ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出
2011年9月16日
我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。
2つのタンパク質間の相互作用を検証するために、目的の2つの遺伝子をGatewayクローニング法を用いてBFおよびベクターにクローニングする必要があります。これらのコンストラクトをAgrobacterium GV3101に導入します。コンストラクトを保持するGV3101細菌培養液を混合し、葉に共浸潤させます。
2つの候補タンパク質が互いに相互作用している場合、共焦点顕微鏡を用いてYFP信号を観察できます。BFC法の主な目的は、2つのタンパク質間の相互作用を検証することです。vavoでは、研究者がBFCおよび二分子ハイブリッド法（2-hybrid assays）の両方を容易に実施できるツールとして、一連のゲートウェイ互換BFCおよび二分子ハイブリッドベクターを作成しました。
このビデオでは、当社のBFCシステムの使いやすさを実演します。タンパク質およびタンパク質間相互作用を、非標識の発現システムを用いて検証します。まず、GV 3 1 0 1 菌株の培養液を準備してください。
プレートから単一のコロニーをピックアップし、適切な抗生物質を含む5 mLのYEB培地に接種します。次に、これらの培養物を28°Cで一晩振とう培養します。振とう速度は200 rpmに設定してください。
翌朝までには細菌培養が完了しているはずです。細菌が過剰増殖していないことを確認してください。インキュベーターから培養物を出し、各培養物から1 mLを滅菌済みの1.5 mL遠心チューブに分注します。
遠心チューブを卓上遠心機に入れます。室温で 1000 G、10 Minutes 間、細菌を遠心分離し、上清を捨てます。その後、浸潤培地を 1 mL 加えてペレットを洗浄し、数回ピペッティングして再懸濁します。
洗浄ステップをさらに2回繰り返します。これは、細菌培地中の微量の抗生物質を除去するために重要であり、抗生物質が残っていると、インフィルトレーション後に植物細胞が死滅するためです。最後の洗浄後、ペレットを0.5 mLのインフィルトレーション培地で再懸濁させます。インフィルトレーション培地をブランクコントロールとして分光光度計を用いて、この細菌懸濁液のOD600を測定してください。
OD測定後、浸潤培地を用いてOD値を調整します。最終的なOD値は1〜1.2の間にする必要があります。次のステップに進む前に、すべての細菌懸濁液を準備してください。
2つの候補タンパク質に対応する同量の細菌懸濁液を分注し、新しい1.5 mLチューブ内で混合します。この陰性細菌混合液を浸潤に使用します。すべての組み合わせを準備し、陰性対照を含めることを忘れないでください。浸潤には、5〜6週間経過した良好な状態のArabidopsis thalianaの個体を使用してください。
浸潤前に植物を育成室から出し、気孔を開かせるために1時間ほど暗所に置きます。これにより、浸潤プロセスがスムーズになります。懸濁細菌液を約 100 µL 分注します。
針を取り外したオス用スリップチップシリンジを使用して混合します。シリンジの先端を葉の裏側に軽く当てます。指で葉の表面を支えてください。
一般的に、プランジャーを押し下げます。液体が葉の気孔や間隙に拡散していくのが確認できるはずです。浸潤後、浸潤させた領域をマーカーペンで印付けしてください。そうしないと、2日後にどの領域に浸潤させたか特定できなくなります。異なる細菌混合液を浸潤させる必要がある場合は、浸潤の間にグローブに50% ethanolをスプレーするか、グローブを交換してください。
交差汚染を防ぐため、浸透部位の間には1mのリブスペースを空けるようにしてください。浸透後から5日間にわたり、24時間ごとにPFA信号をモニタリングする必要があります。サンプルの固定には、異なるサイズのカバースリーブを2つ使用することができます。
まず、ノッチカバースリーブに微量の水を1滴滴下します。次に、浸潤領域内からナイフ組織の小片を切り出します。サンプル内で嘔気静脈を避けるようにしてください。
切片をスライドガラス上の水に置き、カバーガラスを被せてゆっくりと押し下げます。これで、サンプルを顕微鏡下で観察できます。ここでは、BIFCシグナルを可視化するために、NACA T CSS P two 共焦点顕微鏡を使用します。
通常の共焦点顕微鏡でも使用可能です。共焦点顕微鏡を用いることで、より鮮明な画像が得られ、微弱な信号を検出できます。このNCAs P twoシステムにおけるVFC信号の検出には、YFPパラメータを使用してください。
ここのYFPプリセットをダブルクリックするだけで、自動的に励起光がオンになり、蛍光検出範囲が設定されます。別のシステムを使用している場合は、マニュアルを参照して適切にパラメータを設定してください。このビデオを視聴することで、unbe MI Transcend発現システムを用いたタンパク質間相互作用をテストするためのBFCEを実施できるようになることを願っています。
この手順は、タバコやAY植物にも適用可能です。当社のBFCベクターにはそれぞれHAタグとflagタグが含まれているため、必要に応じて共免疫沈降（co IP）を行い、相互作用を検証することもできます。
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概要
本研究では、分割黄色蛍光タンパク質（YFP）アプローチを用いた、植物におけるタンパク質間相互作用を検証するための新しい手法を提示します。目的遺伝子とインフレームでYFP断片をクローニングすることで、YFPの再構成を観察することができ、これによりタンパク質間の相互作用を判定することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 植物生物学
- タンパク質相互作用
- 蛍光タンパク質技術
背景
- タンパク質相互作用を理解することは、生物学的プロセスの解明において極めて重要です。
- 従来の手法は、植物系には適さない場合があります。
