Name: 聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞パッチ・クランプ記録法。個々の有毛細胞の機能を評価し、聴覚発達期の形態・機能変化を電気生理学的に解析する手法です。

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この作品は、973 プログラム (2014CB943002) と、国家自然科学基金、中国の (11534013、31500841) からの助成金によって支えられました。

動物を対象とする実験のすべてのプロトコルは、南方医科大学の動物倫理委員会によって承認されました。
1 実験用のソリューションを準備します。
<ol><li>麻酔の準備 (材料の表を参照してください): 1.5% ペントバルビ タール ナトリウム溶解 ddH2o.</li>
	<li>郭清のソリューションを準備 (材料の表を参照してください): Leiboviz の L-15 パウダー 1 M NaOH で ddH2O. 調整 pH 7.3 の 1 L に 1 袋を溶かします。Osmometer および使用する前に 10 mM HEPES を使用して 300 330 mOsm に浸透圧を調整します。</li>
	<li>2 mg/mL コラゲナーゼ IV を解散 (材料表参照) ステップ 1.2 で郭清溶液で。</li>
	<li>(材料の表を参照してください) 染色ソリューションを準備: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4% パラホルムアルデヒドを解散。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。</li>
	<li>PBS で 0.3% 透水剤を希釈します。ブロック バッファーとして PBS で 10% ヤギ血清を希釈します。ブロック バッファーのプレスチン抗体 1: 200 を希釈します。ブロック バッファーで抗体の Alexa488 共役 1:600 を希釈します。PBS でファロイジン Tetramethylrhodamine B イソチオ シアン酸 1: 200 を希釈します。</li>
	<li>細胞外の溶液を準備 (材料の表を参照してください): (ステップ 1.2) 上記のように Leiboviz の L-15 媒体を準備します。</li>
	<li>細胞内の溶液を調製 (材料の表を参照してください)。</li>
</ol>2. ABR 記録
注: ABR 記録は、以前私たちの以前の研究9で詳細に記載されています。
<ol><li>ペントバルビ タール ナトリウム 1.5% (22 mg/kg の子犬および大人、腹腔内の 30 mg/kg、(i. p.)) の単一の注入と SD) ラット (1 14 日古い子犬、生後 2 ヶ月の大人、男女ともに) を麻酔します。</li>
	<li>動物の体を動けなくポリエチレン発泡金型に麻酔下の動物を配置します。音減衰部屋の防振テーブルに動物を配置します。37.5 ° C 加熱パッドで動物の体の温度を保ちます。</li>
	<li>(巻/巻) 70% エタノールでヘッドの領域を拭いてください。良いはさみを使用して、参照電極または地上に配置する外部の耳介に腹の 1-2 mm の切開を加えます。頭蓋骨の頂点 (図 1 a) 皮下針電極 (電極記録) があります。</li>
	<li>関数発生器を使用して様々 な周波数のキャリブレーション トーン バースト (1 ms 立上り/立下り、3 ms 高原) を生成する (2、4、8、16、24、および 32 kHz) と強度 (85 から 5 dB ステップで 10 dB SPL に減少した)。周波数と振幅を手動で変更またはコンピューターを使用しています。動物の頭に向かって離れて 10 cm に位置する静電スピーカーから音刺激を提供します。</li>
	<li>(100-1,000 Hz) をフィルター、増幅し、平均 (256 回) サウンド誘発可能性多機能プロセッサを使用して、Abr を取得します。ABR のトレースには、オンラインとオフラインで分析できるストアドが監視されます。1 つの動物から記録 ABR を完了する約 40 分かかります。 注: (波私波 VII) 通常、3 ~ 7 ピーク遅延時間が 15 ms にすることができます未満は (図 1 b) を識別します。ABR 閾値は、I と II が波を検出できる最小の音圧レベルとして定義されます。</li>
	<li>動物 (0.3 mL 1.5% ナトリウム, ペントバルビ タールの腹腔内投与) と麻酔から覚める前に安楽死させます。</li>
</ol>3. コルチ器官 (OC) 郭清
<ol><li>ラットを麻酔します。ラット未満 6 日古いの (< P6)、100 mm の培養皿で動物を維持し、10 分間氷で包みます。ラット用 > P6、1.5% ナトリウム ペントバルビ タール (22 mg/kg, i. p.) の単回投与で動物を麻酔します。麻酔後ラット仔の首をはねます。</li>
	<li>頭を 70% (巻/巻) エタノールを噴霧して消毒します。</li>
