聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。

この電気生理学的アッセイの全体的な目標は、出生後の発育中の蝸牛有毛細胞の形態学的および機能的変化を調査することです。この方法は、聴覚の開始時に有毛細胞がいつ機能を獲得するかなど、聴覚アシスタント部門の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、出生後のラットの子犬から分離された個々の有毛細胞の機能を評価することができることです。

手順を実演するのは、私たちの研究室の学生であるWenlu Pan、Shasha Guo、Nana Xuです。この手順を開始するには、麻酔をかけた動物をポリエチレンフォーム型に入れて、動物の体を固定します。次に、動物を防音室の防振テーブルに置きます。

動物の体温を摂氏37.5度に保ち、加熱パッドを使用します。次に、70%エタノールで頭部を拭きます。外部耳介に対して腹側方向に1〜2ミリメートルの切開を行い、参照電極または接地電極を配置します。

次に、頭蓋骨の頂点に皮下記録電極を配置します。関数ジェネレータを使用して、さまざまな周波数と強度のキャリブレーションされたトーンバーストを生成します。動物の頭から10センチ離れた場所にある静電スピーカーから音の刺激を届けます。

聴覚脳幹の反応を得るために、音によって誘発される電位をフィルタリングし、増幅し、多機能プロセッサを使用して平均化します。40分間のABR記録はオンラインで監視され、オフライン分析のために保存されます。このセクションでは、70%エタノールを噴霧して動物の頭を滅菌します。

次に、矢状正中線に沿って頭蓋骨をハサミで開き、脳を取り出して内耳を露出させます。次に、3ミリリットルの氷のように冷たいLeibovitzのL-15ミディアムを充填した35mmのシャーレに内耳を移します。解剖顕微鏡下で、細い鉗子を使用して蝸牛の骨嚢を取り出します。

その後、modiolus から関連付けられた OC と SV をアンラップします。SVの基部を鉗子で保持することにより、基部から頂点までゆっくりとほどくことにより、OCをSVから完全に分離します。その後、細いハサミでOCを均等に3つに切ります。

すべてのステップは、劣化と組織の劣化を最小限に抑えるために、氷冷したL-15でできるだけ早く実行する必要があります。このステップでは、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、OCのセグメントをスライドガラスに移します。100マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で少なくとも4時間固定します。

その後、パラホルムアルデヒドを100マイクロリットルの新鮮なPBSで置換して組織を洗浄します。その後、ティッシュペーパーを毎回10分間、3回洗います。その後、0.3%透過性薬剤を含むPBS溶液で、室温で30分間インキュベー

30分後、透過剤を廃棄し、PBSで組織を3回洗浄します。その後、10%正常ヤギ血清とPBSで組織を室温で1時間ブロックします。抗プレスチンC末端抗体およびブロッキング溶液を用いて、室温で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。

その後、ティッシュペーパーをPBSで3回、毎回5分間洗います。その後、Alexa 488標識二次抗体とブロッキング溶液中で組織をインキュベートし、室温の暗所で1時間。ティッシュペーパーをPBSで3回、暗所で毎回5分間洗います。

次に、組織をローダミンファロイジンと室温で暗所で10分間インキュベートします。暗闇の中でティッシュをPBSで5分間3回洗います。次に、サンプルを封入剤付きのスライドガラスにマウントします。

405ナノメートル、488ナノメートル、594ナノメートルのレーザーを使用した共焦点顕微鏡でイメージングします。この手順では、ピペットプーラーとマイクロフォージャーを使用します。先端径が2〜3ミクロンのパッチピペットを製作します。

次に、ピペットを細胞内溶液で埋め戻します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、OCの一部を35ミリメートルのペトリ皿に移します。100マイクロリットルの酵素消化培地で組織を室温で5分間消化します。

次に、酵素消化培地を100マイクロリットルのL-15で置換します。マイクロメスを使用して組織を細かく切り、有毛細胞を分離します。穏やかにピペッティングした後、酵素を含まない浴溶液で満たされた自家製の小さなプラスチックチャンバーに細胞を移します。

次に、チャンバーを倒立顕微鏡のステージに置き、健康に見える孤立したOHCを見つけます。その後、パッチピペットをヘッドステージにロードしますtage 700Bアンプ。パッチピペットを外側の有毛細胞の底部に配置します。

その後、全細胞パッチは、細胞体の側壁をシールすることによりOHCをクランプします。細胞膜が破裂するまで軽く吸引します。次に、保持電位を70ミリボルトに設定します。

アクセス抵抗が10〜17メガオーム、膜抵抗が100〜500メガオームの範囲のセルは、成功した全セル構成と見なされます。細胞に過分極電圧と脱分極電圧を印加して、細胞全体に電流を流します。パッチクランプソフトウェアによって制御される2つの正弦波電圧刺激プロトコルを使用して、OHCの膜容量を測定します。

刺激電圧範囲を140〜110ミリボルトに設定し、オフライン分析用にデータを保存します。穏やかに消化した後、OHCをOCから分離しました。全細胞電圧クランプ記録は、ラット蝸牛から急性に分離されたOHCから行われました。ここでは、140ミリボルトから107ミリボルトに変化した膜電位に応答して単離されたP9 OHCから記録された全細胞電流の代表的な例を示します。

この図は、年代の異なる2つのOHCから得られる非線形膜容量を示しています。静電容量電圧応答はボルツマン関数に適合しました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2時間で習得できます。

この手順に続いて、ウエスタンブロッティングやPCRなどの他の測定を実施して、有毛細胞内のプレスチンなどの一部のタンパク質の発現レベルを評価するなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、有毛細胞の分野の研究者が蝸牛と前庭系の電気生理学的特性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、出生後の発育中の蝸牛有毛細胞の形態学的および機能的変化を調査する方法について十分に理解できるはずです。