DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

新たに発見された 5-メチルシトシン (oxi mCs), 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) の酸化フォームと 5-carboxylcytosine (5caC) は、独自の機能的役割の異なる DNA 変更を表す場合があります。ここの可視化から oxi mCs の空間分布、信号強度プロファイルとの共存の半定量的なワークフローを説明します。

この技術の全体的な目標は、核内の免疫染色によって視覚化されたDNA修飾の空間分布とシグナル強度を評価するための計算ツールを提供することです。この方法は、エピジェネティクスの分野における重要な質問に答えるのに役立ち、異なるモデルシステムにおける核局在とDNA修飾の相対レベルの調査を可能にします。この手法の主な利点は、DNA修飾がボットシグナルの大きさと分布によって測定されることです。

この手法の意味するところの1つは、さまざまな生体システムにおけるDNA修飾の潜在的な機能列の理解を容易にすることです。この手法には、免疫組織化学によって検出可能な他のエピトープの計算分析の追加のアプリケーションもあります。まず、共焦点顕微鏡画像のLSM形式のファイルを開きます。

[画像処理] を選択し、分析する画像を選択します。サンプル間の強度プロファイルを比較する場合、直接比較するにはレーザー出力とゲインが一貫している必要があることに注意してください。次に、[すべて表示]をクリックしてすべてのグラフィカルコントロールを表示し、[グラフィックス]タブを選択し、長方形ツールを選択して目的の核を含む領域を選択します。

次に、cut region コマンドを使用して、関心のある領域を分離します。次に、画像を新しい名前とLSMまたはCZI形式で保存し、ZenBlueソフトウェアでファイルを再度開きます。Zen BlueでZENデスクを開き、Zen BlackでZENに送信コマンドを使用して、ZenBlueでファイルを開きます。

次に、2.5dというラベルの付いたタブをアクティブにして、2.5dでの画像の視覚化を有効にします。[すべて表示] をクリックすると、すべてのグラフィカル コントロールが表示され、4 つの灰色のバーを使用して設定を変更できます。バーは、スケールバーのズーム、回転、軸の傾き、拡大と縮小を制御します。

個々のピークを最適に視覚化するレンダリングモードを選択し、パーセンテージを変更して長距離を変更します。パーセンテージが小さいほど、個々のピークがより明確になります。2.5d画像を保存する前に、2.5dプロットの下にある灰色の矢印をクリックして、ファイルリストとグラフィカルツールを非表示にします。

次に、キーボードの print screen キーを使用して、プロットをスクリーンショットとして保存します。ソフトウェアで画像処理オプションを開き、目的のファイルを開きます。次に、プロファイルタブを選択し、[すべて表示]タブを選択して、すべてのフォーマットオプションにアクセスします。

プロファイル タブで、テーブル オプションと矢印ボタンを選択します。次に、マウスを使用して開始点を選択し、連続する数のセルに線を引くと、この線に沿ったセルの強度プロットが強度測定値のテーブルとともに生成されます。この表には、赤、緑、青の蛍光のピクセル強度が赤になる距離も示されていることに注意してください。

単位はミクロンです。このデータをエクスポートするには、テーブルを右クリックし、[テーブルの保存]を選択して、テキストファイルとして保存します。強度プロファイルを保存するには、エクスポートオプションを選択し、ポップアップウィンドウで、タグ付けされた画像ファイル、画像ウィンドウの形式と内容、単一ペイン、データの2つのオプションを切り替えます。

次に、プロンプトに従ってファイルを保存します。次に、必要な強度プロファイルごとにこのプロセスを繰り返します。ソフトウェアで、画像処理を選択し、目的の画像ファイルを選択します。

次に、co-localization analysis のラベルが付いたタブを選択し、すべて表示を選択してすべての書式設定オプションにアクセスします。画面の下半分にある4つのタブから、共ローカリゼーションを選択し、テーブルと画像のオプションを選択します。次に、タブの上部にある3番目のアイコンを選択し、ポップアップテキストで識別され、閉じたbesierを選択します。

このツールを使用して、1 つの核を囲みます。その後、値がテーブルに表示され、赤色と緑色の蛍光の散布図が生成されます。このプロットの軸は移動可能で、これにより検出のゲートが制御されます。

核内のすべてのピクセル強度は、正の信号と見なす必要があります。DNA修飾のレベルは核全体で異なるため、弱いシグナルを考慮に入れるために、データをゲートしません。ここで強調すべきは、背景値を分析に含めるべきかどうかは議論の余地

重要なのは、オーバーラップ係数が2つのチャンネル間の信号強度の違いに依存しないことです。一方、人物相関係数は信号間の線形関係を前提としています。次に、データセットを完成させるために、原子核を取り囲むこのプロセスを繰り返します。

次に、データをエクスポートするには、テーブルを右クリックし、オプションに従ってデータを保存します。コローカリゼーション画像を保存するには、タグ付き画像ファイル、画像ウィンドウ、単一ペイン、データの内容の2つのオプションを指定してエクスポートコマンドを使用し、オプションに従ってファイルを保存します。5つのメチルシトシンの2つの酸化誘導体の空間分布を、記載されたプロトコルを使用して、分化ハファディック前駆細胞で調べました。

赤と緑のシグナルは、2つの異なるDNA修飾を表しています。信号は、オーバーラップが限られて明確に定義されています。予想と一致して、2つのシグナル強度と対応する細胞のプロファイルは、互いに強く一致しません。

この明確なパターンは、5つのメチルシトシンのタップ依存性酸化が、特定のクロマチン領域で異なる酸化誘導体を生成することを示唆しています。2つのDNA修飾の同様の比較が、Daoy髄芽腫細胞とBXD上衣腫細胞で行われました。どちらの細胞系譜も小児脳腫瘍に由来します。

定量化により、BXD細胞はDoid細胞と比較して、両方のシグナルのレベルが有意に低いことが明らかになりました。次に、5MCの酸化誘導体の共局在について、未分化のヒトiPS細胞で調べた。肝内胚葉分化と hiPSC の誘導後 24 時間。

この解析では、分化の誘導に伴ってシグナルの共局在が大きく変化しましたが、これは未分化細胞のCACが5個減少したことに起因する可能性があります。このビデオを見れば、2.5d強度のプロットとプロファイルの生成方法と、共局在化データの生成方法について十分に理解できるはずです。ここで説明する画像解析および可視化ツールは、エピジェネティックな研究に貢献し、異なる実験グループにおける異なるDNA修飾のシグナルを比較的迅速に比較する方法を提供します。

このテクニックは、一度マスターすれば、きちんと行えば1時間ほどでできるようになります。顕微鏡検査中は、露出過多を避け、異なる実験グループに同じ設定を使用することが重要です。マウント内の気泡や浸漬が不十分な場合、局所的な蛍光損失を引き起こす可能性があるため、スキャン領域の目視検査が重要です。

この手順は、Zen Blueを使用して核をセグメント化し、関心領域を作成することでさらに自動化できます。これらの領域をZen Blackにインポートして、複数の核の共局在分析を行うことができます。