Name: 最適化と利用のアグロバクテリウム媒介一過性タンパク質産生タバコ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: 学ぶアグロバクテリウム媒介一過性タンパク質産生法の最適化と利用。真空浸透法を用いてNicotiana植物でワクチン抗原や治療用タンパク質を効率的に生産するスケーラブルな手法を確立し、植物バイオテクノロジーの応用を促進する。

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この作品は、分子バイオテクノロジー、iBio社と米国防総省の国防高等研究計画庁（助成金＃のHDTRA1-07-C-0054）のためのフラウンホーファーアメリカセンターによってサポートされていました。著者は、博士によって寛大な贈り物を認める。生物科学専攻、パデュー大学（ アグロバクテリウムツメファシエンス株 ）、大規模バイオ株式会社（ 髄膜excelsiana種子 ）のウェイン·フィッツモーリス、ならびに米国ニコチアナ ·コレクションのジェニファー·ニコルソン、ノースカロライナ州立大学（N.エクセルシオール種子のスタントンGelvin ）。著者らは、植物や優れた技術支援を提供するためのマーガレット·シリングフォードとクリストファー船体に感謝します。著者らはまた、博士に感謝します。編集上の支援のためのスティーブン·ストレトフィールドとナターシャKushnir。

1。植物栽培その後のアグロ浸潤のために我々は2つの野生型タバコ種（N.ベンタミアナおよびN.エクセルシオール ）と室内施設でロックウールで水耕栽培ハイブリッド（ 髄膜excelsiana）を評価した。 <ol><li>植物肥料溶液中でロックウールスラブを浸す。 </li><li>野生型Nの種をまくベンサミアナ、N.エクセルシオールとN栄養素に関するexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナのハイブリッド）ロックウールの表面を浸した。 </li><li>のために制御された条件（24℃、40から65パーセントの相対湿度）の下で種子から植物や（130〜150μEmの照明で14時間の明および10時間の暗闇、-2秒-1）、長日光周期を育てるNの4-5週間ベンサミアナとN excelsiana、およびNの5-6週間エクセルシオール。 </li></ol> Agroinfiltratのためのベクターの2。建設イオン<ol><li>インフルエンザウイルス（HAC1）のA/California/04/2009株から合成レポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質[GFP]）、フルレングスの赤血球凝集素（HA）を挿入し、再設計リケナーゼ酵素（LicKM）18を別々にpBID4-GFP、pBID4-HAC1とpBID4-LicKM、それぞれ18,32,41,47を取得するために打ち上げベクトルpBID4 18（TMVに基づいたベクトル）。 </li><li> Aのエレクトロ細胞内にGFPまたはHAC1を運ぶpBID4 10〜50 ngのご紹介Aのエレクトロ細胞へツメファシエンス GV3101株とLicKM ツメファシエンスは、遺伝子MicroPulserのエレクトロとGV3101、C58C1、GLA4404、AT06、AT10、At77とA4菌株。 </li><li>特に断りのない限り、浸透実験のために変換されたアグロバクテリウムを使用してください。 </li></ol> 3。 タバコ植物にアグロバクテリウムの浸潤を掃除<ol><li> A.を育てるLB培地、YEB MED IN（O / N）の株を一晩ツメファシエンスイウムまたはAB培地は、200〜250 rpmで振盪しながら28℃でカナマイシンを50mg / L添加。 </li><li> 4,000倍で又はYEB若しくはLBで増殖させたAB 0.5又は遠心アグロバクテリウム細胞の600nmの光学密度のMilli-Q水（600mL）中の希薄なアグロバクテリウム 4℃で10分間、gは0.5〜600誘導培地（1×MS塩、10mMのMES、200μMのアセトシリンゴン、2％スクロース[MMA]）に再懸濁し、1〜3を室温で撹拌人事、いない限りは、特に記載がない。 </li><li> アグロバクテリウム懸濁液中にタバコ植物の空中組織を浸すと30または60秒間50〜400ミリバールの真空を印加することにより真空チャンバ内の植物を浸潤する。最適な浸潤は、日常的に60秒間50〜100ミリバールで適用される。 </li><li>真空が破壊されると、水中ですすぎ、真空チャンバから植物を取り外し、プレ浸透成長のために使用されるのと同じ成長条件下で5-7日間増殖。 </li><li>有効性をテストするにはアグロバクテリウムのvir遺伝子は、アセトシリンゴンの異なる濃度（0、100、200または400μM）誘導化学物質の浸潤バッファー（1×MS、10mMのMES、2％グルコース）に懸濁アグロバクテリウムに添加した。のvir遺伝子は、グルコースの異なるパーセンテージ（0,1,2、または4％）の誘導に対する単糖の影響を浸潤緩衝液（1×MS、10mMのMES、200μMのアセトシリンゴン）中に懸濁アグロバクテリウムに添加した。N.ステップ3.3および3.4）で上記のようにベンサミ植物を浸透させた。 </li><li> アグロバクテリウムの研究室では、GV3101、C58C1とLBA4404菌株とpBID4-LicKMベクターを有する野生株、A4、AT06、AT10、そしてAt77は0.5の600にミリQ水で希釈した。N.ベンサミ植物は、ステップ3.3および3.4で前述したように、それぞれ特定の株を浸潤させた。 </li></ol>ウイルスサイレンサプレッサのため4。共同アグロインフィルトレーション手順<ol><li> MGFP遺伝子と1:1、2:1,3:1および4:1の比率でトマトブッシースタントウイルス （TBSV）のウイルスサイレンシングサプレッサーP19を運ぶミリQ水で薄めたアグロバクテリウム GV3101培養IX。 N.潜入上記のようにベンサミアナ植物 。 </li><li> N.潜入 2ミリQ水で薄めたアグロバクテリウム GV3101培養の混合物とベンサミアナ植物：pBID4-HAC1のプラスミドを有する第一及びサイレン抑制のいずれかを運ぶ二- TBSVのP19やシトラストリステザウイルスのP23、pCasspプラスミド中の（ pCassp19）と比4:1でそれぞれ35Sプロモーター（PGR-P23）の下でPGRバイナリープラスミド、で。 </li></ol> 5。ウエスタンブロット分析<ol><li> Nからランダム葉のサンプルを収集ベンサミアナ、N.エクセルシオールまたはN excelsianaの 4-7 dpiで植物や微粉末に液体窒素中で粉砕。 </li><li> 0.5％のトリトンを含有する1×PBS緩衝液の3つのボリュームの追​​加X-100を各サンプルに。 </li><li>静かに4℃で15分間抽出したサンプルを振る</li><li> 5分間の抽出物をスピンし、清潔なエッペンドルフチュー​​ブに全可溶性タンパク質を収集します。 </li><li> 1×PBS抽出緩衝液中で適当に希釈した（1:50〜1:100）に抽出物を希釈し、5×試料緩衝液（250mMのトリス-HCl [pHを6.8]、10％SDS、0.5％ブロモフェノールブルー、50％グリセロールを追加最終1×濃度にV / V、および500のDTT）。 </li><li> 5分間沸騰サンプル。 </li><li> 10％SDS-PAGEによってタンパク質を分離するには、イモビロン-Pトランスファーメンブレンに転写し、0.5％I-ブロックにブロックする。 </li><li> 1時間ブロッキング溶液で1:1000に、マウス抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を用いて1:5,000およびHAC1でウサギポリクローナル抗GFP抗血清を用いてGFPを検出する。 </li><li>一次抗体標識後、1×PBST-20で膜を10分間各3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベート（HRP） - 結合1:5000の抗ウサギ抗体またはHRP-コンジュゲートD抗マウス抗体1:10,000でそれぞれGFP及びHAC1検出のための1時間、のため。 </li><li>スーパーシグナルウェスト·ピコ化学発光基質を用いてウエスタンブロットを処理します。 </li><li>タンパク質のバンド強度を分析し、バンドに校正量を得るために、GeneToolsソフトウェアを使用してください。 </li></ol>タンパク質生産：（サンプルの校正済み数量×希釈）/ロードしたサンプルの量）が4 = mg / kgでのX。 式：タンパク質産生（P）、キャリブレーション量（C）、試料の希釈（D）とサンプル装填（S）の量。 6。ザイモグラムアッセイ<ol><li> pBID4-LicKM浸潤Nを集めるベンサミランダム組織サンプル。 </li><li>ウェスタンブロット分析のために上述したのと同じ方法を用いてタンパク質を抽出した後、0.1％リケナンで10％SDS-PAGEによって分析し、ゲルに含まれる。 </li><li>電気泳動後、100mMのトリス-HCl [pH8.0の]及び0.1％トリトンX（洗浄緩衝液中で10分間ずつ2回ゲルを洗浄-100）、次いで1時間65℃で洗浄緩衝液中でインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、洗浄緩衝液を廃棄し、室温で5分間、0.5％コンゴーレッドでゲルを染色する。 </li><li>ミリQ水にゲルを10分間ずつ3回すすぎ、そしてリケナーゼ活動を可視化するために1MのNaClを追加します。精製された細菌リケナーゼ蛋白質は、酵素活性の陽性対照として使用した。 </li></ol> 7。のGFPイメージング<ol><li>ハンドヘルド長波長UVランプを用いて全体の一過性形質転換植物におけるGFP蛍光の視覚的検出を行う。 </li><li>写真は一過性黄8を介してデジタルカメラで植物を形質転換し、52フィルタ（露光時間、15秒）ES。 </li><li>ウエスタンブロットの画像を取得するGeneGnomeにGeneSnapソフトウェアを用いて解析し、精製したGFP規格に基づいて検量線と、GeneToolsソフトウエアを使用して結果を定量化する。 </li><li> purifiに基づく検量線を使用して、HAC1タンパク質を定量するインフルエンザウイルスのA/Indonesia/05/05株由来HACタンパク質標準エド。 </li><li> 3から4の平均値を計算するには、すべての実験のために複製されます。 </li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

