ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

この手順の全体的な目標は、一過性発現システムにおけるタンパク質間相互作用を定量的に検出することです。この測定は、化学的または環境的処理後のタンパク質タンパク質の方向性を定量的に監視する方法など、量子シグナルトランザクション分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ルミノメーターまたはCCDカメラを使用して、タンパク質タンパク質の方向強度を表すルシフェラス活性を検出するため、結果がより正確になることです。

この手順を開始するには、5%次亜塩素酸ナトリウムとゼロポイント1%トリトン×100を含む溶液1ミリリットルを、種子を含む1ポイント5ミリリットルの微量遠心チューブに追加します。溶液を5分間休ませて、種子を滅菌します。次に、種子を滅菌水で5回洗います。

洗浄した種子を200マイクロリットルの滅菌水に懸濁します。細いチップを使用して、個々のシードをめっきしたMS寒天培地の表面に慎重に置きます。プレートを摂氏4度で3日間保管し、発芽を同期させます。

この後、ミディアムプレートを通常の成長条件下で10日間保管します。発芽した苗を土壌に移し、根を傷つけないように注意してください。トレイを透明なプラスチックカバーで一晩覆い、湿度を維持します。

制御された成長室で7週間植物を育て、その後、アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの浸潤の準備が整います。まず、150ナノグラムのプラスミドをa-tumefaciensコンピテントセルGV3101株に導入します。a-tumefaciens培養物を含むチューブをシェーカーに入れ、4時間インキュベートします。

ガラス棒を使用して、培養物をチューブからLB培地に移します。a-tumefaciensとLB寒天培地を摂氏28度で4日間培養します。次に、各プレートから単一のa-tumefaciensコロニーを、3ミリリットルのLB液体培地を含む独自のチューブに接種する準備をします。

280 RBMで摂氏28度で24時間振とうし、培養物を増殖させます。次に、75マイクロリットルの細菌培養物を、15マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンと50マイクログラム/ミリリットルのリファンピシンを含む15ミリリットルの新鮮なLB液体培地に移します。OD600が0.5〜1になるまで、30°Cで220RPMで約8時間細菌を培養します。

この後、培養物を15ミリリットルの遠心分離管に移します。重力4000倍、摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を捨て、パレットを15ミリリットルの形質転換溶液に再懸濁します。

重力4000倍、摂氏4度で15分間遠心分離します。その後、懸濁液と遠心分離のステップをもう一度繰り返します。上清を捨て、パレットを5ミリリットルの形質転換溶液に再懸濁します。

再懸濁したパレットを暗所で室温で2時間休ませます。次に、OD600に形質転換溶液を0.5で加えるか、または2つのサンプルを等量のものと組み合わせて、対になったタンパク質相互作用を試験します。1ミリリットルの注射針を使用して、浮遊細胞を4番目から7番目の葉に浸潤します。

この後、すぐに植物を黒いプラスチックカバーで12時間覆います。まず、成功を確実にするためには、植物は非常に健康でなければなりません。次に、浸透プロセス中に葉を傷つけないように注意してください。

トレイを暗闇に12時間置いてください。次に、ルシフェラーゼ活性を検出する前に、通常の条件下で2〜4日間植物を成長させます。イメージング法を開始するには、浸潤した葉を切り離します。

リーフレット全体をMS寒天培地のプレートに置きます。50ミリリットルのスプレーボトルを使用して、ルシフェロンワーキングバッファーを葉の同軸面にスプレーします。その後、クロロフィル自家蛍光を消光するために5分間暗所に置き続けます。

マイナス30°Cに冷却された低光冷却CCD想像装置を使用して、光充填露光時間が50ミリ秒、発光検出時間が1分間の画像を撮影します。この後、N-benthamianaの葉の浸透領域から葉片を切り取ります。破片を100マイクロリットルの脱イオン水に浸し、96ウェルのホワイトプレートのウェルに入れます。

10マイクロリットルのルシフェロン作業緩衝液を追加します。プレートを5分間休ませます。次に、タンパク質相互作用のダイナミクスを研究するために任意の特定の処理を行い、市販のルミノメーターで直接発光を測定します。

ここに示されているのは、COP 1 SPA 1 の相互作用を表すルシフェラス活性のデモンストレーションです。発光によって検出される光明の活動は、CCDカメラによって画像化されます。COP 1 SPA 1の相互作用は、機能的なルシフェラーゼの銅変異をもたらすことが見られます。

次に、ジャスミン8処理下のルシフェラーゼ活性を経時的に決定します。ルシフェラーゼ活性に代表されるCOP1 SPA1の相互作用は、暗闇では徐々に減少することが見られる。ジャスミン8で処理すると、これらの相互作用がさらに減少します。

一度習得すると、この技術は、適切に実行されれば、植物の準備が整った後、1週間で行うことができます。この手順を試みる際には、健康な植物を維持することを覚えておくことが重要です。葉に注意深く浸透し、コントロールを適切に含めます。

開発後、この技術は、シグナルトランザクションの分野の研究者がタンパク質タンパク質の相互作用ダイナミクスを迅速に探求するための道を開きます。このビデオを見た後、タバコ植物を育てる方法、タバコの葉にアグロバクテリアを浸透させる方法、および透明の活動を検出する方法についてよく理解しているはずです。