最適化と利用のアグロバクテリウム媒介一過性タンパク質産生タバコ

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。

この手順の全体的な目標は、アグロ浸潤技術を使用して、植物ベースのシステムで一過性組換えタンパク質を生産するためのシンプルで効率的かつスケーラブルな方法を開発することです。これは、まず植物の成長条件を最適化することによって達成されます。第2のステップは、植物ウイルスの成分とバイナリプラスミドを組み合わせたローンチベクターでアグロバクテリウムを形質転換し、続いて形質転換したアグロバクテリウムを培養してアグロ実験に使用することです。

アグロバクテリウムの浸潤中、植物は逆さまにされ、空中部分はアグロバクテリウム懸濁液に沈められます。次に、真空が適用され、葉組織の細胞間空間から空気が排出されます。St Rapidにより、真空の放出後の再加圧により、アグロバクテリウム懸濁液が葉に注入されます。

最終的に、イムノブロッティングおよび蛍光アッセイを使用して、浸潤した植物における組換えタンパク質産生を示します。手動浸潤のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、ワクチンや治療用タンパク質などの組換えタンパク質の工業生産のために真空浸潤法をスケールアップできることです。この方法は、植物バイオテクノロジーにおける重要な質問に答えるのに役立ち、商業的な組換えタンパク質生産の代替プラットフォームとしての植物の使用をさらに促進します。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、土壌を育てる植物での農業ろ過のスケールアップが難しいことを知ったときでした。いくつかの理由から、土壌にはウイルス、バクテリア、線虫などのウチンが含まれており、さらに、土壌含有量と灌漑水はバッチごと、季節ごとに異なり、土壌の卵は時間の経過とともに貯蔵されます。さらに、土壌を成長させる植物を反転させると、浸潤中にアグロバクテリウム培養物に土壌が望ましくない滴下が生じます。

この手順を実演するのは、植物生物学および工学研究所の上級研究助手であるレベッカ・スノウとエマ・ガット・ロビン・ローブです。彼女と彼女、そして私の研究室の研究助手であるアダム・トレバー。この研究では、水耕栽培植物成長培地と栄養溶液を使用して、植物の成長の均一性を確保し、植物栽培に土壌を使用することに関連する複雑さを排除します。

この手順を開始するには、ロックウールスラブを植物肥料溶液に5分間浸し、栄養分に浸したロックウールの表面に手動で種を蒔きます。この研究では、杉を使用して、ニコオセアナ、ベンハムアナ、ニコオセアナエクセルシオールの2つの野生型種と、ベンハム、アナ、エクセルシオールの雑種であるニコオセアナという名前のニコオセアナの3種を評価します。エクセラは、制御された条件下で種子から植物を育て、水耕カスケードシステムでの長い一日の写真撮影期間が成長します。

ニコ・オセアナ、ベンサム・ミアナ、ニコ・オセアナ・エクセラは4〜5週間、ニコ・オセアナ・エクセルシオールは5〜6週間です。この実験で使用されたAgrobacterium腫瘍Fasion株は、添付の原稿に記載されているように、適切な発射ベクターで形質転換されています。このデモンストレーションでは、5つの形質転換アグロバクテリウム株を使用します。

GV3 1 0 1、レポーター緑色蛍光タンパク質、またはGFP遺伝子GV3 1 0 1、またはトマトふさふさスタントウイルスのサイレンシングサプレッサーのウイルス遺伝子P19とAの4つのGV3 1 0 1、およびT10を運ぶ。キャリアタンパク質修飾リアーゼまたは舐めKMの遺伝子を運ぶと、LB培地で一晩中アグロバクテリウム株を育て、翌日に200〜250RPMで振とうと摂氏28度で缶マイシンのリットルあたり50ミリグラムを補充します。一過性タンパク質生産のために複数のアグロバクテリウム株を使用することの実現可能性を調べるために、所望の実験のためのアグロバクテリウム懸濁液を準備し、実験室株と2つの野生型株を希釈し、PBI 4 lick kmベクトルをミリQ水中に0.5の光学密度600ナノメートルで

