線虫の遺伝子発現レベルの間に寿命変調下広い範囲食事制限によってエンコードされた情報の定量化

このフレームワークの全体的な目標は、広範囲の食事制限に関与する遺伝子を特定し、その発現レベルによってコード化された環境情報を定量化し、環境を寿命に結び付ける基本的なコード戦略を理解することです。この方法は、老化の神経生物学分野における重要な疑問、例えば、どの遺伝子が環境から情報を伝達して寿命を調節するのかなど、答えるのに役立ちます。このフレームワークは、C Elegan 感覚システムへの洞察を提供するだけでなく、より一般的には、コンポーネントが協力して環境情報を処理する任意の生物学的システムにも適用できます。

この手法の主な利点は、ニューロンのグループによってコード化された環境情報を定量化し、この情報を下流のターゲットに伝達するためにニューロセルキートが採用するコーディング戦略を決定することです。テキストプロトコルに従ってMGMプレート上でOP50を培養した後、2リットルの三角フラスコのそれぞれに500ミリリットルのLB培地を調製し、それらをオートクレーブします。各フラスコにOP50の単一コロニーを接種し、37°C、200RPMで約14時間

次に、ストレプトマイシンのミリリットルあたり50マイクログラムを培養物に補給します。次に、フラスコを摂氏37度でさらに30分間振ってから、フラスコを氷の上に15分間置きます。各培養物の450ミリリットルを別々の500ミリリットルの滅菌遠心分離瓶に移し、残った培養物は細菌の濃度を決定するために使用されるため、氷上に保持します。

ボトルを4500 x G、摂氏4度で25分間回転させ、上清を捨ててボトルを氷上に保管します。900マイクロリットルの滅菌LBで、各フラスコから残った培養物100マイクロリットルを希釈します。1ミリリットルの滅菌LBを使用して分光光度計をゼロにし、各培養物の10倍希釈のOD600を決定します。

例えば、一晩培養の10倍希釈のOD600が0.28の場合、培養物の実際のOD600は2.8であった。この例から、1.12 x 10〜10 OP50細胞/ミリリットル(OD600が56に等しい)のワーキングストック溶液に到達するには、450ミリリットルの培養物からペレットを元の容量の20分の1または22.5ミリリットルの滅菌S基礎溶液またはSBに再懸濁し、ストレプトマイシンの50マイクログラム/ミリリットルを補充します。SBおよび連鎖球菌の実験で使用されるその後のすべての濃度は、この表に記載されている希釈係数を使用して、作動ストックの段階希釈から行います。

テキストプロトコルに従ってC Elegansレポーター株を培養および同期した後、15ミリリットルのSBを使用して3つのプレートから線虫を連続的に洗い流し、液体を滅菌15ミリリットルのチューブに集めます。L4幼虫が自然に沈殿するのを待ってから、液体の約0.5ミリリットルを除くすべてを吸引します。野生型レポーター株では、このタイプは L4.In 突然変異体の背景よりも若い幼虫を除去し、このステップは、OK3125の死亡の場合には、私たちのような任意の逮捕された幼虫の除去に役立ちます。

次に、9ミリリットルのSBを使用して、ワームを再懸濁します。再度、L4幼虫の沈降速度を監視し、L4幼虫のほとんどがペレット化したら、約0.5ミリリットルの上清を除くすべての上清を吸引してから、プロセスを繰り返します。L4幼虫を含む液体に0.1%プルロン酸F127を添加した10マイクロリットルの滅菌S基礎培地を追加します。.

これは界面活性剤として機能し、幼虫がプラスチックピペットチップの内面に付着するのを防ぎます。P200ローリテンションピペットチップを使用して、幼虫を静かに再懸濁し、次に150マイクロリットルを3つの10センチメートルRNAiプレートに分注し、5 x 225マイクロリットルの卵5RNAiバクテリアを播種します。ワームが5つのバクテリア芝生すべてに均等に分布していることを確認します。

液体が寒天に吸収されたら、洗浄手順で除去されなかったL4以外の幼虫をプレートから手動で摘み取ります。その後、プレートを摂氏20度で24時間保管します。広範囲のDRを開始するには、前の手動除去ステップを逃れた若い幼虫をすべて摘み取り、生後1日の成虫のみをプレートに残します。

各株について、15ミリリットルの滅菌SB連鎖球菌を使用して、3つのプレートから1日の老人を15ミリリットルのチューブに洗い流します。ワームが自然に沈殿するのを待ってから、0.5ミリリットルの上清を除くすべての上澄みを吸引します。9.5ミリリットルのSB連鎖球菌でワームを再懸濁し、沈降と洗浄の手順を繰り返します。

0.5ミリリットルを除くすべての上清を最終的に洗浄して吸引した後、10マイクロリットルのSB Pluを追加し、P200ピペットチップを使用して幼虫を穏やかに再懸濁します。100マイクロリットルの幼虫をNSCプレートに分注し、5 x 225マイクロリットルのバクテリアを播種し、1ミリリットルあたり2 x 10の濃度で9番目の細胞にします。100マイクロリットルを5つのバクテリア芝生すべてに均等に分配します。

顕微鏡下で、プレート上に存在する動物の数を推定し、プレートあたり100〜150匹のワームを目指します。この範囲内でワーム密度を達成するために必要な液体の量を決定し、それをさらに2つのプレートに分注します。最初のプレートのワームの数もこの範囲に収まるように調整します。

その後、プレートを摂氏20度で24時間保管します。翌日、2日齢の成虫を収集し、食物の実験的な濃縮を望んで播種された新しいNSCプレートにワームを分配します。液体が寒天に吸収されたら、プレートを目的の実験温度に24時間移動します。

翌日、生後3日の成虫を集めて、同じ実験濃度の食物を播種した新鮮なNSCプレートに分配します。液体が寒天に吸収されたら、プレートを実験温度に48時間戻します。最後に、マイクロ流体デバイスを使用して動物を画像化してから、テキストプロトコルに従ってデータを組み立てて定量化します。

ここに示すように、野生型n2系統の平均寿命は、広範囲のDRに対して複雑な応答を示します。この応答の大きさは、daf-7遺伝子のall変異体では減衰しており、この遺伝子が食物量の変化に正しく反応する線虫の能力に影響を与えていることを示唆しています。daf-7遺伝子および野生型バックグラウンドの転写レポーターの平均発現レベルは、daf-7(遺伝的背景)の広範囲 DR.In に対して複雑な非単調性応答も示し、この転写レポーターの発現は非常に弱毒化され、食物レベルの変化に対してほとんど応答を示さない。この図は、特定の食品レベルにおけるADFニューロンにおけるTPH1発現とASIニューロンにおけるdaf-7発現の同時分布の推定を示しています。

これらの棒グラフは、TPH1およびdaf-7の遺伝子発現レベルに基づいて、ADF、ASI、およびNSMニューロンによって組み合わせまたは個別にコード化された食品情報を示しています。符号化の冗長で相乗的な特性は、ニューロンによって符号化された組み合わせ情報と個々の情報との比較から生じます。これは、右側の積み重ねられたバーの高さの差によって表される情報と、全回路によって符号化された情報との比較から生じます。この手順を試みる際には、情報理論を再現してコード戦略を定量化するには、遺伝子発現分布の正確な推定が必要であることを覚えておくことが重要です。

このため、サンプルサイズは、このフレームワークの一般的な適用性にとって重要な要素です。このビデオを見れば、食物の豊富さと寿命を結びつける新しい遺伝子を特定し、特徴付けるために、広範囲の食事制限実験を行う方法についてよく理解できるはずです。