最適化と利用の

この手順の全体的な目的は、アグロインフィルトレーション法を用いて、植物ベースのシステムで一過性組換えタンパク質を生産するための、簡便かつ効率的でスケールアップ可能な手法を開発することです。これは、まず植物の生育条件を最適化することで達成されます。次のステップとして、植物ウイルスとバイナリープラスミドの構成要素を組み合わせたローンチベクターを用いてアグロバクテリウムを形質転換し、続いてアグロ実験に使用するために形質転換したアグロバクテリウムを培養します。

アグロバクテリア浸潤では、植物を逆さまにし、地上部をアグロバクテリア懸濁液に浸します。次に真空をかけることで、葉組織の細胞間隙から空気が排出されます。真空を解除した後の急速な再加圧により、アグロバクテリア懸濁液が葉の中に注入されます。

最終的に、浸潤させた植物における組換えタンパク質の産生を確認するために、免疫ブロッティングおよび蛍光アッセイを用います。手動浸潤などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、真空浸潤法がワクチンや治療用タンパク質を含む組換えタンパク質の工業的生産に向けてスケールアップ可能であることです。この手法は、植物バイオテクノロジーにおける重要な課題の解決に寄与し、商業的な組換えタンパク質生産のための代替プラットフォームとしての植物の利用をさらに促進するものと考えられます。

土壌で栽培した植物のアグロインフィルトレーションをスケールアップさせることは困難であると分かり、まずこの手法を考案しました。土壌にはウイルス、細菌、線虫などの不純物が含まれていることに加え、土壌の組成や灌漑水はバッチごと、あるいは季節によって異なり、土壌は保存期間とともに劣化するためです。さらに、土壌栽培した植物を反転させると、インフィルトレーション中に土壌がアグロバクテリウム培養液中に不適切に滴り落ちるという問題もありました。

本手順の実演は、植物生物学・工学研究室のシニアリサーチアシスタントであるRebecca Snow、および私の研究室のリサーチアシスタントであるEmma Gut、Robin Lobe、Adam Trevorが行います。本研究では、植物成長の均一性を確保し、土壌を用いた植物栽培に伴う複雑さを排除するため、水耕栽培用植物成長培地および nutrient solution を使用します。

本手順を開始するために、ロックウールスラブを植物肥料溶液に5分間浸し、栄養分を吸収させたロックウール表面に手作業で種子を播種します。本研究では、Cedar 3種のNico Oceana種、すなわち野生種2種のNico OceanaおよびBenham Ana、Nico Oceana Excelsior、そしてBenham、AnaおよびExcelsiorのハイブリッドであるNico Oceana Excelaを用いて評価を行います。種子から得られた植物を、制御された条件下および長日光周期の水耕カスケードシステムで育成します。

Nico Oceana、Bentham Miana、およびNico Oceana Excelaを4～5週間、Nico Oceana Excelsiorを5～6週間育成します。本実験で使用したAgrobacterium tumor Fasion株は、付属の原稿に記載されている通り、適切なローンチベクターを用いて形質転換されています。本デモンストレーションでは、5種類の形質転換アグロバクテリウム株を使用します。

レポーターである緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を保持するGV 3 1 0 1、トマトブッシュスタントウイルスのサイレンシングサプレッサーP 19のウイルス遺伝子を保持するGV 3 1 0 1、および修飾リアーゼまたはlick KMキャリアタンパク質遺伝子を保持するT 10 GV 3 1 0 1のアグロバクテリア株を、50 mg/Lのカナマイシンを添加したLB培地にて、28 °C、200～250 RPMの振盪条件下で一晩培養する。翌日、目的の実験に向けてアグロバクテリア懸濁液を調製する。一過性タンパク質発現における複数種のアグロバクテリア株の使用可能性を検討するため、PBI four lick kmベクターを保持する実験室株1種と野生株2種をmilli Q水で希釈し、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）を0.5に調整する。

浸潤前にアグロバクテリウムの病原性遺伝子を誘導する必要性を調べるため、まずLB培地で培養したP bid 4G FPベクター保持アグロバクテリウム培養液を、4°Cで4,000×g、10分間遠心分離します。次に、600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.5になるようにMMA誘導培地で再懸濁し、室温で2時間攪拌します。アセトシリンゴンが一過性タンパク質発現を増強するかどうかを確認するため、LB培地で一晩培養したPBI 4G FPベクター保持アグロバクテリウム培養液を遠心分離し、1X MS塩、10 mM MES、および2%グルコースを含む浸潤緩衝液で再懸濁します。

