生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

この実験の全体的な目標は、マウスモデルにおける標的細胞のin vivo抗原特異的死滅の検出を可能にすることです。この方法は、攻撃された免疫系における標的細胞の抗原特異的な細胞溶解死の十分性と検出、およびこれをT細胞の操作によってin vivoでの機能を強化する方法など、免疫学分野の質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、アッセイが腫瘍の成長や感染に依存しないため、研究者が抗原特異的な細胞溶解性を直接かつ迅速に評価できることです。

この手順を提示するのは、Cara HaymakerとYared Hailemichaelがメラノーマ腫瘍内科から私たちを指導します。マウスに麻酔をかけた後、テキストプロトコルに従って、70%イソプロピルアルコールを使用して、注射用のテールベース領域にスプレーします。シリンジに取り付けた27ゲージの針を使用し、斜角側を上にして、テール基部領域に4〜5ミリメートル浸透させ、予め調製したペプチド溶液100マイクロリットルを注入します。

次いで、ワクチン注射部位の横方向に、100マイクロリットルの抗CD4D抗体を注入する。ワクチン接種部位にマウスあたり50ミリグラムのイミキモドクリームを慎重に塗布します。クリームが見えなくなり、完全に吸収されるまで、クリームを表面にこすりつけます。

次に、組換えヒトrhIL-2タンパク質の1ミリリットルあたり100,000IUを下腹部に腹腔内に注入します。マウスから脾臓細胞を単離し、赤血球を溶解した後、テキストプロトコルに従って、最初に細胞を1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞で再懸濁することによりペプチドパルスを完全培地で実施する。細胞を2本の15ミリリットルの円錐管に分割し、パルスまたは非パルスとしてラベル付けします。

OVA 257〜264パルスの場合は、ペプチド1ミリリットルあたり1マイクログラムをパルスとラベル付けされたチューブに追加します。.次に、パルス細胞と非パルス細胞を摂氏37度で1時間インキュベートします。パルスチューブと非パルスチューブの両方に10ミリリットルの完全な培地を加えて、ターゲット細胞を洗浄します。

次に、残りの細胞を475 x gおよび室温で5分間遠心してから、スーパーナテントを吸引します。CSFEの1ミリリットルあたり1マイクロリットルをRPMI 1640に2%FBSで添加することにより、CSFE高標識培地を調製し、最終濃度を1ミリメートルあたり5マイクロモルにします。次に、CSFE1640にCSFE1ミリリットルあたり1マイクロリットルを2%FBSで添加し、最終濃度を1ミリリットルあたり0.5マイクロモルにすることにより、CSFE低標識培地を調製します。

標的脾液を標識するには、調製したCSFE高標識培地でパルス細胞の1ミリリットルあたり6番目の細胞に10個を再懸濁し、CSFE低標識培地で非パルス細胞の1ミリリットルあたり10個から6番目の細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を穏やかに反転または渦巻き状に混合します。次に、細胞を摂氏37度で15分間インキュベートし、5分ごとに細胞を再混合します。

次に、各細胞懸濁液に10ミリリットルの完全培地を加え、細胞を475 x gおよび室温で5分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、10ミリリットルの冷たいPBSを使用して細胞を再懸濁します。細胞を475 x g、摂氏4度で5分間回転させてから、PBS洗浄を繰り返します。

細胞をカウントし、ペプチドパルスCSFE高標識細胞と非パルスCSFE低標識細胞を1:1の比率で混合して、レシピエントマウスに注入します。ベースラインフローサイトメトリー評価に使用するために、1×10〜6番目の混合細胞のアリコートを保管してください。標的細胞を注入し、再単離した後、テキストプロトコルに従って、標準的なフローサイトメトリープロトコルを用いてCTL活性の評価を行い、FITCチャネルと488ナノメートルレーザーを用いて細胞を捕捉し、励起を行います。

CSFE標識標的細胞を注入する前に、1:1細胞混合物をフローサイトメーターで分析し、CSFE高標的細胞とCSFE低標的細胞の両方のベースライン頻度を決定しました。ここに示されているのは、CSFE 母集団の変化を検出するためのゲーティング戦略です。初期ゲートは、FSCおよびSSCパラメータを使用して作成されました。

次に、この集団が非標識内因性ペンロサイトと比較すると比較的小さいため、頻度の変化を評価する前に、総CSFE陽性細胞をサブゲートしました。注射前の CSFE 集団の相対度数の例をここに示し、1 対 1 に近づける必要があります。このパネルでは、covexプライミングの必要性が見られ、注射後24時間で抗原パルスCSFE高標的細胞の死滅は観察されませんでした。

この図は、注入前に観察されたピークがほとんど検出されず、その比率が 50% から 1% の検出に劇的にシフトしたため、抗原パルス CSFE 高標識標的細胞の効果的な死滅を示しています。最後に、この図は、注射後6時間および24時間の両方でこの集団の損失を評価することにより、抗原パルスCSFE高標識標的細胞の死滅の動態も示しています。一度習得すると、この技術は抗原とT細胞の機能に応じて、2〜3日で実行できます。

この手順を試行する際には、アッセイを実行する前に、CSFE標識が均一でなければならず、CTL応答の動態を評価する必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ELISA、ELISPOT、細胞内フローサイトメトリー染色などの他の方法も実行して、エフェクター機能の変化を評価し、他の追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、感染や腫瘍がない場合のin vivo CTL機能の評価方法について十分に理解できるはずです。