ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

2つのタンパク質間の相互作用をテストするには、ゲートウェイロング技術を使用して、目的の2つの遺伝子をBFおよびベクターにクローニングする必要があります。このコンストラクトは、アリウムGV 3 1 0 1に変換されます。構築するために含むGV 3 1 0 1細菌培養物を混合し、葉に共浸透させます。

2つの候補タンパク質が互いに相互作用する場合、YFPシグナルは結果焦点メキシコを使用して観察できます。BFC技術の主な目的は、2つのタンパク質間の相互作用をテストすることです。vavoでは、BFCとISTOの両方のハイブリッドアッセイを実行するための使いやすいツールを研究者に提供する、ゲートウェイ互換のBFCおよびISの2つのハイブリッドベクターのシリーズを作成しました。

このビデオでは、BFCシステムの使いやすさを実演します。タンパク質を試験するためには、タンパク質の相互作用は発現系を超越します。まず、GV 3 1 0 1細菌培養物を準備する必要があります。

あなたはあなたのプレートから単一のコロニーを選び、適切な抗生物質でYEB培地の5つの男性に接種する必要があります。次に、この文化を28度で一晩振る必要があります。速度は毎分200回です。

細菌培養物は翌朝には準備ができているはずです。バクテリアDが過剰に増殖したことを確認してください。培養物をインキュベーターから取り出し、各培養物のオス1個を滅菌済みの1.5オス遠心分離チューブに移します。

遠心分離機チューブをデスクトップ遠心分離機に入れます。バクテリアを室温で1000 Gで10分間スピンダウンし、ネットを廃棄します。次に、浸透培地を1食追加してペネートを観察し、数回ペッティングごとに再評価します。

洗浄手順をさらに2回繰り返します。これは、細菌培地中の抗生物質の痕跡を取り除くのに役立ち、浸透後にアザラシを植えるのに役立つため、重要です。最終洗浄後、レサスは、バンク制御として浸透媒体を使用した分光光度計を使用して、この細菌懸濁液の600を負った0.5オスの浸透媒体測定でパレットを吊り下げます。

OD測定後、浸透媒体を使用してODを調整する必要があります。最終的な OD は 1 から 1.2 の間である必要があります。次のステップに進む前に、すべての細菌懸濁液を準備する必要があります。

あなたの2つの候補タンパク質に対応する細菌懸濁液を等量移し、それらを新しい1.5オスチューブで混合します 陰性細菌混合物は、今や浸潤に関連しています。すべての組み合わせを準備し、ネガティブコントロールを含めることを忘れないでください。あなたは浸透のために5〜6週間のコードと最良のマナーの植物を使用する必要があります。

あなたは成長室から植物を取り出し、嵐の攻撃を開くために侵入する前に1時間We nightに置くことができます。これは、侵入プロセスに役立ちます。約100マイクロリットルのResus懸濁菌を描きます。

針なしで1つのオスのスリップチップシリンジの近くで混合します。シリンジの先端を葉の下側に置きます。膝の上部を指で支えます。

通常、プランジャーを押し下げます。あなたはまだ浸透後のMesoより薄い空気空間を感じるように葉を通して拡散する液体を見ることができるはずですマークペンで浸透した空気を可能にする。さもなければ、2日後に、あなたは浸潤したA.Ifに浸透する必要がある場合、異なる細菌ミックスミックスで、50%エタノールを手袋にスプレーするか、または浸透の間にあなたのG手袋を交換してください。

相互汚染を防ぐために、浸潤の間に1メートルの肋骨のスペースを残すようにしてください。PFA信号は、浸潤から最大5日間、24時間ごとに監視する必要があります。サイズの異なる2つのカバースリーブを使用してサンプルを保持できます。

まず、切り込みカバースリーブにミニウォーターを1滴垂らします。次に、浸潤ゾーン内でナイフティッシュの小片を切断します。サンプル中の吐き気の静脈を避けてください。

カットしたナイフティッシュをスライドの水に入れ、下に置いて、小さな電流スリーブで覆い、静かに押し下げます。これで、サンプルをメキシコスコープで観察できます。ここでは、このNACA T CSS P 2共焦点メキシコを使用して、BIFCシグナルを視覚化します。

レギュラーの香りのメキシコでもお使いいただけます。共焦点は、より良い画像を提供し、弱い信号を検出します。YFP パラメーターを使用して、この NCAs P 2 システムの VFC 信号を検出できます。

ここでこのYFPプリセットをダブルクリックするだけで、自動的に励起がオンになり、発光検出範囲が設定されます。別のシステムを使用している場合は、マニュアルを参照してパラメータを適切に設定してください。このビデオをご覧になった後、unbe MI Transcend発現システムを使用してタンパク質タンパク質相互作用を試験するBFCEを実施できるようになることを願っています。

この手順は、タバコやAY植物にも適用できます。当社のBFCベクターには、それぞれHAタグとflagタグも含まれているため、必要に応じてco IPを実行して相互作用を検証することもできます。