細胞懸濁液を4つの容器に分注します。各アグロバクテリウム懸濁液に異なる濃度のaceto coneを添加し、室温で3時間インキュベートします。ウイルスサイレンシングサプレッサーの共浸潤が一過性GFPタンパク質産生に及ぼす影響を試験するため、混合します。

GFP遺伝子を保持するMilli-Q水で希釈したアグロバクテリウム培養液と、ウイルスサイレンシングサプレッサーP19を保持する培養液を4:1の比率で混合します。これから植物の真空浸潤法を実演します。次に、植物を真空浸潤させる際は、真空圧と浸潤時間を制御することが極めて重要です。まず、調製したアグロバクテリウム懸濁液を真空チャンバー内の容器に移します。

次に、希釈したアグロバクテリウム中で植物を逆さまにし、50～400 millibarの真空を30秒または60秒間適用します。最適な浸潤は、通常50～100 millibarで60秒間適用して行われます。真空状態を解除した後、植物を真空チャンバーから取り出し、水で洗浄し、浸潤前の成長に使用したものと同じ成長条件下で5～7日間育成します。

ウェスタン解析用のサンプルを調製するには、まず、浸潤後（DPI）4〜7日のNico Oceana、Benham Miana、Nico Oceana Excelsior、またはNico Oceana Excelaの植物から、葉のサンプルをランダムに採取し、液体窒素中で微粉末になるまで粉砕します。各サンプルに0.5% Triton X 100を含む1×PBSバッファーを3倍量加え、サンプルをエッペンドルフチューブに移します。抽出したサンプルを4°Cで15分間、緩やかに振盪または回転させます。

抽出液を5分間遠心分離し、全可溶性タンパク質を清潔なエッペンドルフチューブに回収します。抽出液を1X PBS抽出バッファーで適切な濃度まで希釈し、5Xサンプルバッファーを最終濃度1Xになるように添加します。SDS-PAGEでタンパク質を分離する前に、サンプルを5分間煮沸します。

タンパク質を不溶性PVDF転写膜に転写した後、ブロッキング溶液で1:5,000に希釈したウサギポリクローナル抗GFP抗血清を用いてGFPを検出します。膜を1X PBST 20で3回洗浄した後、緩やかに揺らしながら室温で1時間インキュベートします。GFP検出のため、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体を1:5,000に希釈して加え、1時間インキュベートします。

その後、ウェスタンブロット処理を行い、タンパク質に対応するバンド強度を付随する原稿に記載の方法で解析します。一過性形質転換植物全体におけるGFP蛍光の視覚的検出は、ハンドヘルド長波長UVランプを用いて行い、デジタルカメラを使用し、露光時間を15秒に設定して、イエロー ES 52 フィルターを通して一過性形質転換植物を撮影します。ウェスタンブロット解析の画像は、ゲノム上のGene Snapソフトウェアを使用して取得します。

精製GFP標準物質に基づく検量線を用いて、遺伝子解析ツールソフトウェアで結果を定量します。植物の成長およびバイオマス蓄積に最適な条件を決定するため、市販の肥料に浸したRockwellスラブ上でNick Oceana Bentham Mianaを栽培しました。4.8%のリンを含む肥料溶液または0%のリンを含む肥料溶液で生育させたこれら6週齢の植物が示すように、NICO Oceana. Benthamの種子の発芽と成長にはリンの存在が不可欠です。

アグロバクテリウムの増殖培地および浸潤培地が植物の健康状態およびタンパク質生産に及ぼす影響を、nicotiana. HamanaにおけるGFP生産量を比較することで検討した。PBI 4G FPを保持するアグロバクテリウム培養物を3種類の異なる培地で増殖させ、植物に真空浸潤させた。YEBまたはLB培地で一晩培養したYEBおよびLB培養物を低速で遠心分離し、MMA誘導培地で再懸濁させたか、あるいはYEB、LB、またはAB培地で一晩培養した後、図のウェスタンブロットの結果に示すようにMilli Q水で1/5または1/10に直接希釈した。YEB、LB、またはAB培地で増殖させMilli Q水で希釈したアグロバクテリウム培養物を浸潤させた植物は、遠心分離後にMMAで再懸濁させた培養物と比較して、平均GFP生産量に有意な差を示さなかった。

