ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

この手順では、2つのシロイヌナズナ転写調節因子(seus spelled SEU)とlu hologまたはLUHとの間のin vivoタンパク質タンパク質相互作用をテストします。生体分子蛍光相補を利用することにより、seusは黄色蛍光タンパク質の末端末端フラグメントに融合するか、YFPとLUHは2つのプラスミドコンストラクトのY-F-P-D-N-AのC末端フラグメントに融合します。スース、NYFP、L-U-H-C-Y-F-Pをタマネギ表皮細胞に照射し、それらの相互作用をテストします。

SeussとLUHの相互作用により、核内のYFPの末端末端フラグメントとC末端フラグメントが関連し、核内でYFP蛍光が発せられます。暗所で16〜20時間インキュベートした後、タマネギの表皮ピーリングを蛍光顕微鏡で観察し、蛍光を可視化します。こんにちは、私はメリーランド大学細胞生物学・分子遺伝学部のZhi Lu博士研究室のコートニー・ホランダーです。

本日は、BioRad Helios gene gun を使用してタマネギ細胞のタンパク質間相互作用を試験する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、植物細胞におけるタンパク質間相互作用とタンパク質の局在化を試験しています。それでは始めましょう。

この手順を開始するには、Helios 遺伝子銃用のカートリッジを準備します。これは、カートリッジの各準備に対するカートリッジ準備手順を詳細に示す Woods と Zeto 2008 による Joe Video Protocol に従っています。50 マイクログラムの総血漿 DNA を 12.5 ミリグラムの金粒子と 1 ミリグラムあたり 0.5 ミリグラムの BIFC 用 PVP 溶液と混合します。同じカートリッジ調製物を組み合わせると、推定相互作用タンパク質Seussの2つの血漿DNAがYFPのN末端半分に融合し、略称seus、NYFPおよびLUホモログがYFPのC末端半分に融合した(略称L-U-H-C-Y-F-P)。

合計量は1回分調製あたり50マイクログラムで、1カートリッジあたり0.25ミリグラムの金あたり1マイクログラムのDNAで最大50個のカートリッジが得られます。各カートリッジは1発分です。カートリッジの準備後、カートリッジをテストして、金粒子が効率的に推進されているかどうかを確認します。

四角いパラフォームをペトリ皿に巻き付けます。次に、ヘリウム圧力を150〜200 PSIに設定し、新しく作成したカートリッジをパラムスクエアに発射します。パルファムにほのかな金の粒子が付着しているのを観察します。

異なる量の金粒子が、異なるヘリウム圧力でパルファムに推進される場合があります。ただし、大きな差がない場合は、砲撃の圧力を低く選択してください。このテストは、各ショットの進行によってカバーされる領域も示します。

タマネギ組織を準備するには、清潔で鋭利なカミソリの刃を使用して、大きな黄色いタマネギから外皮をはがします。2 x 8センチメートルの長方形の領域を切り取り、深さは4〜5層です。長方形のタマネギティッシュを取り出し、外側の2つの層を捨てます。

玉ねぎの残りの層を約1.5センチ四方に切ります。タマネギ片を3mmの濾紙の円が入ったシャーレに入れます。滅菌水で湿らせて、ペトリ皿を覆います。

タマネギのかけらは砲撃の準備ができています。まず、カートリッジを白い丸いカートリッジホルダーにロードします 異なるプラスミドコンストラクトを含むカートリッジを異なるカートリッジホルダーにロードします。各カートリッジホルダーには、12ショットで最大12個のカートリッジを保持できます。

ここには3つの異なるホルダーがロードされています。最初のホルダーには、カリフラワーモザイクウイルス由来の35個のS-G-F-P-A強力で構成的なプロモーターを含むカートリッジがあります。このプラスミドはポジティブコントロールとして機能します。

2つ目のホルダーには、S-E-U-N-Y-F-PとL-U-H-C-Y-F-Pを同量含む実験用カートリッジが装填されています。3 番目のカートリッジホルダーには、パックスパインベクターと LUH パックスパイスの均等なモル混合物を含むカートリッジが装填されています。これはネガティブコントロールとしても機能します。

バッテリーと新しいバレルライナーをヘリオス遺伝子銃に挿入します。バレルライナーとガンの両方にそれぞれのOリングが取り付けられていることを確認してください。次に、空のカートリッジホルダーをジーンガンに挿入し、カートリッジホルダーのマーク番号12をガンの上部に向けています。

カートリッジホルダーを1〜2回進めて、正しく挿入されていることを確認します。次に、銃をヘリウムタンクに取り付け、圧力を150〜200PSに調整します。耳栓を着用し、サイドボタンを押しながら引き金を引くことで数回銃を発射します。空のカートリッジホルダーで銃を発射し、装填すると、銃室がきれいになり、圧力が安定していることが保証されます。

DNAを撮影する前に、ここでタマネギを撃つことは、バックグラウンド蛍光のネガティブコントロールになる可能性があります。DNAコーティングされた金粒子を撮影するには、空のカートリッジホルダーを取り外し、ポジティブコントロールを含む最初にロードされたカートリッジホルダーを挿入します。発射することを目的としたカートリッジがカートリッジホルダーの下部に配置されるように、カートリッジホルダーを進めます。