	<li>ハサミの矢状面の正中線に沿って頭蓋骨を開く脳、内耳を公開するを削除します。</li>
	<li>3 ml 冷たい L-15 (図 2 a) の 35 mm のペトリ皿に内耳を転送します。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下で微細鉗子を使用して (図 2 b) 蝸牛の硬骨を削除します。</li>
	<li>OC の包みを開けるし、蝸牛軸から耳用 (SV) を関連付けられています。</li>
	<li>押し鉗子、SV の基底部 OC SV から完全に分離ベース-apex (図 2) からゆっくりとアンワインドしています。</li>
	<li>高級はさみ (図 2 D) を使って OC を 3 個に均等に切る。</li>
</ol>4. 蛍光抗体染色
<ol><li>200 μ L ピペット チップを使用して、スライド ガラス上に OC (ステップ 3.8) のセグメントに転送、4 ° C で、少なくとも 4 時間のための 4% のパラホルムアルデヒドの 100 μ L で固定 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。</li>
	<li>新鮮な pbs 100 μ L でパラホルムアルデヒドを置き換えたり、組織を洗います。10 分間 3 回ティッシュを洗います。</li>
	<li>室温で 30 分間 PBS で 0.3% 透過性エージェントと組織を孵化させなさい。</li>
	<li>PBS で透磁率エージェントを破棄し、PBS に組織を 3 回洗います。</li>
	<li>室温で 1 時間 PBS で 10% ヤギ血清をブロックします。</li>
	<li>一晩 2 時間室温でまたは 4 ° C で解決を妨げる抗プレスチン C 末端抗体 (レバレッジ) で孵化させなさい。</li>
	<li>3 回を PBS で 5 分間洗浄します。</li>
	<li>暗闇の中で室温で 1 時間ブロッキング液で Alexa488 共役二次抗体 (1:600) を孵化させなさい。</li>
	<li>3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。</li>
	<li>ローダミン ファロイジン (レバレッジ) と暗闇の中で室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。</li>
	<li>スライド ガラス (DAPI を含む) メディアをマウントをマウントします。405 を使用して共焦点顕微鏡画像 nm、488 nm、および 594 nm のレーザー。レーザー電力設定 0.1 0.5 mW とスキャンは 0.5 フレーム/秒で高速化します。</li>
</ol>5. パッチク ランプ記録の分離
<ol><li>ピペットの引き手を使用し、パッチを作るに偽造者のマイクロ ピペット先端径 2-3 μ m. 埋戻し細胞内ソリューションとピペット。通常、パッチ ピペットの最初の抵抗は、バス ソリューションの 2.5 から 3.5 の MΩ だった。</li>
	<li>200 μ L ピペット チップを使用して、35 mm のペトリ皿に (ステップ 3.8) から OC の一部を転送します。100 μ L の酵素消化中で組織を消化 (コラゲナーゼ IV、参照テーブルの材料) 室温で 5 分間。</li>
	<li>L-15 の 100 μ L の酵素消化中を転置します。組織を有毛細胞を分離するマイクロ メスを使用する小さな断片にカットします。</li>
	<li>穏やかなピペッティング後自家製小型プラスチック製チャンバーにセルを転送 (直径 〜 1.5 cm) 無料の酵素入浴液でいっぱい (〜 1.5 mL材料表を参照してください)。</li>
	<li>倒立顕微鏡のステージでチャンバーを配置します。健康表示の孤独な内耳を見つけます。</li>
	<li>700 b アンプのヘッド ステージにパッチ ピペットをロードします。マイクロマニピュレーターによってパッチ ピペットを慎重に移動し、外有毛細胞 (図 3 a) の下部に位置します。</li>
	<li>細胞は、細胞体の側壁をシールで、OHC をクランプします。細胞膜が破裂するまで光の吸引を適用します。-70 で潜在的な開催を設定 mV。10 〜 17 MΩ 抵抗と膜抵抗セルは 100 〜 500 MΩ、成功した全体セル構成と見なされます。</li>
	<li>コンピューター制御を使用して過分極・脱分極電圧を適用 (250 ms 期間と +94 −140 に至る 13 mV 刻みで mV) 全細胞の流れを引き出すためにセルに。</li>
	<li>全細胞の流れを増幅、700 b アンプで (角周波数 5 kHz) をフィルターします。1440A コンバーターとオフライン解析のための店でデータを変換します。</li>
	<li>パッチ クランプ ソフトウェアによって制御される 2 つの正弦波電圧刺激プロトコルを使用して内耳の膜の静電容量を測定します。-140 から刺激する電圧範囲を 110 に設定 mV。オフライン分析用のデータを格納します。</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