したがって、植物への浸潤のためのアグロバクテリウム培養液の希釈にはmilli Q水が推奨されており、その後の実験で600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）を0.5にするために日常的に使用されました。次に、アグロバクテリウム細胞懸濁液の濃度および時間経過が標的発現に及ぼす影響を検討しました。PBI 4G FPを保持するアグロバクテリウムの4種類の異なる細胞懸濁液濃度を評価し、浸潤後（DPI）4日、7日、および10日に葉のサンプルを回収してウェスタンブロット解析に供しました。浸潤後4日目において、異なる細胞懸濁液濃度のアグロバクテリウムを浸潤させた植物間でGFP蛍光に顕著な差が見られました。一方、OD₆₀₀が0.05の場合、浸潤後7日目においてGFPの発現は観察されませんでした。

細胞懸濁液でインフィルトレーションした植物では、蛍光強度は同様であった。A 600が1.0、0.5、0.1の密度では同様であったが、A 600が0.05でインフィルトレーションした植物では、10 DPIにおいて対照的に低かった。一過性タンパク質調製に利用可能なアグロバクテリウム株の多様性を高めるため、4つの異なる細胞懸濁液密度でインフィルトレーションを行ったが、GFP産生量に差は見られなかった。

Nicotiana benthamiana 植物に、ベクター KBI4lickkm を保持する7種類の異なるアグロバクテリア菌株を真空浸潤させた。浸潤させた葉を7 DPIに回収し、キナーゼの発現レベルをウェスタンブロットにより推定した。このグラフに示すように、リアーゼの産生量は GV3110、1A4、および LBA4404 の菌株で、わずかな差はあるものの最高レベルに達した。

発現レベルが最も低かったのはC58C1でしたが、AT77、AT06、およびAT10の各株では中程度のリアーゼ産生が達成されました。リアーゼの酵素活性はXMO Grahamアッセイを用いて実証されました。精製した細菌リアーゼタンパク質を酵素活性のポジティブコントロールとして使用しました。興味深いことに、A4およびAT77の野生型アグロバクテリウム株を接種したNicotiana benthamiana植物では、接種後7日（7 DPI）に、成長阻害、葉柄の伸長と湾曲、および葉の巻き上がりなどの病理学的症状が認められました。

野生型のT 10株を浸潤させたNicotiana benhamの植物では、症状は軽微でした。実験室株であるGV 3 1 0 1を浸潤させたNicotiana benhamの植物では、症状は観察されませんでした。野生種における植物バイオマスの生産性を比較したところ、同一の生育条件下において、Nicotiana excelsaから得られる最大葉バイオマスは、Nicotiana benhamと比較して約2倍高いことが明らかになりました。

アグロバクテリウム菌株GV 3 1 0 1（PBI 4G F-P-G-F-Pを保持）を接種したNico Oceana Benham、Nico Oceana Excelsior、およびNico Oceana ExcelaにおけるBenhamタンパク質の産生を検討した。接種後7日（7 DPI）に、接種した葉全体でGFPの蓄積量を評価した。UV光下でGFP発現を視覚的に確認したところ、Nico Oceana HamanaおよびNico Oceana ExcelaではGFPが均一に分布していたが、Nico Oceana Excelsiorでは葉全体の接種が困難であったため、不均一な分布となった。これらの接種葉における7 DPIでのGFP蓄積のウェスタンブロット解析の結果、GFPレベルはNico Oceana ExcelaおよびNico Oceana ExcelsiorよりもNico Oceana Hamanaで高く、Nico Oceanaにおけるタンパク質産生量は低レベルであった。

不均一な浸潤および採取した葉における蓄積GFPの不均一な分布により、エクセルシオールが生じます。葉に対する真空圧力の影響を検証するため、PBI 4G FPを保持するアグロバクテリウム菌株GV 3 1 0 1を用いて、真空保持時間を30秒または60秒とし、真空圧力を400、200、100、または50 millibarに設定してNico Oceana Benham植物に浸潤させました。真空圧力5、100、および200 millibarを30秒または60秒間適用した際、GFP産生に差は見られず、植物の健全性への悪影響は軽微または認められませんでした。