浸潤前にアグロバクテリウム病原性遺伝子を誘導する必要性を調査するために、まず、LB培地で4,000倍Gで成長したPビッド4G FPベクターを担ぐアグロバクテリウム培養物を4°Cで10分間摂氏4度で遠心分離します。次に、MMA誘導媒体で600ナノメートルの0.5の光学密度に再懸濁し、室温で2時間攪拌して、アセチルコーンが一過性タンパク質産生、遠心分離機、およびアグロバクテリウム培養を強化するかどうかをテストします。LB培地で一晩成長させたPBI 4G FPベクターを運び、1つのX ms塩10ミリモル、MES、および2%グルコースを含む浸潤バッファーに再懸濁します。

細胞懸濁液を4つの容器に分割します。各アグロバクテリウム懸濁液に異なる濃度のアセトコーンを加え、室温で3時間インキュベートします。ウイルスサイレンシングサプレッサーの共浸潤が一過性GFPタンパク質産生ミックスに及ぼす影響をテストすること。

GFP遺伝子を担ぐアグロバクテリウムを希釈したミリQ水とウイルスサイレンシングサプレッサーP19を4対1の比率で担持した培養物を、植物の真空浸透中に実証する。次に、真空圧を制御し、植物に真空浸潤するための浸透時間を制御することが重要です。まず、調製したアグロバクテリウム懸濁液を真空チャンバー内の容器に移します。

次に、希釈したアグロバクテリウムで植物を逆さまにし、50〜400ミリバールの真空を30〜60秒間適用します。最適な浸潤は、50〜100ミリバールで60秒間定期的に適用されます。真空が壊れたら、真空チャンバーから植物を取り出し、水ですすぎ、ろ過前の成長に使用したのと同じ成長条件下で5〜7日間成長します。

ウェスタン分析用のサンプルを準備するには、まず、浸潤後4〜7日でNico Oceana、Benham Miana、Nico Oceana Excelsior、またはNico Oceana Excela植物からランダムな葉のサンプルを収集するか、DPIで葉のサンプルを液体窒素で微粉末に粉砕します。0.5%Triton X 100を含む1つのXPBSバッファーを各サンプルに3容量加え、サンプルをeinorチューブに移します。抽出したサンプルを摂氏4度で15分間静かに振るまたは回転させます。

抽出物を5分間遠心し、全可溶性タンパク質を清潔なアイノールチューブに集めます。抽出物を1つのXPBS抽出バッファーで適切な希釈度に希釈し、5つのxサンプルバッファーを最終的な1つのX濃度に加えます。サンプルを5分間煮沸してから、SDSページでタンパク質を分離します。

タンパク質が不動のP転写膜に移された後、ブロッキング溶液中で1〜5,000の希釈でウサギポリクローナル抗GFP抗血清を使用してGFPを検出します。1つのX-P-B-S-T 20でメンブレンを3回洗浄した後、穏やかに揺さぶって室温で1時間インキュベートします。セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ラビッド抗体とインキュベートし、GFP検出のために1時間1〜5, 000の希釈液を加えます。

続いて、ウェスタンブロットをプロセッシングし、添付の原稿に記載されているように、タンパク質に対応するバンド強度を分析します。一過性に形質転換した植物全体のGFP蛍光の視覚的検出は、ハンドヘルド長波長UVランプを使用して達成され、デジタルカメラと15秒の露光時間を使用して、黄色の8 ES 52フィルターを介して一過性に形質転換された植物を撮影します。ゲノム上の遺伝子スナップソフトウェアを使用して、ウェスタンブロット解析から画像を取得します。

精製されたGFP標準に基づく検量線で遺伝子ツールソフトウェアを使用して結果を定量化し、市販の肥料に浸したロックウェルスラブでNick Oceana Bentham Mianaを栽培し、植物の成長とバイオマス蓄積の最適な条件を決定しました。リンの存在は、NICOオセアナの発芽と成長を達成するために重要です。ベンサムの種子は、4.8%リンを含む肥料溶液または0%リンを含む肥料溶液のいずれかで成長するこれらの6週間齢の植物によって示されます。

アグロバクテリウムの増殖と浸潤培地が植物の健康とタンパク質産生に及ぼす影響を、ニコチアナのGFP産生を比較することにより調べました。浜名植物は、3つの異なる培地で増殖したアグロバクテリウム培養物を含むPBI 4G FPを真空浸透させました。YEB ABおよびLB培地で一晩成長させたYEB ABおよびLB培養物を低速で遠心分離し、MMA誘導培地に再懸濁したか、またはYEB LBまたはAB培地で一晩増殖させ、Milli Q水で直接1〜5または1〜10に希釈したところ、YEB LBまたはAB培地で増殖し、Milli Qで希釈したアグロバクテリウム培養物を浸潤させた植物は、Milli Q水で有意差を示さなかった。MMAで遠心分離し、再懸濁した培養物からの平均GFP産生。