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11 日目より若いラット、聴覚野6,7で音刺激電位が観察できません。したがって、生後 11 日目は、「聴覚発症"10として記述されます。聴覚の発症がよくまだ研究されていない前に聴覚機能の開発。大人の ABR 記録のため同様のメソッドを使用して、Abr が仔 P11 より若いから純粋なトーン バーストによって誘発されることを示す (図 1)。しかし、ラットから得られた ABR 波形は、大人動物のそれらからのいくつかの異なる機能を示した。ABR 応答は、比較的高いしきい値振幅が小さい。この結果は、開発聴覚システムが音声信号に低感度を持っていることを意味します。仔から記録された ABR 波形の有意差を認めた.通常は、7 つのピークまで大人 ABR 波形9で観察されました。待ち時間が異なるとこれらのピークは、11聴覚経路に沿って...

哺乳類の聴覚の感覚の蝸牛の有毛細胞の 2 つの異なる機能が欠かせない: mechanoelectric 伝達 (MET) と electromotility1,2。MET チャネル髪束、Ihc (Ihc), 変換音振動膜電位変化と神経らせん神経節細胞の電気信号であります。内耳膜電位とそのセルの長さを変更し、低音の振動を増幅します。Electromotility と呼ばれるこの活動は,3の外側の壁にあるタンパク質モータプレスチンによって派生します。
齧歯動物を含む多くの種で、公聴会の関数は初期産後エポック4,5に未熟です。聴覚発症6、7の前に聴覚野における音声信号への応答で活動電位が検出されません。形態の開発と蝸牛の機能はラット4,5,8スナネズミ、マウスで広く研究されています。メカノトランスダクションと有毛細胞の electromotility の初期の開発もエポック社の生活の5。
生後隔世でラットの聴覚感度を評価するためにラット記録脳幹反応 (ABR) の手法を提案します。全細胞パッチク ランプは、生理、内耳を調査する理想的な技術です。ただし、ニューロンと他の上皮細胞で実行パッチ クランプと比べると、全体携帯シールの低率は分離強大の electromotility の調査を制限しました。
ここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛の形態と生理、内耳を調査する手順をについて説明します。このメソッドは、内部の有毛細胞の開発と機能を制御する分子機構を研究する変更できます。

<table><tbody><tr><td>麻酔薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>シグマ</td><td>P3761</td><td>1.5% in water</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>Dissection solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1パック 1 L 水</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 mg/mL in L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</強い></td></tr><tr><td><強い>免疫染色液</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010023</td><td>PH 7.3</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>158127</td><td>4%</td></tr><tr><td>PBS Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0.3% PBS</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10000C</td><td>10% PBS中 10%</td></tr><tr><td>プレスチン抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-標識抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>ファロイジン-テトラメチルローダミンBイソチオシアネート</td><td></td><td>Sigma P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>細胞外ソリューション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LeibovizのL-15</td>中<td>期生命技術</td><td>41300-039</td><td>1L水</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>細胞内溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Σ</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Σ</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Σ</td><td>67-42-5</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計</td><td>ゴノテック</td><td>OSMOMAT3000基本的な</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>WPI</td><td>14095</td>ピン<td>セットデュモン</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>シャッター機器</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>フォージ</td><td>成志源</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>ミニオペレーティングシステム</td><td>シャッター機器</td><td>MP-285</td><td></td></tr>マルチ<tr><td>クランプ</td><td>軸700B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低ノイズデータ収集システム</td><td>軸ソン</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1スピーカー</td><td>タッカー・デイビス・テクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>TDTシステム 3</td><td>タッカー・デイビス・テクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ名前<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRPソフトウェア</td><td>タッカー・デイビス・テクノロジー</td><td></td><td></td>ズ</tr><tr><td>BioSigRPソフトウェア</td><td>タッカー・デイビス・テクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDラット</td><td>南医科大学</td><td></td><td></td>実験動物センター</tr></tbody></table>

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

外の有毛細胞は哺乳類の蝸牛の感覚毛の細胞の 2 つのタイプの 1 つです。彼らは、低レベルの音声信号の弱い振動を増幅する潜在的な受容体とそのセルの長さを変更します。形態と内耳外有毛細胞の電気生理学的特性は、産後の早い年齢で開発します。外有毛細胞の成熟聴覚システムの開発に貢献するかもしれない。しかし、内耳の開発のプロセスはよく研究されていません。これは電気生理学的アプローチによるそれぞれの機能を測定する難しさの一因です。上記の問題を解決する簡単な方法を開発することを目的としてここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛における内耳の機能を勉強する段階的なプロトコルをについて説明します。この方法では、純音刺激の蝸牛神経の反応を評価し、表現レベルと強大でタンパク質モータプレスチンの機能を調べる。このメソッドは、内部の有毛細胞 (Ihc) を調査にも使用できます。