真空処理時間の標的発現への影響を評価するため、PBI 4G FPを保持するGV 3 1 0 1（A 600 = 0.5）を、Nico Oceana Benham植物の1フラットに1時間ごとに8時間にわたって浸潤させた。この代表的な結果に示されているのと同様のアグロバクテリウム培養液において、GFPの産生レベルは8時間までのすべてのタイムポイントで同等であり、この期間中、アグロバクテリウムが一本鎖DNAを放出する能力を維持していることが示唆された。多くの化学物質や単糖類が、さまざまな植物種において一過性タンパク質産生を促進することが報告されているためである。

本研究では、アセトシリンゴンおよびグルコースの異なる濃度が、アグロバクテリウム株GV 3 1 0 1（PBI 4G FP保持）を接種したNico Oceana Benhamにおける一過性GFPタンパク質発現に及ぼす影響についても評価しました。アグロバクテリウムをYEB培地で一晩培養し、遠心分離後、指定濃度のアセトシリンゴンを含む2%グルコース含有MMA培地、または指定濃度のグルコースを含む200 micromolarアセトフェノン含有MMA培地を用いて、OD600が0.5になるように再懸濁しました。ここに示すように、これらの化合物の試験したどの濃度においても、誘導培地にアセトフェノンまたはグルコースを含まないコントロールと比較して、GFPタンパク質産生に有意な増加は見られませんでした。

次に、Nicotiana benthamianaの葉におけるGFPおよびHAC1遺伝子の一過性発現に対するサイレンシングサプレッサーの共浸潤（co-infiltration）の効果を検討した。浸潤に先立ち、PBI4GFPおよびトマトブッシュステントウジウイルス由来のウイルスサイレンシングサプレッサーP19を保持するアグロバクテリウムGV3101培養液を、それぞれ1:1、2:1、3:1、4:1の比率で混合した。7 DPIにおけるウェスタンブロット解析の結果が示すように、アグロバクテリウム懸濁液のいかなる混合比においても、P19の存在はNicotiana benthamianaにおけるGFP産生を増加または減少させなかった。

さらに、2つのウイルス遺伝子サイレンシングサプレッサーであるP 23およびP 19が、HAC oneの転写後遺伝子サイレンシングの抑制に及ぼす影響を調査しました。ランチベクターPBI four HAC oneを保持するアグロバクテリウムの菌液と、2つのウイルスサイレンシングサプレッサープラスミドのいずれか一方を、それぞれ4:1の比率で混合し、Nicotiana benthamianaに共浸潤させました。浸潤させた葉のサンプルを3〜8 DPIで回収しました。

このグラフは、ウェスタンブロット解析によって決定された3回の実験におけるHAC one発現の平均レベルを示しています。Nico Oceana BenhamをP 23またはP 19と共浸潤させたところ、サイレンシングサプレッサーを使用しなかった場合と比較して、60 piにおいてHAC oneの産生量が増加しました。このことは、P 23およびP 19が本システムにおいて効率的であることを示唆しています。

また、サイレンシングサプレッサーの有無にかかわらず、HAC oneタンパク質の産生レベルは7 DPIから低下し始めることが観察されました。これは、ローンチベクターを浸潤させたNicotiana benthamianaにおける一過性タンパク質産生の低下タイミングが、標的特異的であることを示しています。最後に、アグロバクテリウムセルバンクの安定性を評価するため、同じバッチのアグロバクテリウムセルバンクをNicotiana benthamiana植物に浸潤させてタンパク質蓄積量を評価することを毎年行っています。

これらの代表的な結果は、HA oneタンパク質の生産が3年以上にわたって非常に安定していることを示しています。Nicotiana benam植物における平均的なHAC one生産量は651 ± 49.4 mg/kgです。このビデオを視聴することで、サブユニットワクチンの製造、治療用タンパク質抗体、および診断用抗原に使用可能な、組換えタンパク質の大規模生産のためのアグロインフィルトレーション技術の適用方法について、十分に理解できたはずです。

この手順を行う際は、植物の交配を水耕栽培で管理すること、生存可能なアグロバクテリアを使用すること、真空圧力と時間を制御すること、そしてタンパク質発現のベクターをモニタリングすることが重要です。習得すれば、制御された条件下で適切に実施することにより、アグロろ過法を24時間以内に完了させることができます。