したがって、ミリQ水は、植物浸潤のためのアグロバクテリウム培養物の希釈に推奨され、その後の実験で日常的に使用され、600ナノメートルで0.5の光学密度を達成しました。次に、アグロバクテリウム細胞の懸濁液密度と時間経過が標的発現に及ぼす影響を調べました。PBI 4G FPを保有するアグロバクテリウムの4つの異なる細胞懸濁密度を評価し、浸潤後4、7、および10日で葉サンプルを採取しました。または4DPIでのウェスタンブロット分析のために、アグロバクテリウムの異なる細胞懸濁密度で浸潤した植物間でGFP蛍光に顕著な違いがありました。7つのD-P-I-G-F-Pで0.05の600でGFP発現は観察されませんでした。

蛍光は、細胞懸濁液に浸潤した植物で同様でした。密度は 601.0 0.5 と 0.1 ですが、10 DPI で 0.05 の A 600 で浸潤したインプラントは低くなりました。一過性タンパク質生産に利用可能なアグロバクテリウム株の多様性を高めるために、4つの細胞懸濁密度のいずれかを浸潤した植物間でGFP産生に差は観察されませんでした。

ニコチアナベンハムミアナの植物は、ベクトルKBI 4舐めキロを抱くアグロバクテリアの7つの異なる株が真空浸透しました。浸潤した葉は7DPIで収集され、キナーゼ発現のレベルはウェスタンブロットによって推定されました。このグラフに示すように、GV 3 1 10、1 A four、LBA 4 4 0 4 の系統で最高レベルのリアーゼ産生が達成されましたが、わずかな違いがあります。

発現が最も低かったのはC、5、8、C、One、中間リアーゼ産生は、T 77、A、T、ゼロ、6、およびT10、リアーゼ、およびT 10の株で達成されました。これは、XMO Grahamアッセイを使用して実証されました。精製した細菌のリアーゼタンパク質は、酵素活性のポジティブコントロールとして使用されました。興味深いことに、ニコチアナ・ベンハム・ミアナ植物は、A 4およびA T 7野生型アグロバクテリウム株を浸透させ、発育阻害、ペットの伸び、カール、葉のカールなどの病的症状を7DPIで示しました。

症状は、T 10株の野生型が浸透したニコチアナベンハム植物では軽度でした。実験室株GV 3 1 0 1に浸潤したニコオセアナベンハム植物では症状は観察されませんでした。野生種における植物バイオマス生産量を比較したところ、同じ生育条件下で、ニコオセアナエクセラから生成できる最も高い葉バイオマスは、ニコオセアナと比較して約2倍高いことが明らかになりました。

ベンハムタンパク質の生産は、アグロバクテリウム株を浸潤させたニコオセアナベンハム、ニコオセアナエクセルシオール、およびニコオセアナエクセラで調べました。PBI 4G F-P-G-F-P 蓄積を含む GV 3 1 0 1 は、浸透葉全体で 7 DPI で評価されました。紫外光下でのGFP発現を目視で確認したところ、ニコオセアナ浜菜とニコオセアナエクセラではGFPの分布が均一で、ニコオセアナエクセルシオールではニコオセアナエクセルシオールの葉全体への浸透が困難であるために分布が不均一であることが示されました。これらの浸潤葉のGFP蓄積を7DPIで解析したところ、ニコオセアナ浜菜ではニコオセアナエクセラやニコよりもGFPレベルが高いことがわかりましたオセアナエクセルシオールニコオセアナのタンパク質生産の低レベル。

エクセルシオールは、採取した葉に蓄積したGFPの浸透や分布が不均一であることが原因です。葉に対する真空圧の影響をテストするために、ニコ・オセアナ・ベンハム植物に、PBI 4G FPを保有するアグロバクテリウム株GV 3 1 0 1を、400、200、100、または50ミリバールの真空圧下で、30秒または60秒の真空保持時間で浸潤させた。GFP産生に差はなく、5、100、200ミリバールの真空圧を30秒または60秒間印加した場合、植物の健康に軽度またはまったく有害な影響が観察されませんでした。