ABR は、麻酔したラットの子犬生後 7 日目より古い (P7) (図 1 a) 純粋なトーン バーストを使用してから誘発されることができます。図 1 bのように、仔と小振幅だけ 3 〜 4 明瞭な波を示したから ABR 波形が得られます。通常は、7 つのピークまで大人動物 (図 1 b) ABR 波形の観察されました。
次免疫染色と電気生理学的測定では、ラット内耳は側頭骨から新鮮な解剖されました。SV と蝸牛軸 (図 2 a-2 C) から OC を分離する組織郭清の連続した手順を示します。OC は、マイクロ剪刀 (<strong class="x...

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

この電気生理学的アッセイの全体的な目標は、出生後の発育中の蝸牛有毛細胞の形態学的および機能的変化を調査することです。この方法は、聴覚の開始時に有毛細胞がいつ機能を獲得するかなど、聴覚アシスタント部門の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、出生後のラットの子犬から分離された個々の有毛細胞の機能を評価することができることです。手順を実演するのは、私たちの研究室の学生であるWenlu Pan、Shasha Guo、Nana Xuです。この手順を開始するには、麻酔をかけた動物をポリエチレンフォーム型に入れて、動物の体を固定します。次に、動物を防音室の防振テーブルに置きます。動物の体温を摂氏37.5度に保ち、加熱パッドを使用します。次に、70%エタノールで頭部を拭きます。外部耳介に対して腹側方向に1〜2ミリメートルの切開を行い、参照電極または接地電極を配置します。次に、頭蓋骨の頂点に皮下記録電極を配置します。関数ジェネレータを使用して、さまざまな周波数と強度のキャリブレーションされたトーンバーストを生成します。動物の頭から10センチ離れた場所にある静電スピーカーから音の刺激を届けます。聴覚脳幹の反応を得るために、音によって誘発される電位をフィルタリングし、増幅し、多機能プロセッサを使用して平均化します。40分間のABR記録はオンラインで監視され、オフライン分析のために保存されます。このセクションでは、70%エタノールを噴霧して動物の頭を滅菌します。次に、矢状正中線に沿って頭蓋骨をハサミで開き、脳を取り出して内耳を露出させます。次に、3ミリリットルの氷のように冷たいLeibovitzのL-15ミディアムを充填した35mmのシャーレに内耳を移します。解剖顕微鏡下で、細い鉗子を使用して蝸牛の骨嚢を取り出します。その後、modiolus から関連付けられた OC と SV をアンラップします。SVの基部を鉗子で保持することにより、基部から頂点までゆっくりとほどくことにより、OCをSVから完全に分離します。その後、細いハサミでOCを均等に3つに切ります。すべてのステップは、劣化と組織の劣化を最小限に抑えるために、氷冷したL-15でできるだけ早く実行する必要があります。このステップでは、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、OCのセグメントをスライドガラスに移します。100マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で少なくとも4時間固定します。その後、パラホルムアルデヒドを100マイクロリットルの新鮮なPBSで置換して組織を洗浄します。その後、ティッシュペーパーを毎回10分間、3回洗います。その後、0.3%透過性薬剤を含むPBS溶液で、室温で30分間インキュベートします。30分後、透過剤を廃棄し、PBSで組織を3回洗浄します。その後、10%正常ヤギ血清とPBSで組織を室温で1時間ブロックします。抗プレスチンC末端抗体およびブロッキング溶液を用いて、室温で2時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、ティッシュペーパーをPBSで3回、毎回5分間洗います。その後、Alexa 488標識二次抗体とブロッキング溶液中で組織をインキュベートし、室温の暗所で1時間。ティッシュペーパーをPBSで3回、暗所で毎回5分間洗います。次に、組織をローダミンファロイジンと室温で暗所で10分間インキュベートします。暗闇の中でティッシュをPBSで5分間3回洗います。次に、サンプルを封入剤付きのスライドガラスにマウントします。405ナノメートル、488ナノメートル、594ナノメートルのレーザーを使用した共焦点顕微鏡でイメージングします。この手順では、ピペットプーラーとマイクロフォージャーを使用します。先端径が2〜3ミクロンのパッチピペットを製作します。次に、ピペットを細胞内溶液で埋め戻します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、OCの一部を35ミリメートルのペトリ皿に移します。100マイクロリットルの酵素消化培地で組織を室温で5分間消化します。次に、酵素消化培地を100マイクロリットルのL-15で置換します。マイクロメスを使用して組織を細かく切り、有毛細胞を分離します。穏やかにピペッティングした後、酵素を含まない浴溶液で満たされた自家製の小さなプラスチックチャンバーに細胞を移します。次に、チャンバーを倒立顕微鏡のステージに置き、健康に見える孤立したOHCを見つけます。その後、パッチピペットをヘッドステージにロードしますtage 700Bアンプ。パッチピペットを外側の有毛細胞の底部に配置します。その後、全細胞パッチは、細胞体の側壁をシールすることによりOHCをクランプします。細胞膜が破裂するまで軽く吸引します。次に、保持電位を70ミリボルトに設定します。アクセス抵抗が10〜17メガオーム、膜抵抗が100〜500メガオームの範囲のセルは、成功した全セル構成と見なされます。細胞に過分極電圧と脱分極電圧を印加して、細胞全体に電流を流します。パッチクランプソフトウェアによって制御される2つの正弦波電圧刺激プロトコルを使用して、OHCの膜容量を測定します。刺激電圧範囲を140〜110ミリボルトに設定し、オフライン分析用にデータを保存します。穏やかに消化した後、OHCをOCから分離しました。全細胞電圧クランプ記録は、ラット蝸牛から急性に分離されたOHCから行われました。ここでは、140ミリボルトから107ミリボルトに変化した膜電位に応答して単離されたP9 OHCから記録された全細胞電流の代表的な例を示します。この図は、年代の異なる2つのOHCから得られる非線形膜容量を示しています。静電容量電圧応答はボルツマン関数に適合しました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2時間で習得できます。この手順に続いて、ウエスタンブロッティングやPCRなどの他の測定を実施して、有毛細胞内のプレスチンなどの一部のタンパク質の発現レベルを評価するなどの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、有毛細胞の分野の研究者が蝸牛と前庭系の電気生理学的特性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、出生後の発育中の蝸牛有毛細胞の形態学的および機能的変化を調査する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

