癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

次の実験の全体的な目標は、同所性神経膠腫マウスモデルにおける上皮成長因子受容体発現の蛍光画像を作成することです。これは、A IICマウスの左大脳半球に、ヒトU2 51神経膠腫細胞を発現する緑色蛍光タンパク質を接種することによって達成されます。腫瘍が2週間成長した後、マウスに2つの蛍光トレーサーのカクテルを注射します。

次に、マウスを小動物のX線システムで画像化し、正確な画像再構成に必要な解剖学的データを収集します。このデータは、光源を解剖学的に配置し、光断層撮影システムの位置を検出するために使用され、カスタマイズされたソフトウェアを使用して蛍光データを収集し、最終的な画像を構築します。最終的に、この方法は、蛍光イメージングとX線イメージングの両方を使用して、上皮成長因子の過剰発現に基づいて腫瘍の画像を構築することができ、その精度はコントラスト増強磁気共鳴イメージングと比較できます。

電荷カップル、デバイスベースの小動物蛍光トモグラフィーなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、光増倍管を使用した単一光子計数検出が、光検出のためのはるかに高い感度とダイナミックレンジを提供することです。この方法は、最終的には、標的の発現を測定することにより、分子療法の成功を監視、測定するために使用できますが、皮下腫瘍は、表面イメージングを使用した非断層撮影法で容易に画像化されます。このシステムは、厚さ数cmまでの組織を通してイメージングするように設計されているため、イメージング、造影剤、薬剤送達、および脳腫瘍への漏出に特に適しています。

この方法は、がんバイオマーカーの発現に関する洞察を得ることができますが、感染症、肥満、アルツハイマー病などの老化要素など、他の疾患の研究にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、生体組織内での光伝播の拡散性の性質と、拡散光再構成にX線トモグラフィーを使用することの難しさのために苦労するでしょう。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

データ収集と画像再構成のステップを学ぶのは難しい場合があるため、蛍光システムから収集されたデータが適切に校正されていることを確認することが重要です。このニアファストソフトウェアパッケージは、光学データを読み取り、X線トモグラフィー画像を使用して有限要素メッシュを作成するように設計されており、これは蛍光再構成の空間テンプレートとして使用されます。まず、麻酔をかけた無脊椎ヌードマウスを滅菌外科用ドレープに置き、麻酔の深さを確認してから、切開部の皮膚をきれいに消毒します。

ベタジンを使用して、メスを使用して切開部位に滅菌外科用ドレープを置き、正中線のわずかに左、眼内線の0.5センチメートル後に小さな切開を行います。ランドマークを識別できるように、結合組織をすべて取り除いて頭蓋骨の表面をきれいにします。頭蓋骨が露出したら、無菌の1ミリメートルビットを備えた高速ドリルを使用して、中心線から2ミリメートル左、BGMAの2ミリメートル後ろに穴を開けます。

Hamilton Microsシリンジに、鈍い端の27ゲージ針を埋め込みます。次に、マウスを定位固定装置フレームに置きます。次に、つま先をつまんで深い外科的および審美的な平面を確認し、動物の外科的ドレープを交換します。

次に、装填したシリンジを脳定位固定装置フレームに固定します。シリンジを頭蓋骨の穴にかざし、針の先端を頭蓋骨の表面から3mm下に挿入します。次に、針を1ミリ引き抜いてポケットを作ります。

次のステップは、細胞を左大脳半球に5分間かけてゆっくりと注入することです。注射が完了したら、針を引き抜き、ベタジンで穴を綿棒で拭きます。細胞が注射部位の外側で増殖するのを防ぐために、マウスを脳定位固定装置フレームから取り外し、露出した穴を予熱骨ワックスで埋めます。

最後に、滅菌済みの5 OHナイロン縫合糸で切開部位を閉じます。マウスを加熱ケージに戻し、回復後に回復するまでモニターし、マウスに1キログラムあたり0.1ミリグラムのブプレノルフィンIPを130マイクロリットル注入し、イメージング前に腫瘍を14日間成長させます。マウスイメージングの日には、システムを起動して、レーザーと光検出器を約20分間ウォームアップします。

ドリフトやシステム感度を回避するには、イメージングガントリーの直接中央に100度×4度のエンジニアリングラインディフューザーを配置し、励起レーザーをシステムの検出チャネル間で均等に分散させます。ディフューザーの角度を手動で調整して、5つの集光チャンネルすべてで検出される信号の量を最大化します。次に、光学濃度を配置します。

すべての蛍光検出光電子増倍管の前にある2つの中性光フィルター(PMTと呼ばれる)と光学濃度。すべての透過率検出の前に1つの減光フィルターがあります。PMTは、レーザーの100の時間パルス拡散関数またはT psfsを、各レーザーごとに1秒の積分時間で順次収集し、レーザーリファレンスによって各TPSFを正規化し、レーザーリファレンスの時間ドリフトを補正し、各検出器と各レーザーのすべての反復で個別に平均

