多電極アレイ上でのニワトリ胚性ニューロンの単離と培養

初期段階の胚を含む受精鶏卵を取ります。

殻を滅菌し、慎重に開けます。

胚を取り除きます。頭部を解剖し、バッファーを含む培養プレートに移します。眼球を取り除きます。

開して皮膚層を取り除き、前脳と中脳を露出させます。

内膜層と血管を取り除きます。前脳を解剖し、バッファー付きの培養プレートに移します。

組織を小さな断片に切断し、円錐形のチューブに移します。フラグメントが落ち着いたら、バッファーを取り除きます。

タンパク質分解酵素溶液を加えます。インキュベートして組織の細胞外マトリックスを消化し、ニューロンを緩めます。

酵素が豊富な培地を取り除き、神経基礎培地で洗浄し、残りの酵素をすべて除去します。

神経基礎培地を追加します。組織を機械的に解離して、ニューロン懸濁液を得る。

これらのニューロンを細胞外マトリックスでコーティングされた多電極アレイシステムに播種します。神経基礎培地を加えてインキュベートします。

ニューロンは突起を付着して拡張し、ニューロンネットワークを形成します。

ニューロンプレーティングの日に、-20°Cの冷凍庫から細胞外マトリックスのバイアルを取り出します。70%エタノールをスプレーし、氷の上に置きます。必ず氷上で細胞外マトリックスを解凍してください。ECMは摂氏0度以上で重合するため、室温で解凍しないでください。

BSL-2フードで作業し、100マイクロリットルのアリコートに300マイクロリットルの冷たい神経基礎培地を加えることにより、細胞外マトリックスを25%に希釈します。次に、P200ピペットを使用して、電極に触れないように注意しながら、100マイクロリットルの25%細胞外マトリックス溶液を多電極アレイの中心に加えます。すぐにECMを取り外し、表面に薄い膜を残します。

多電極アレイを覆い、ニューロンをプレーティングする準備ができるまで組織培養インキュベーターに入れます。E7卵の外殻を70%エタノールで滅菌することにより、ニワトリのニューロン分離を開始します。この時点から無菌状態を維持することが重要です。すべての器具が70%エタノールで滅菌され、溶液が無菌であることを確認してください。解剖フードを使用すると役立ちますが、迅速に実行する場合、解剖に絶対に必要というわけではありません。

そして、胚を回収して首を切った後、目の周りを切り、眼球を取り除きます。次に、デュモン5番細い鉗子とバネハサミを使用して腹側を切開し、皮膚の外層を取り除き、前脳と視神経蓋を露出させます。皮膜を慎重に剥がして取り除きます。

前脳をHBSを含む別のペトリ皿に移し、バネハサミで約2ミリメートルの小片に切ります。滅菌移送ピペットを使用して、前脳片を50ミリリットルの遠心分離管に移します。前脳の破片が遠心分離管の底に沈んだら、できるだけ多くのHBSを取り除きます。

次に、予熱した0.5%トリプシン-EDTAを1ミリリットル加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。パスツールピペットを使用して、組織片を乱すことなくトリプシンを慎重に除去します。1ミリリットルの神経基礎培地を加え、組織片を底に沈めます。培地を取り除き、洗浄を繰り返した後、2ミリリットルの神経基底培地を加え、組織片が見えなくなるまで穏やかに粉砕します。

再懸濁した細胞を神経基底培地で1〜10に希釈し、トリパンブルー色素と血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。計数後、関連する細胞をECMコーティングされた多電極アレイに2,200細胞/平方ミリメートルの密度でプレートします。