本研究では、発射ベクターを有するアグロバクテリウム株を使用して、選択Nicotiana種におけるルーチン一過性タンパク質生産のための単純なアグロインフィルトレーションプロトコルを開発した。加えて、我々は、一過植物発現系で最も高い組換えタンパク質生産レベルを達成するための最適な条件を同定した。 希釈されたAの真空浸透はNに打ち上げベクトルpBID4を保有する菌株GV3101 ツメファシエンスベンサミアナ、N. excelsianaおよびN.木毛は、例えば、アルファルファモザイクウイルスを宿すGV3101で浸潤エンドウなどの他の植物種と比較して7解像度内の標的タンパク質産生のより高いレベルをもたらした-又はキュウリモザイク 35Sプロモーター下にGFPレポーター遺伝子を発現するウイルスベースのベクター41、またはレタス 、 ナスlycoAのC58C1株で浸潤persicumとシロイヌナズナベータ-グルクロニダーゼレポーター遺伝子57。N.を担持ツメファシエンスベンサミアナとN excelsiana 90〜95％の浸透効率で、30〜60秒間、50ミリバールで潜入真空に容易であった。葉面積の残りの5から10パーセントがあるため、真空の適用中にアグロバクテリウム懸濁液の表面上の葉のいくつかの浮遊浸透していなかった。発射ベクターは細胞間移行能力18を有しているため、一過性タンパク質の蓄積は、全体の葉並びに7 dpiで葉柄で起こる。 pBID4発現ベクターが細胞から細胞へ移動可能であるが、全身18は移動しないので、10 dpiで、推定されたGFP産生がわずかに低かった;従って、新たに成長した葉がベクターを含まないターゲットの生産に寄与しない。加えて、組換えタンパク質の分解以上の時間mAY 10 dpiで還元されたタンパク質レベルに貢献しています。我々の結果は、Aと浸潤を示したN.における一過性タンパク質生産のツメファシエンス株 GV3101媒介高レベルベンサミ 。さらに、標的タンパク質は、リケナーゼするN-末端、C末端または内部融合物（LicKM）、β-1 ,3-1、4 -グルカナーゼ、 クロストリジウム·サーモセラム由来の熱安定性酵素であり、多くの標的に耐熱性を付与するように操作することができるタンパク質融合18。 Nの浸潤Aとベンサミ目的の遺伝子を保有するツメファシエンス野生株（AT6、AT10とat77）は、軽度または重度の症状を誘発：葉のカーリング、葉柄の伸長、およびカーリング。病理学的症状は、Nは観察されなかったいくつかの遺伝子がpBID4に挿入し、研究室に変身しながら、空のpBID4ベクターを有する実験室株のGV3101で浸潤ベンサミが GV3101を株C58C1またはLBA4404は、軽度の壊死性応答と葉を誘発クロロシス/葉の浸潤地域で症状を黄変。ナス科の植物で、野生型アグロバクテリウムや武装解除の株によって引き起こされる壊死性の症状は、以前に56,57に報告されている。壊死性応答は、III型分泌系、IV型分泌系によって植物細胞に移し、細菌タンパク質、および/ ​​またはフラジェリン58-60に対する感受性の病原性因子に起因する可能性がある。我々は、異種タンパク質の一過性産生はまた、病原性を誘発することができ、浸潤植物における過敏感反応が出ることを見出した。多くの研究者が、過渡タンパク質産生の5〜20倍高いレベルまで産植物バイナリーベクターを有する異なる植物種のアグロ浸潤は、安定に形質転換された植物28,57と比較したことを報告した。我々のデータは、N.ことを示しているpBID4-GFPを保有するGV3101で浸潤ベンタミアナは一過に対して報告GFP収量に似て、GFPの高いレベルで発現し（全可溶性タンパク質の80％まで）PICH-GFPSYSウイルスベクターを有するアグロバクテリウム 44を浸透させたN.benthamiana。我々の発射ベクターを用いてアグロインフィルトレーション、熱安定性蛋白質LicKMの高い生産をもたらし、標準的なバイナリープラスミド18を用いて観察されるよりも高い50倍。 Aの感染性をテストするにはツメファシエンス及び発射ベクトルの安定性は、我々はNの1フラットに潜入ベンサミ pBID4-GFPプラスミドを保有するGV3101同じミリQ水で薄めたカルチャを使用して、最大8時間の1時間ごと。我々のデータは、GV3101株を効率的に少なくとも8時間、感染性れ、pBID4（発射ベクター）は8時間にわたる浸潤の間に非常に安定である。ことを示した -80℃で保存発射ベクターpBID4-HAC1（細胞バンク）を宿すGV3101株のグリセロールストックを、過渡proteを変更せずに三年間非常に安定であることが示されている浸透させ、植物の生産において。 最適な条件下で増殖させたN.benthamiana植物と35〜42日後に播種は、真空浸透媒介一過性遺伝子発現40のための最適であった。 （3-4週齢）の若い植物は、真空を適用するための機械的な影響から細胞懸濁液表面および組織損傷に浮かぶ葉完全に浸透させることができない。 45日以上経過した植物では、N.ベンサミアナタバコを用いる最適な光条件の下で、ステージをボルト締め、一過性の発現のレベルは低い。 低分子フェノール化合物（アセトシリンゴン）およびmonosaccharaides（グルコース）55,61はA. ツメファシエンスにvir遺伝子を誘導することが知られている。 N.はまた、浸潤50〜600μMの濃度のシリンゴンの存在下で、バイナリーベクターpCAMBIA（GFP）とベンサミわずかに一過性に増加させることが示された遺伝子発現40。私たちは、3時間のMMAでpBID4-GFPを保有するGV3101培養物にこれらの化合物を添加することにより、我々のシステムにおけるシリンゴンとグルコースの異なる濃度の効果を研究し、GFPの発現に差は認められなかった。興味深いことに、GV3101培養pBID4-GFPを保有し、0.5の600にミリQ水で希釈し、VIR遺伝子誘導なしに浸潤し、誘導された培養液を浸透させたものとGFPの同じ量を表明した。 A.ツメファシエンスのvirの遺伝子は、潜在的に植物フェノール化合物（アセトシリンゴンおよびシナピン酸）および葉組織中に存在する植物monosaccharaides（グルコース及びフルクトース）によって誘導することができる。したがって、我々は、外因性のvir遺伝子誘導物質の存在下または非存在下でGFP発現の同様のレベルは、植物細胞におけるGFP発現発射ベクターの複製の間に存在し、細胞質のvir遺伝子誘導物質の作用の結果であり得ると推測している。 N.ベンタミアナは、過渡タンパク質産49のモデルを宿主として使用されてきた。しかしながら、N.ベンタミアナの比較的低いバイオマス収量は、組換えタンパク質の大規模生産への応用を妨げる。最適なホストは、一過性の高レベルの発現を組み合わせ、温室内の容易な成長、およびアグロバクテリウム浸潤2の影響を受けやすくする必要があります。代替ホストを選択するために、我々は2 タバコ（N.ベンサミアナ及びN.エクセルシオール ）の異なる野生型種とハイブリッドNを浸透させAとexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナ ） pBID4-GFPプラスミドを保有する菌株GV3101 ツメファシエンス 。これら三つの種の中でも、GFP発現のレベルは、N.でわずかに高かったベンサミアナ。N.エクセルシオール植物は、それらの革のリーフに真空アグロインフィルトレーションの難しさを示し、N. excelsianaほぼ同一の増殖条件下よりバイオマスを2倍生じた。 7 dpiでGFPの一過性の生産は、Nに比較的似ていますベンサミアナとN excelsiana。したがって、N. excelsianaは、組換えタンパク質生産のためのより適切な宿主であり得る。 アグロバクテリウム媒介性一過性のタンパク質産生は、植物ウイルス由来の62遺伝子サイレンシングサプレッサーの共発現によって克服することができるPTGS 26によって制限される。一過性のタンパク質産生は、以前に浸潤組織34でPTGSを抑制するTBSVのp19のタンパク質の存在下で50倍に増強することが示されている。私たちの研究では、別々に打ち上げベクトルpBID4-HAC1との共浸潤し2つのウイルスサイレンサプレッサー（p19およびP23）の効果を評価した。これらのサイレンシング抑制因子の共同浸潤はHAC1のわずかな増加と、HAC1の一過性の発現にはほとんど影響を持っているように見えた共同浸潤P23やP19の存在下でのタンパク質の蓄積（15〜25％）。正にタンパク質産生に影響を与えるために、サイレンシングサプレッサーを特異的に標的植物種およびウイルスベクター63に有効であるように選択される必要があり得る。 TMVヘリカーゼは、RNAサイレンシング活性64,65の抑制因子を持っています。 pBID4-HAC1とP23やP19の共同浸潤がGFP無しの増加や一過性のHAC1タンパク質産生のわずかな増加をもたらしたように我々のデータは、この観察を確認する。 結論として、我々は、修飾された、最適化された植物およびアグロバクテリウム増殖条件および真空浸透の効率が改善されている。この技術は、数時間で植物材料のキロ数百人を成長させ、浸透させることができました。我々は成功し、現在の適正製造基準（cGMP）の条件の下で、工業規模での高スループットのワクチン生産のための植物の一過性発現技術を自動化しました。 ABO詳細についてut個の自動化およびcGMP条件下でのサブユニットワクチン候補を含む組換えタンパク質の生産のためのプラント過渡タンパク質産生システムの利用は、読者がウェブサイトと呼ばれる<a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> 。

