ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出
2011年9月16日
我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。
2つのタンパク質間の相互作用をテストするには、ゲートウェイロング技術を使用して、目的の2つの遺伝子をBFおよびベクターにクローニングする必要があります。このコンストラクトは、アリウムGV 3 1 0 1に変換されます。構築するために含むGV 3 1 0 1細菌培養物を混合し、葉に共浸透させます。
2つの候補タンパク質が互いに相互作用する場合、YFPシグナルは結果焦点メキシコを使用して観察できます。BFC技術の主な目的は、2つのタンパク質間の相互作用をテストすることです。vavoでは、BFCとISTOの両方のハイブリッドアッセイを実行するための使いやすいツールを研究者に提供する、ゲートウェイ互換のBFCおよびISの2つのハイブリッドベクターのシリーズを作成しました。
このビデオでは、BFCシステムの使いやすさを実演します。タンパク質を試験するためには、タンパク質の相互作用は発現系を超越します。まず、GV 3 1 0 1細菌培養物を準備する必要があります。
あなたはあなたのプレートから単一のコロニーを選び、適切な抗生物質でYEB培地の5つの男性に接種する必要があります。次に、この文化を28度で一晩振る必要があります。速度は毎分200回です。
細菌培養物は翌朝には準備ができているはずです。バクテリアDが過剰に増殖したことを確認してください。培養物をインキュベーターから取り出し、各培養物のオス1個を滅菌済みの1.5オス遠心分離チューブに移します。
遠心分離機チューブをデスクトップ遠心分離機に入れます。バクテリアを室温で1000 Gで10分間スピンダウンし、ネットを廃棄します。次に、浸透培地を1食追加してペネートを観察し、数回ペッティングごとに再評価します。
洗浄手順をさらに2回繰り返します。これは、細菌培地中の抗生物質の痕跡を取り除くのに役立ち、浸透後にアザラシを植えるのに役立つため、重要です。最終洗浄後、レサスは、バンク制御として浸透媒体を使用した分光光度計を使用して、この細菌懸濁液の600を負った0.5オスの浸透媒体測定でパレットを吊り下げます。
OD測定後、浸透媒体を使用してODを調整する必要があります。最終的な OD は 1 から 1.2 の間である必要があります。次のステップに進む前に、すべての細菌懸濁液を準備する必要があります。
あなたの2つの候補タンパク質に対応する細菌懸濁液を等量移し、それらを新しい1.5オスチューブで混合します 陰性細菌混合物は、今や浸潤に関連しています。すべての組み合わせを準備し、ネガティブコントロールを含めることを忘れないでください。あなたは浸透のために5〜6週間のコードと最良のマナーの植物を使用する必要があります。
あなたは成長室から植物を取り出し、嵐の攻撃を開くために侵入する前に1時間We nightに置くことができます。これは、侵入プロセスに役立ちます。約100マイクロリットルのResus懸濁菌を描きます。
針なしで1つのオスのスリップチップシリンジの近くで混合します。シリンジの先端を葉の下側に置きます。膝の上部を指で支えます。
通常、プランジャーを押し下げます。あなたはまだ浸透後のMesoより薄い空気空間を感じるように葉を通して拡散する液体を見ることができるはずですマークペンで浸透した空気を可能にする。さもなければ、2日後に、あなたは浸潤したA.Ifに浸透する必要がある場合、異なる細菌ミックスミックスで、50%エタノールを手袋にスプレーするか、または浸透の間にあなたのG手袋を交換してください。
相互汚染を防ぐために、浸潤の間に1メートルの肋骨のスペースを残すようにしてください。PFA信号は、浸潤から最大5日間、24時間ごとに監視する必要があります。サイズの異なる2つのカバースリーブを使用してサンプルを保持できます。
まず、切り込みカバースリーブにミニウォーターを1滴垂らします。次に、浸潤ゾーン内でナイフティッシュの小片を切断します。サンプル中の吐き気の静脈を避けてください。
カットしたナイフティッシュをスライドの水に入れ、下に置いて、小さな電流スリーブで覆い、静かに押し下げます。これで、サンプルをメキシコスコープで観察できます。ここでは、このNACA T CSS P 2共焦点メキシコを使用して、BIFCシグナルを視覚化します。
レギュラーの香りのメキシコでもお使いいただけます。共焦点は、より良い画像を提供し、弱い信号を検出します。YFP パラメーターを使用して、この NCAs P 2 システムの VFC 信号を検出できます。
ここでこのYFPプリセットをダブルクリックするだけで、自動的に励起がオンになり、発光検出範囲が設定されます。別のシステムを使用している場合は、マニュアルを参照してパラメータを適切に設定してください。このビデオをご覧になった後、unbe MI Transcend発現システムを使用してタンパク質タンパク質相互作用を試験するBFCEを実施できるようになることを願っています。
この手順は、タバコやAY植物にも適用できます。当社のBFCベクターには、それぞれHAタグとflagタグも含まれているため、必要に応じてco IPを実行して相互作用を検証することもできます。
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概要
この研究は、分割された黄色蛍光タンパク質（YFP）アプローチを使用して植物におけるタンパク質-タンパク質相互作用をテストするための新しい技術を提示します。目的の遺伝子とインフレームでYFPフラグメントをクローンすることで、研究者はタンパク質相互作用を示すYFP再構成を観察できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物生物学
- タンパク質相互作用
- 蛍光タンパク質技術
背景
- タンパク質相互作用の理解は生物学的プロセスを解明する上で重要です。
- 従来の方法は植物システムには適していない場合があります。
- 分割YFP技術は相互作用のリアルタイム可視化を可能にします。
- Gatewayクローニングは融合タンパク質の構築を容易にします。
研究の目的
- 植物におけるタンパク質相互作用を研究するための効率的な方法を開発すること。
- 研究者にBFCおよびISTO二分子間ハイブリッドアッセイを行うためのツールを提供すること。
- 植物生物学におけるタンパク質機能の理解を深めること。
使用された方法
- Gateway互換ベクターへのYFPフラグメントのクローニング。
- Agrobacterium GV3101へのコンストラクトの形質転換。
- 植物の葉への細菌培養物の一重浸透。
- 相互作用を確認するための顕微鏡を用いたYFP信号の観察。
主な結果
- YFP信号の成功的な再構成はタンパク質相互作用を示します。
- 植物システムにおけるBFC技術の有効性の実証。
- 研究者向けのユーザーフレンドリーなツールの提供。
- 様々なタンパク質ペアを用いた方法の検証。
結論
- 分割YFP技術は植物におけるタンパク質相互作用を研究するための価値あるツールです。
- この方法は植物生物学のさらなる研究を促進できます。
- 将来の応用には複雑なタンパク質ネットワークの探索が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