- Split YFP法を用いることで、相互作用をリアルタイムで可視化することが可能です。
- Gatewayクローニングにより、融合タンパク質の構築が容易になります。
研究目的
- 植物におけるタンパク質間相互作用を研究するための効率的な手法を開発すること。
- BFCおよびISTOツーハイブリッドアッセイを実施するためのツールを研究者に提供すること。
- 植物生物学におけるタンパク質の機能への理解を深めること。
使用した手法
- YFP断片のGateway互換ベクターへのクローニング。
- 構築物のアグロバクテリウムGV3101への形質転換。
- 植物の葉への細菌培養液の共浸潤。
- 顕微鏡を用いたYFPシグナルの観察による相互作用の確認。
主な結果
- YFP信号の再構成に成功したことは、タンパク質間相互作用を示している。
- 植物系におけるBFC法の有効性の実証。
- 研究者向けの使いやすいツールの提供。
- さまざまなタンパク質ペアを用いた本手法の検証。
結論
- スプリットYFP法は、植物におけるタンパク質間相互作用を研究するための有用なツールです。
- この手法は、植物生物学のさらなる研究を促進させることができます。
- 今後の応用として、複雑なタンパク質ネットワークの探索などが考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
植物システムにおけるタンパク質間相互作用解析は、農薬およびバイオ医薬品開発におけるターゲットの検証とメカニズムのリスク低減を支援します。Gateway互換のBiFCシステムは、定量的な蛍光読み取りによる再現可能なin vivo相互作用スクリーニングを可能にし、初期段階のターゲット評価における予測信頼性を向上させます。このアプローチは、間接的なアッセイへの依存を減らし、植物生物学とトランスレーショナルリサーチチーム間の機能横断的な連携を促進します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：植物体内でのタンパク質相互作用の可視化を通じて、治療仮説の直接的な検証を可能にする。
- 運用上の価値：Gateway互換プラットフォームを提供し、再シーケンシングを行うことなく標的ペアの迅速なクローニングと試験を実現する。
- 予測的価値：天然に近い細胞環境で相互作用を確認することにより、生物学的なリスク軽減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 化合物またはモジュレーターのダウンストリームスクリーニングに適した標準化された生物学的システムを構築します。
- 定量的出力： YFP蛍光強度は、相互作用の強度および用量反応モデリングの測定可能なリードアウトを提供します。
- スケーラビリティ： Nicotiana benthamiana におけるハイスループットなアグロインフィルトレーションワークフローに対応しています。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：翻訳可能なバイオマーカーを有する植物由来の標的パスウェイの研究を促進します。
- メカニズムの連続性：一貫した相互作用データを通じて、探索的知見と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定：確認済みの相互作用ネットワークに基づいて、標的の優先順位付けを可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
BiFCシステムは初期段階の探索的なフローに組み込まれており、植物ベースの治療薬探索におけるリード化合物の特定に先立つ、仮説検証やアッセイ開発を支援します。
- 探索生物学：直接的な相互作用の検出を通じて、ターゲットの検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物スクリーニングキャンペーンに向けた、再現性のある定量的な相互作用アッセイの調製を可能にします。
- 分析：YFP信号の測定により、相互作用条件や遺伝的摂動を比較するための定量化可能なデータが得られます。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患に関連する植物モデルで相互作用を確認することにより、バイオマーカーの探索と整合させます。
- エンタープライズ再利用：Gateway互換性により、複数のプロジェクトや発現系にわたってベクターを再利用できます。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 生細胞内におけるタンパク質相互作用の直接的な視覚的根拠を提示することで、メカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値： Gatewayクローニングおよびアグロインフィルトレーションプロトコルを通じて、相互作用試験を標準化する。
- 戦略的価値： 創薬の早期段階でターゲットエンゲージメントへの信頼性を高めることにより、Go/No-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの相互作用データに基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の留意点
- 分子クローニング、アグロインフィルトレーション、および蛍光顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- アグロバクテリウム介在型形質転換のインフラおよび、共焦点顕微鏡またはワイドフィールド顕微鏡の使用環境に依存します。
- 一貫したOD調整、インフィルトレーションのタイミング、およびシグナル定量化を行うため、チーム間での標準化が必要です。
- 他の植物種に適応させる場合は、インフィルトレーション条件の最適化およびプロモーターの選択が必要になる場合があります。
- シグナル定量化は、自家蛍光や細胞内局在の影響を受ける可能性があるため、適切なコントロールが必要です。