植物は現在、異種組換え生物医薬品を製造するための、安全で信頼性が高く、拡張性の高い、安価なプラットフォームとして認識され、工業用タンパク質1-3及び微生物や動物細胞発現系4を介して重要な利点を持っている。植物は、組み立てられた多量体抗体5-7を含む翻訳後修飾、と正しく折り畳まれたタンパク質を発現することができる。いくつかの植物由来の組換え医薬タンパク質は、臨床評価8を受けている。これらは、非ホジキンリンパ腫9、赤血球凝集素ベースのパンデミックと季節性インフルエンザワクチン候補10,11（カミングスら、Vaccineに提出）、抗連鎖球菌表面抗原Iの治療のための患者特異的組換えイディオタイプワクチン（scFv）を含む糖尿病の治療のために13虫歯12、およびヒトインスリンの治療のために/ II抗体。さらに、ヒトRECOゴーシェ病患者の酵素補充療法のためのmbinantグルコセレブロシダーゼは、イスラエルと米国で承認され、米国の14,15の外に拡大アクセスプログラムの下で提供されています。 異種タンパク質は、安定的に形質転換（トランスジェニックまたはtransplastomic）または一過性に形質転換植物で生産することができる。一過性のタンパク質産生、発現および蓄積16を達成するために、短い時間枠を含む、トランスジェニック植物において産生に比べていくつかの利点を提供し、植物組織4内細菌バイナリーベクターまたは組換え植物ウイルスベクターを導入することによって達成することができる。最も先進的な一過性発現系は、植物ウイルスおよびバイナリプラスミドの成分を組み合わせ、アグロインフィルト17,18によって送達される「発射ベクター」の使用に基づいている。 タバコモザイクウイルス （TMV）に基づいて、発射ベクターのアグロ浸潤が正常に研究室で適用されている例えば、ヒトパピローマウイルス19、 ペスト菌 20などの病原体に対するワクチン抗原を産生するように拡張、インフルエンザは21,22、 炭疽菌 23をウイルス、およびNに天然痘ウイルス24 ベンタミアナの葉。 アグロバクテリウムによる一過性発現は、複数のタンパク質2,25-27の同時生産のための有望な方法である。例えば、植物一過性発現系は、腫瘍特異的な組換え抗体28,29、上皮細胞増殖因子受容体30に対するグリコシル化組換え抗体、および炭疽菌防御抗原31,32に特異的なモノクローナル抗体を産生するために使用されてきた。標的遺伝子および強化標的タンパク質発現33,34における遺伝子サイレンシングのサプレッサー結果とベンサミアナタバコ植物の同時浸潤。 アグロ浸潤が均一introduするための一般的な方法です。植物組織35〜37に目的の遺伝子を保有するcing細菌。無傷の植物における一過性の遺伝子発現のための葉のアグロバクテリウム減圧浸潤は、トランスジェニック植物38-41を生成する必要なく、外来タンパク質の産生のために、迅速なスケーラブル、かつ有用な方法である。真空アグロ浸潤の間に、植物が逆さまに反転され、地上部は、 アグロバクテリウム懸濁液中に沈め。その後、真空をガスが気孔を通して葉細胞間隙から避難させる適用されます。葉へのアグロバクテリウム懸濁液の注入の真空結果の迅速な再加圧以下のリリース。 アグロバクテリウムの減圧浸潤に続いて、植物はさらに栽培されており、ターゲット式が監視されている。ターゲット発現の最高レベルは、通常、2〜3日は、バイナリーベクターと発射ベクターと4-7解像度と浸潤（DPI）、後の発現量、通常decreaを投稿観測されるゲ17,18,42-45。 アグロバクテリウム·ツメファシエンスは、タンパク質産生のために植物に目的の遺伝子を送達するための最も広く使用されている車両である。アグロ浸潤はNに非常によく動作しますベンサミ比較的貧弱シロイヌナズナ 46を含む他のほとんどの植物にある。 本研究では、5〜6週齢のN.過渡タンパク質生産のための、単純、効率的、かつ経済的な方法を開発A.を用いてベンサミアナ浸潤ツメファシエンス 。 （N-モルホリノ） -アグロインフィルトレーション法の工業的スケールの主な欠点は、採取し、細菌および4&#39;-ヒドロキシ-3 &#39;、5&#39;-ジメトキシアセトフェノン（アセトシリンゴン）、単糖類、および2を含む培地で細菌ペレットの再懸濁、遠心分離である-エタンスルホン酸（MES）vir遺伝子の誘導のためのバッファ。我々は、 アグロバクテリウムを最適化することによりこれらの問題を克服することができた</em&gt;のAB培地（最小培地）での増殖を直接のMilli-Q水に浸潤時間と条件を制御することによって希釈した。また、野生型タバコ宿主種のN.中の標的タンパク質の産生を比較しました。 ベンサミアナとNエクセルシオールだけでなく、ハイブリッドNにexcelsiana。

