ホルモン多電極アレイを用いた脊椎動物の神経回路網関数の開発化合物の影響の評価

この実験プロトコルの全体的な目標は、ビスフェノールなどの内分泌かく乱化合物が、多電極アレイ上に確立された脊椎動物のニューロンネットワークのネットワークスパイキング活性に及ぼす影響をテストすることです。この方法は、発生神経生物学や環境毒物学における重要な疑問、例えば、胚性脳におけるネットワーク活動の発達に対する環境毒素の作用機序などに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、平均発火率、スパイクの総数、スパイク振幅、同期性などのニューロンネットワークパラメータへの影響を研究できるようになったことです。

私たちの以前の研究では、EDCがニューロンネットワークの直接的な出力である言葉や行動に影響を与えることが示されており、私たちのプロトコルは現在、これらのネットワークに対するEDCの影響を理解することを目指しています。ニューロンプレーティングの日に、マイナス20°Cの冷凍庫から細胞外マトリックスのバイアルを取り出し、70%エタノールをスプレーして氷の上に置きます。細胞外マトリックスを氷上で解凍してください。

ECMは摂氏0度以上で重合するため、室温で解凍しないでください。BSL2フードで作業し、100マイクロリットルのアリコートに300マイクロリットルの冷たい神経基礎培地を追加することで、細胞外マトリックスを25%に希釈します。次に、P200ピペットを使用して、電極に触れないように注意しながら、多電極アレイの中心に100マイクロリットルの25%細胞外マトリックス溶液を追加します。

すぐにECMを取り外し、表面に薄膜を残します。多電極アレイを覆い、ニューロンをプレートする準備ができるまで組織培養インキュベーターに入れます。ひよこニューロンの分離は、E7卵の外殻を70%エタノールで滅菌することから始めます。

この時点から無菌状態を維持することが重要です。すべての機器が70%エタノールで滅菌され、溶液が滅菌されていることを確認してください。解剖フードを使用すると便利ですが、迅速に行えば解剖に絶対に必要というわけではありません。

次に、胚を回収して斬首した後、目の周りを切って眼球を取り除きます。次に、デュモンの5番細い鉗子とスプリングハサミを使用して腹側を切開し、皮膚の外層を取り除き、前脳と視蓋を露出させます。ピールメンブレンを慎重に剥がし、剥がします。

HBSSが入った別のシャーレに前脳を移し、スプリングハサミで約2mmの小片に切ります。滅菌トランスファーピペットを使用して、前脳の断片を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。前脳の破片が遠心分離管の底に沈んだら、HBSSをできるだけ多く取り除きます。

次に、予め温めた0.5%トリプシンEDTAを1ミリリットル加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。パスツールピペットを使用して、組織片を乱さずにトリプシンを慎重に取り除きます。1ミリリットルの神経基礎培地を追加し、組織の片を底に沈めます。

培地を取り出して洗浄を繰り返した後、2ミリリットルの神経基礎培地を追加し、ティッシュがなくなるまで穏やかに滴下します。再懸濁した細胞を神経基礎培地で1〜10に希釈します。トリパンブルー色素と血球計算盤を使用して、生存細胞をカウントします。

カウント後、解離した細胞をECMコーティングされた多電極アレイ上に、1平方ミリメートルあたり2,200細胞の密度でプレートします。翌日、神経基礎培地中の10マイクロモルBPAを治療した多電極アレイに加えます。取得当日は、培養培地を新鮮な神経基礎培地と交換し、アレイをCO2インキュベーターに最低2時間戻してから記録します。

記録ソフトウェアを起動し、温度アイコンをクリックして、多電極アレイの温度を摂氏37度に設定します。取得パラメータを設定するには、左側のウィンドウパネルでストリームを選択し、museアイコンを右クリックします。次に、[処理の追加]と[スパイク検出器]を選択し、ポップアップウィンドウで[OK]をクリックします。

Spike detector six by STDがファイル名の下に表示されます。次に、スパイク検出器を右クリックし、[処理とバースト検出器の追加]を選択して、ポップアップウィンドウで[OK]をクリックします。バースト検出器ISIは、ミューズアイコンの下に表示されます。

次に、バースト検出器を右クリックし、[処理と神経統計コンパイラの追加]を選択します。ポップアップウィンドウで、ファイルヘッダー、集約ウェル統計、および同期が選択されていることを確認し、[OK]をクリックします。統計コンパイラが下に表示されます。画面下部の時計アイコンをクリックし、設定セクションの情報を変更して、5.1分ごとに記録し、5分間記録します。

これはすぐに開始され、1回実行されます。インキュベーターから多電極アレイを取り出した後、記録ユニットに置き、所定の位置にロックします。スケジュールされた録画セクションの[録画の開始]をクリックして、ネットワークアクティビティの記録を開始します。

通常、録音時間は5分で十分ですが、最大10分の長い録音も取得できます。記録後、多電極アレイをインキュベーターに戻します。BPA処理されたE7ニワトリの前脳培養では、対照培養と比較すると、スパイクの平均数は有意に少なくなります。

BPAで処理されたE7ニワトリの前脳培養では、対照培養と比較すると、平均同期指数は有意に低くなります。このテクニックを習得すると、適切に行えば3時間未満で完了できます。この手順を試行する間は、スパイク活動を記録している間も、常に無菌状態を維持することを覚えておくことが重要です。

この手順に従うと、抗てんかん薬や抗うつ薬などの潜在的な薬剤がネットワーク活動に及ぼす影響を、その作用機序を理解するためのステップとして評価できます。多くのEDCは、発達中に脳に微妙な影響を及ぼし、それが行動の変化として現れます。ビヘイビアは、基盤となるネットワークアクティビティの直接的な出力です。

私たちのプロトコルは、これらの化合物がネットワーク活動に及ぼす影響を分析することを目的としています。