標的発現に対する真空の持続時間の影響は、PBI 4G FPを保有するGV 3 1 0 1のA 600 of GV 3 1 0 1を1時間ごとにNico Oceana Benhamプラントの1つのフラットに浸透させることによって評価されました。この代表的な結果で示されたのと同じアグロバクテリウム培養では、GFP産生のレベルは常に同程度で、最大8時間を指しており、この期間中、アグロバクテリウムが一本鎖DNAを発射する能力を維持していることを示唆しています。多くの化学物質や単糖類が、さまざまな植物種における一過性のタンパク質産生を促進することが報告されています。

この研究では、アセト、クリノン、グルコースの濃度が異なる場合の影響も評価しました。ニコ・オセアナ・ベンハムにおける一過性GFPタンパク質産生について、アナはPBI 4G FPを有するアグロバクテリウム株GV 3 1 0 1を浸潤させた。アグロ細菌をYESB培地で一晩増殖させ、遠心分離し、示された濃度で2%グルコースとアセチルセロンを含むMMAまたは示された濃度でグルコースを含む200マイクロモルのアセトフェノンを含むMMAのいずれかで、0.5の600に再懸濁しました。ここに示すように、これらの化合物の試験された濃度のいずれも、誘導培地にアセトフェノンまたはグルコースを含まない対照と比較して、GFPタンパク質産生の有意な増加を引き起こさなかった。

次に、Nico OceanaにおけるGFPおよびHAC one遺伝子の一過性発現に対するサイレンシングサプレッサーの共浸潤の影響。ベンハム葉は、PBI 4G FPおよびトマトふさふさスタントウイルスのウイルスサイレンシングサプレッサーP 19をそれぞれ1対1、2対1、3対1、および4対1の比率で混合したアグロバクテリウムGVの3つの10つの培養物に浸潤前に調べました。7DPIでのウェスタンブロット解析の結果が示すように、P 19の存在は、アグロバクテリウム懸濁液のうちの2つの比率で、ニコチアナベンハムミアナのGFP産生を増加または減少させませんでした。

さらに、2つのウイルス性遺伝子サイレンシングサプレッサーP 23およびP 19がHACの転写後遺伝子サイレンシングの予防に及ぼす影響を調査した。発射ベクターPBIを4つ、HACを1つ、および2つのウイルスサイレンシングサプレッサープラスミドのうちの1つをそれぞれ4対1の割合で混合し、Nicotiana Bentham Mianaに共浸潤させた。浸潤した葉のサンプルは、3〜8DPIから収集されました。

このグラフは、ウェスタンブロット解析によって決定された3つの実験からのHAC 1発現の平均レベルを示しています。Nico Oceana BenhamにP 23またはP 19を同時浸潤すると、60 piでサイレンシングサプレッサーを使用しない場合と比較して、HAC 1の生産量が増加しました。これは、P 23 と P 19 がこのシステムで効率的であることを示唆しています。

また、サイレンシングサプレッサーの存在下と不在下の両方で、HAC 1タンパク質の産生レベルは7DPIで低下し始めたことも観察されました。これは、発射ベクターが浸透したニコ・オセアナ・ベンハム・ミアナにおける一過性タンパク質生産の減少のタイミングが標的特異的であることを示しています。最後に、アグロバクテリウム細胞バンクの安定性は、アグロバクテリウム細胞バンクの同じバッチをニコチアナベンハム植物に浸透させることにより、タンパク質蓄積を評価することにより、毎年評価されます。

これらの代表的な結果は、HA 1タンパク質の産生が3年以上にわたって非常に安定していることを示しています。ニコチアナベナム工場での平均HAC1生産量は、キログラムあたり651プラスマイナス49.4ミリグラムです。このビデオを見れば、アグロ浸潤法を大規模な組換えタンパク質の生産に応用する方法を十分に理解できるはずです。これは、サブユニットワクチン、テオタンパク質抗体、診断用抗原の製造に使用できます。

この手順を試みる際には、植物の交配を水耕栽培で制御し、生存可能なアグロバクテリアを使用し、真空圧とイオンを制御し、タンパク質発現の媒体を監視することを覚えておくことが重要です。一度マスターすると、アグロろ過技術は、制御された条件下で適切に実行されれば、24時間で行うことができます。