ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

これらのアッセイの全体的な目標は、単球の走化性をin vitroでリアルタイムに定量化し、in vivoでリンパ球の遊走を追跡することです。in vitro法は、免疫細胞の走化性に対する血清因子の影響など、免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。in vitro技術の主な利点は、リアルタイムでの定量的および多重測定が可能なことです。

in vivo法は、特定の細胞タイプがレシピエント動物内でどのように移動するかという免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。in vivo技術は、同じ動物内の複数の細胞タイプの移動の定量的評価に特に有用です。実験を開始する前に、35 mm細胞培養皿中の蛍光色素でTHP-1細胞を完全培地中で摂氏37度、30分間標識します。

細胞をインキュベートしている間に、25ミリモルHEPESと0.1%BSAをバッファーした750マイクロリットルのHBSSを24ウェルプレートのバックグラウンドウェルとポジティブコントロールウェルに加えます。BSAを添加した水中のMCP-1を適切な濃度で実験用ウェルとポジティブコントロールウェルに加えます。そして、インサートのタブがプレートのノッチと揃うように注意しながら、各ウェルに多孔質インサートを配置します。

インサートを配置した後は、気泡が蛍光測定を妨げるため、ボトムウェルから気泡を取り除くことが重要です。インキュベーションの終了時に、標識した細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離により細胞を回収します。そして、得られたペレットを目視検査して、染料の取り込みを確認します。

次に、上清を慎重に真空吸引し、同じ遠心分離条件下で25ミリモルHEPESを添加した無血清RPMI-1640培地で細胞を洗浄します。ペレットをHEPESを含む新鮮な無血清培地に再懸濁してカウントします。そして、容量を1ミリリットルあたり6セルの1〜1.5倍10の最終濃度に調整します。

各ウェルの上部チャンバーに250マイクロリットルの細胞を追加し、プレートを摂氏37度のプレートリーダーに入れます。次に、色素の適切な蛍光励起波長と発光波長で、1〜3分間隔で底部チャンバーの蛍光測定値を取得します。養子移植のためのドナー細胞を準備するには、まず、麻酔をかけた8〜12週齢のC57ブラックシックスマウスの雄から脾臓全体を、氷上に完全な培地が入った細胞培養皿内の40マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターに

シリンジプランジャーの端を使用して、メッシュを通して脾臓を優しく浸軟させます。単一細胞懸濁液が得られたら、細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、4容量の塩化アンモニウムカリウム溶解緩衝液を添加して赤血球を枯渇させます。室温で5分後、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞濃度の2〜5倍で完全な培地に再懸濁します。

新しい40マイクロメートルのナイロンメッシュで細胞を濾し、細胞の破片を取り除きます。そして、レシピエントマウス1匹につき7細胞に対して10回、生細胞適合蛍光色素で標識し、その後37°Cで30分間固定すると保持されます。インキュベーションの終了時に、HEPESを添加した4容量のHBSSで細胞を洗浄します。

そして、ペレットを新鮮なHBSSとHEPESで、ミリリットルあたり10〜8番目の細胞濃度の1倍に再懸濁します。次に、ドナー細胞を短時間ボルテックスし、27ゲージの0.5インチ針を備えた1ミリリットルの注射器にロードします。麻酔をかけた8〜12週齢のC57ブラック6レシピエントマウスを腹臥位に置き、最初の動物の眼の背側の皮膚に軽度の尾側圧力を加え、眼球をわずかに突き出させます。

100マイクロリットルのドナー細胞の眼窩後注射のために針を内側に向けます。次に、針を徐々に引き抜き、マウスを個別の回復ケージに入れ、完全に回復するまで監視します。動物が適切に麻酔されていること、および動物間および実験間で一貫した細胞送達を確保するために、注射手順が十分に実践されていることが重要です。

養子縁組の移管後24時間以内に、脾臓をレシピエント1人あたり1ミリリットルの完全な培地に収穫します。そして、今示したように、赤血球を含まない単細胞懸濁液を生成します。カウント後、細胞懸濁液を染色緩衝液中の7細胞/ミリリットル濃度の3倍10に調整します。

そして、100マイクロリットルの細胞を96ウェルの丸い底板の個々のウェルに移します。目的のマーカーについて細胞を染色します。標準的なフローサイトメトリー解析プロトコルに従って。光から保護された氷上で20分間過ごした後、細胞を100マイクロリットルの染色緩衝液で洗浄し、ペレットを200マイクロリットルの新鮮な染色緩衝液に再懸濁して2回目の遠心分離を行います。

次に、ペレットを125マイクロリットルの新鮮な染色バッファーに再懸濁し、標準プロトコルに従ってフローサイトメーターで細胞サンプルを分析します。遊走を追跡するための自動蛍光測定値は、血清の存在下で増強されるMCP-1への細胞遊走の誘導を明確に示しています。遊走刺激の強さにもよりますが、蛍光シグナルの増加までに少なくとも15分の遅延があり、これは、細胞がインサートの下側から下部チャンバーに溶液に入るときにピークに達し、徐々に減少する可能性があります。

蛍光標識された複数の細胞集団が養子移植される場合、細胞集団の混合におけるばらつきを説明するために、インプット材料内の細胞集団の相対的な割合を定量することが重要です。例えば、この実験では、緑色とオレンジ色の蛍光細胞の比率は0.97対1でした。輸送は、回収された標識細胞の数を回収された細胞の総数で割ったものとして定量化されました。

回収される細胞の数には動物間でかなりのばらつきがありますが、どの動物でも、緑色とオレンジ色の蛍光細胞の比率は通常、ほぼ同じです。一度習得すれば、in vitro技術は4時間で完了し、in vivo技術は適切に実行すれば6時間で完了することができます。この手順を試みる際には、実験チャンバー内で気泡を作らないようにすること、および養子として移植された細胞の眼窩後後注入中に一貫性を保つように努めることを忘れないでください。

その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者がin vitroおよびin vivoで走化性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、in vitro走化性アッセイをリアルタイムで実施およびモニタリングする方法、および天然リンパ球の養子移植およびin vivo移動の追跡のために天然リンパ球を単離する方法について十分に理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。