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td><td>PI 555478 TW16</td><td>Infiltration</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsior</td><td>Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td><td>PI 555685 TW47</td><td>Infiltration</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>ウェイン・フィッツモーリス博士、ラージスケール・バイオロジー・コーポレーション、カリフォルニア州バカビル</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>浸透</td></tr><tr><td>真空スキッド</td><td>アッバス、マサチューセッツ州アッシュランド</td><td>カスタムメイド</td><td>の植物浸潤</td></tr><tr><td>ロックウール</td><td>・グローダン社、オンタリオ州、カナダ</td><td>AO 50/40</td><td>成長植物用水耕培地</td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ) エタンスルホン酸</td><td>アクロス・オーガニックス、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ニュージャージー州</td><td>172595000</td><td>バッファ</td></tr><tr><td>ムラシゲ &Skoog salt (MS salt)</td><td>Phyto Technology Lab</td><td>M524</td><td>Tissue culture culture media</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Agrobacterium induction</td></tr><tr><td>Immobilon-P transfer membrane</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>I-block</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗GFP抗血清&nbsp;</td><td>ワシントンバイオテクノロジー、ボルチモア、メリーランド州</td><td></td><td>ウエスタンブロッティング</td></tr><tr><td>マウス抗&ndash;ポリヒスチジンモノクローナル抗体</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit anti-liged, anti-rabbit anti-body&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg;West Pico 化学発光基質</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td><td>P-LICHN</td><td>Lichenase Activity</td></tr><tr><td>Congo Red&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>ゲル染色</td></tr><tr><td>デジタルカメラ&nbsp;</td><td>オリンパス、センターバレー、ペンシルバニア</td><td>州C-8080</td><td>化学発光イメージング</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene、フレデリック、MD</td><td></td><td>化学発光イメージング&nbsp;</td></tr><tr><td>GFPスタンダード&nbsp;</td><td>自社</td><td></td>製<td>化学発光イメージング&nbsp;</td></tr><tr><td>植物肥料溶液</td><td>グリフィン温室保育園用品、ニューアーク、DE</td><td>67-23-20</td><td>植物成長</td></tr><tr><td>苔癬標準</td><td>精製 家</td><td></td><td>で精製 西部ブロッティング</td></tr><tr><td>MicroPulserエレクトロポ</td><td>レーターBioRad、ヘラクレス、CA</td><td>165-2100</td><td>アグロバクテリウム変換&nbsp;</td></tr></tbody></table>