哺乳類の蝸牛の内有毛細胞のリボンシナプスにおける聴覚神経線維の樹状突起からのホールセルパッチクランプ記録。...

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

electromotility、遅い運動性と曲げを含む外有毛細胞（OHC）運動性応答を、調査するために信頼性の高い方法が記載されている。...

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

このビデオの目的は、成人のゼブラフィッシュの内耳器官から健康な無傷の有毛細胞を取得した後、それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的としたパッチクランプ研究のためにそれらを使用するための手順を示すことである。...

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このビデオでは、聴覚障害者のマウスに人工内耳を埋め込み、電気刺激を加えて聴覚脳幹の反応を記録する手順を示しています。この手順により、電気聴覚の基本的なメカニズムを理解することができ、人工内耳技術と聴覚神経科学の進歩に貢献することができます。...

聴覚障害者マウスにおける電気的に誘発された聴覚脳幹応答の記録

このビデオでは、内耳感覚ニューロン細胞体のイオン電流を測定するためのパッチクランプ技術を示しています。アムホテリシンBを含む内部溶液を充填した研磨パッチクランプピペットの調製と使用について詳しく説明します。このピペットは、メンブレンに穴を開けて、細胞内状態を維持しながらイオンを移動できるようにします。電圧パルスは、イオンチャネルの活動をトリガーおよび記録するために印加され、その特性と挙動に関する洞察を提供します。...

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

このビデオは、パッチクランプ技術を使用してレオベースと膜電位を測定し、増分電流注入に対するニューロンの応答を分析する後根神経節の感覚ニューロン興奮性の調査を示しています。...

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

この原稿は、パッチクランプ録音のための無傷の後根神経節の準備方法を説明しています。この調製物は、ニューロンおよびサテライトグリア細胞の微小環境を維持し、解離したDRGニューロンを使用して見られる表現型および機能的変化を回避します。...

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

蝸牛にトランス鼓膜のルートを通じて医薬品の集中管理のための手法を提案します。この経路によるドラッグデリバリー...

難聴の治療のためのトランス鼓膜ドラッグデリバリー

脳幹誘発応答オーディオメトリーは、臨床神経生理学における重要なツールである。今日では、脳幹誘発応答オーディオメトリーは、薬理学的および遺伝的動物モデルの両方を含む基礎科学および前臨床試験にも適用される。ここでは、聴覚脳幹応答をマウスで正常に記録および分析する方法の詳細な説明を提供します。...

マウスにおける脳幹誘発応答オーディオメトリーにおけるデータ獲得と分析

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パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

学ぶ聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞パッチ・クランプ記録法。個々の有毛細胞の機能を評価し、聴覚発達期の形態・機能変化を電気生理学的に解析する手法です。

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ・クランプ記録

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