これらの平均TPSは、イメージング手順の12時間前に光学画像再構成で使用される検出器固有の機器応答関数です。テストマウスに蛍光トレーサーのカクテルを注入します。蛍光断層撮影システムの正確なキャリブレーションと動物の動きの制限は、この手順の最も難しい側面です。

画像の再構築は非常に不適切であるため、データ収集のわずかなエラーでも、再構築された画像に重大なエラーが発生する可能性があります。正確なデータが収集されるように、マウスを可能な限り固定し、スキャンの前後にキャリブレーションを繰り返して、準備ができたときに正確なキャリブレーションを取得する可能性を高めます。麻酔をかけた動物をイメージングベッドのグラスファイバーサポートに置きます。

連続ガス麻酔のためにヘッドをノーズコーンに配置した後、歯をバイトバーに固定し、動物をテープで固定します。マウスは、イメージングガントリーのおおよその中心に配置する必要があります。この位置決めは、励起レーザーをマウスの周りで180度回転させることでガイドでき、レーザーの焦点がレーザーの視点からマウスのほぼ中心にある点をすべての角度で照らすようにします。

適切な位置に配置したら、イメージングベッドとマウスを慎重にマイクロCTスキャナーに移し、マウスの頭部全体について93マイクロメートルの等方性の解像度で解剖学的情報を収集します。CT画像スタックを視覚化し、蛍光トモグラフィーシステムでイメージングするスライスを選択します。イメージングベッドとマウスを慎重に蛍光断層撮影システムに戻します。

各イメージングスライスのソース位置の数、各TPSF測定の積分時間、各ソース位置の反復回数、および以前に作成したCT画像スタックから目的のイメージングスライスの位置と数を選択します。次に、蛍光検出PMTの前にフィルターを配置して、透過率検出PMTの前にあるNDフィルターへのすべての励起光と光学密度を遮断します。これらの検出器の飽和を回避するには、データ収集ソフトウェアを実行して、両方の励起波長で定義された各ソース検出器位置で蛍光と透過率t psfsを収集します。

収集されたT psfsの各セットについて、基準PMTチャネルを使用してレーザー強度を監視および記録します。マウスの外面とイメージングベッドの位置を確認します。CT画像からロッドをサポートし、マウスとイメージングロッドの範囲を覆うマスクを作成します。

これとは別に、マウスマスクを使用して、near fastソフトウェアを使用して動物の有限要素メッシュを作成します。蛍光トモグラフィーシステムからのソースと検出器の位置を、マイクロCTと蛍光空間レジストレーション座標に基づいてメッシュの表面に位置特定します。イメージングベッドの位置と相互作用するソースまたは検出器の位置に関連付けられた光学データポイントを削除します。

サポートロッドは、レーザーリファレンスによって各ソース検出器位置で収集されたデータを正規化し、レーザーリファレンスの時間ドリフトを補正し、購入時の実験的テストによって決定されたフィルター感度を補正します。各ソース検出器位置のデータの生まれる比率を取り、有限要素動物メッシュに基づく透過率のフォワードモデルシミュレーションを掛けて、均一な光学特性を実現します。これは、ソースまたは検出器の組織結合に関連するエラーを軽減し、データをモデルに較正し、モデルデータの不一致の他の側面に合わせてデータを調整し、両方の波長で収集されたボーン比データのスケーリングされた差で構成されるデータベクトルを構築するために行われます。

スケーリング係数は、EGFR結合コントラストを最大化し、各検出チャネルのTPSFを入力として使用して較正された差分データで時間領域画像の再構成を実行し、観察されたコントラスト増強ターゲットトレーサーの蛍光マップを作成するために選択されます。これは、U2 51同所性神経膠腫腫瘍のマウスからの共登録CT解剖学的画像と重ね合わせた蛍光再構成の例です。蛍光再構成によって決定された神経膠腫の重心は、腫瘍の重心から 1 ミリメートル以内にあり、コントラスト増強磁気共鳴画像法によって決定されました。

データ取得用のソフトウェアは、このデバイス用にカスタムビルドされていますが、ほとんどの画像処理技術は、ニアファストソフトウェア available@nearfasts.org を使用して実行できます。したがって、この手順を試行する際は、画像再構成の前にシステムとデータの両方が正確にキャリブレーションされていることを確認することが重要です。このキャリブレーションでは、検出器間の感度と時間差を、バイオマーカーターゲットトレーサーの画像再構成に追従して考慮する必要があります。

非標的トレーサーの同様のイメージングは、非受容体媒介性の取り込みを補正する手段を提供する。これにより、トレーサーの結合量やin vivo受容体密度を、その開発後に定量化することができます。この技術は、他の研究者がX線イメージング誘導蛍光断層撮影システムを設計するきっかけとなり、より大きな動物の全身イメージングへの道を開きました。

このビデオを見れば、X線解剖学的イメージングと光学イメージングシステムを組み合わせてがんバイオマーカーイメージングを行うびまん性蛍光断層撮影実験の方法について十分に理解できるはずです。