算出し、あわせてスキャン時に校正されたトレーサーのピコモル量測定値を生成します。本実験では、活性化マクロファージを直接視覚化するために、マウスF4/80に対する蛍光標識抗体を用いた。蛍光介在断層撮影により、非炎症性コントロール動物と比較して、大腸炎モデルマウスの大腸において蛍光トレーサーの蓄積が著しく増加していることが測定された。これは、大腸炎動物において単球の浸潤および活性化マクロファージへの分化が増加していることを示している。対照的に、非特異的な蛍光標識IgG抗体を適用したところ、大腸炎群および非炎症性コントロール群のいずれにおいても、腹部または腸管に検出可能な蛍光反応は認められず、F4/80抗体のプローブと標的との相互作用の特異性が証明された。摘出した結腸におけるF4/80標的トレーサー蓄積のex vivo測定により、in vivoで検出されたF4/80トレーサー信号の蓄積が結腸由来であることがさらに検証されました。実際に、算出された抗体結合量は組織学的に決定された浸潤マクロファージ数と良好に相関しており、特異的トレーサーを用いたin vivoイメージングが局所の疾患活動性の指標となり得ることが確認されました。適切に実施すれば、習得後は数分以内に操作と解析を完了させることができます。特異的抗体ベースのトレーサーの作製を含む準備手順には、通常2〜3日かかります。このような実験手順を計画する際は、抗体と動物疾患モデルの両方について、適切で信頼性の高いコントロールを組み込むことが重要です。本手順に続き、大腸内視鏡検査やフローサイトメトリーなどの他の手法を実施することで、さらなる疑問を解消し、データの検証および定量化を行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

びまん性蛍光トモグラフィは、前臨床、高を通じて比較的低コストの可能性のあるアプローチを提供しています...

癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

このビデオは、蛍光媒介断層撮影法(FMT)を使用して、大腸炎のマウスモデルにおける腸内マクロファージ浸潤を評価する技術を示しています。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を介してマウスに大腸炎を誘発すると、結腸に浸潤したマクロファージ上のF4/80糖タンパク質マーカーを認識する抗体が動物に注射されます。次に、マウスをFMTデバイスで画像化し、蛍光信号と反射率信号を3次元画像に再構成して、蛍光の空間分布と強度を決定します。...

蛍光媒介断層撮影法を使用してマウスの腸の炎症を評価する

我々は、炎症ステージを区別するための非侵襲的な画像化方法を記載している。ルミノールの全身送達は、好中球MPO活性に依存して急性炎症の領域を明らかにする。これとは対照的に、ルシゲニンの注入はマクロファージにおけるphoxの活動に依存して慢性炎症の可視化を可能にします。...

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

小動物イメージング技術は、シリアル診断検査およびインビボでの治療介入を行うことができる。最近では、適用範囲が大幅に拡大している、現在は大腸腫瘍発生の評価、創傷治癒および炎症の監視が含まれています。このプロトコルは、マウス内視鏡検査のこれらの多様な潜在的な用途を示している。...

マウス内視鏡検査のためインビボ発がんと腸の評価のマルチモーダルイメージング創傷治癒および炎症

トランスジェニックレポーターマウスと注射可能な蛍光標識を使用することにより、長期の生体内スピニングディスク共焦点顕微鏡法は、ApcMin/+結腸直腸癌モデルにおける骨髄細胞の挙動を腸腺腫に直接可視化することを可能にします。...

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージングのApc最小/ +腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

in vivoイメージングのための蛍光色素の使用は、オプソニン化、迅速なクリアランス、低い検出感度、および宿主に対する細胞毒性の影響によって大幅に制限される可能性があります。フィルムの水和と押出しによって蛍光色素をリポソームにカプセル化すると、蛍光の消光と保護が可能になり、高い検出感度でin...

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光インビボ光学イメージング

蛍光媒介断層撮影法(FMT)とマイクロコンピュータ断層撮影法(μCT)を組み合わせたハイブリッドイメージングのプロトコルについて説明します。融合・再建後、相互作用による臓器セグメンテーションを行い、蛍光分布の定量的測定値を抽出します。...

ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析

ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。...

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

この研究では、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して分泌された粘液を定量化し、塩化カルバモイルコリンなどの刺激に応答した粘液動態の正確な体積分析と視覚化を可能にする 3D...

ホールマウント組織イメージングを用いた腸粘液の三次元定量化

ここでは、減衰BSL-2承認の 結核菌...

初期血管内感染中のマウス肺における減弱型自生 性結核菌 のインバイタルイメージング

学ぶ蛍光トモグラフィーによるマウス腸管マクロファージ浸潤の可視化法。DSS誘導大腸炎モデルで疾患活動性を非侵襲的に定量的に評価し、炎症性腸疾患の治療研究に応用する。

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

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