次に、タマネギの最内側の層を上にして、空のペトリ皿の中央にタマネギのかけらを置きます。遺伝子銃の砲身ライナーをペトリ皿に載せ、銃を発射します。次のカートリッジに進み、別のタマネギ片を撃ちます。

タマネギが4〜5個撃たれるまで、この手順を繰り返します。各タマネギは、撃った後に1回だけ撃ちます。衝撃を受けたタマネギ片を湿った3mm濾紙が入ったシャーレに移し、実験用カートリッジを撃ちます。

カートリッジホールデンに変更します。その2、汚染を防ぐためにバレルライナーを交換することを忘れないでください。ポジティブコントロールのために示されているように、タマネギを4〜5個撃ちます。

その後、カートリッジホールデンに変更します。3つ目は、ネガティブコントロールDNAを含む。そして再び、タマネギを4〜5個撃ちます。

コンタミネーションを防ぐためにバレルライナーを交換してください。砲撃後。タマネギのかけらが入ったシャーレに蓋をします。

乾燥を防ぐためにパラフォームで包んでください。タマネギ片を室温で暗所で16〜48時間インキュベートします。砲撃が完了したら、ヘリウムタンクからジーンガンを取り外す前にガスを止めて圧力を解放し、バレルライナーを緩めてカートリッジホルダーと使用済みのカートリッジを取り外します。

最後に、カートリッジホルダーとバレルライナーを石鹸水を入れたビーカーに浸して清掃し、超音波処理します。20分間。その後、水ですすいで石鹸の残留物をすべて取り除きます。

70%エタノールに1時間浸し、ペーパータオルで乾かします。砲撃後16〜20時間でタマネギ片の観察に進みます。衝撃を受けたタマネギ片を室温で16〜20時間インキュベートした後、端が平らな鉗子を使用して、タマネギの内側の表皮から単一の細胞層をゆっくりと剥がします。

これは、砲撃中に砲に直接面するレイヤーです。はがした層を、カバースリップ付きのスライドカバー上の水滴の上に置きます。ただし、気泡を最小限に抑えるように注意してください。

zes axio observer (ここに示されている点 Z 1) などの蛍光顕微鏡を使用して、顕微鏡の明視野下で GFP または YFP 蛍光を観察します。まず、細胞が生きていることを確認するために、細胞質ストリーミングを確認します。そうする。

スライドを明るい視野光に数分間さらしてタマネギ組織を温め、次に動いているプラスチックを探します 細胞質ストリーミングは必ずしも見やすいとは限らないため、はっきりと見えなくてもがっかりしないでください。蛍光検出には、GFPまたはYFPに適した励起フィルターと検出フィルターを使用してください。また、非蛍光プラスミドで撃たれたタマネギ片であるネガティブコントロールも確認してください。

傷ついた細胞や破片、タマネギからかすかな黄色の信号が現れることがあります。また、ポジティブコントロールを確認してください。恒常的に発現した蛍光レポーターを含有するプラスミド。

GFP蛍光は、すべての細胞ではなく一部の細胞に見られます。気泡は、バックグラウンド蛍光を生じることもあります。タマネギ表皮細胞からの目に見えるGFP信号は、カートリッジ、タマネギ組織、および遺伝子銃の発射が適切に準備され、実行されていることを示しています。

ここに示されているのは、35 SGFP陽性プラスミドから観察された強い蛍光です。強い蛍光は、核と細胞質の両方を含む細胞全体に見られます。明視野画像により、細胞と核の対応する輪郭を見ることができます。

すべてのセルが変換されるわけではありません。実験的な組み合わせSeuss、NYFP、およびL-U-H-C-Y-F-Pをタマネギ細胞に照射すると、タマネギ細胞の核内でYFP蛍光シグナルが検出され、Seuss NYFPとL-U-H-C-Y-F-Pがin vivoで相互作用することを示しています。しかし、この相互作用媒介蛍光は、ポジティブコントロールの35SGFP媒介蛍光よりも有意に弱い。

さらに、SEUSおよびLUH転写因子は核に局在しています。したがって、YFP蛍光は原子核内でのみ観察されます。さらに、蛍光細胞の数は、35 SGFPポジティブコントロールの数よりも大幅に少なくなります。

これは、B FFCが両方のパートナープラスミドが同じタマネギ細胞で発現している場合にのみ機能するためです。タマネギでは蛍光シグナルは検出されず、パックスパイン、ベクター、L-U-H-C-Y-F-Pの混合物を含むカートリッジホルダー番号3を照射し、ネガティブコントロールに期待されるようにします。BioRad Helios遺伝子銃システムを使用して、タマネギ細胞を砲撃し、タンパク質タンパク質の相互作用をテストする方法を紹介しました。

この手順を行うときは、適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用することを忘れず、BIFC蛍光はシグナルが弱く、蛍光細胞の数が少なくなる可能性があることを知っておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。