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

植物におけるアグロバクテリウム媒介性一過性タンパク質産生は、短時間のうちに、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を産生するための有望なアプローチである。しかし、この技術は単にスケールアップするために多くの技術的障害が克服されている現在の大規模生産に適用され始めている。ここでは、発射ベクターを有するアグロバクテリウムを有するタバコ植物の真空浸潤に基づいて、工業規模の一過性タンパク質生産のための単純かつ再現性のある方法を示す。 AB培地中のアグロバクテリウム培養の最適化は、浸透プロセスを簡素化、ミリQ水中の細菌培養物の直接希釈を可能にする。 ニコチアナ、Nの3試験を種間でexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナ ） が原因浸透のしやすさに最も有望なホストとして選ば ​​れた、高レポータータンパク質の産生のレベル、および約2-F制御された環境条件の下で、古い高バイオマス生産。例えば、アセトシリンゴン及び単糖等の化学薬品を使用してpBID4-GFP（ タバコモザイクウイルス系）を保有するアグロバクテリウムの誘導は、タンパク質産生レベルに影響を及ぼさなかった。 30または60秒間の50〜100ミリバール下浸潤植物は、植物の葉組織の約95％の浸潤をもたらした。 アグロバクテリウム実験室株のGV3101との浸潤はアグロバクテリアの実験室株LBA4404とC58C1と野生型アグロバクテリアは at77とA4、AT10、AT6菌株に比べて最も高いタンパク質産生を示した。 NにウイルスRNAサイレンシングサプレッサー、P23やP19の共発現、 ベンサミアナタバコは、標的タンパク質（インフルエンザウイルス血球凝集素）の以前の蓄積および増産（15〜25％）が得られた。

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告...

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

アグロインフィルトレーションおよびPVXのアグロパネシスは、植物の遺伝子の一過性異所性発現に関する日常的な機能アッセイです。これらの方法は、エフェトロミクス戦略(迅速抵抗性およびアビルール遺伝子発見)における効率的なアッセイであり、分子植物病理における現代研究にとって極めて重要である。プラントでの堅牢な高スループット機能分析の需要に対応します。...

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

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タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd...

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

挑戦している宿主細胞に細菌によって分泌されるエフェクターを監視する蛍光タンパク質ベースのアプローチ。これは蛍光タンパク質とタイプ III の分泌システムとの互換性がないのためにです。ここでは、最適化された分割 superfolder GFP...

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

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一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

ここでは、エシェリヒア大腸菌またはニコチアナ・ベンタミアナにおける生合成酵素の組み合わせ発現を通じて、ジテルペノイド代謝物を製造および精製するためのプロトコルを簡単に提示し、クロマトグラフィー製品を提供します。浄化。得られた代謝産物は、分子構造特性解析、酵素機能研究、生理活性アッセイを含む様々な研究に適しています。...

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用を検出するためのイメージング技術です。ここでは、ヒストン修飾酵素と、植物組織における遺伝子発現のエピジェネティックな調節のためにそれらを標的プロモーターに動員する転写因子との関連を研究するためのFRETプロトコルが提示されています。...

蛍光共鳴エネルギー移動による 生体内 におけるヒストン修飾酵素と転写因子の相互作用の解明

学ぶアグロバクテリウム媒介一過性タンパク質産生法の最適化と利用。真空浸透法を用いてNicotiana植物でワクチン抗原や治療用タンパク質を効率的に生産するスケーラブルな手法を確立し、植物バイオテクノロジーの応用を促進する。

最適化と利用の

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