フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

この手順の全体的な目標は、グループ特異的なDNAアプタマーから高疎水性の低分子までを選択し、選択したアプタマーを使用して高感度の電気化学バイオセンサーを開発することです。この方法は、ターゲットが疎水性の高い分子である場合に、グループ特異的なアプタマーをどのように選択し、特性評価するかという、アプタマー選択分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の最も有用な部分は、タイトルの検出のための電気化学バイオセンサーの開発です。

これらのバイオセンサーは、アプタマー親和性測定にも機能するはずです。反応を開始するには、精製したアプタマーPCR産物に100マイクロリットルのRNase-Free水を加えます。沈殿物が溶解するまで混合物をボルテックスします。

ラムダエキソヌクレアーゼ反応は、塩濃度に敏感であり、エタノール沈殿によって増殖すべき生成物ですが、別のイソプロパノールです。5本のマイクロ遠心チューブ、5マイクロリットルのアプタマー溶液、11マイクロリットルのRnaseフリー水、および2マイクロリットルの10x反応バッファーのそれぞれに入れます。2マイクロリットルのRnaseフリー水と、Rnaseフリー水中の2、5、8、および10ユニットのラムダエキソヌクレアーゼの溶液をそれぞれ1本のチューブに加えます。

穏やかなピペッティングでよく混ぜます。チューブを摂氏37度で35分間、摂氏80度で15分間インキュベートします。次に、チューブを摂氏4度に保持し、12%ネイティブページジェルを準備します。

各チューブに1マイクロリットルのローディング染料と4マイクロリットルのRnaseフリー水を加えます。ネイティブページゲルで混合物を150ボルトで45分間泳ぎます。一本鎖DNAを完全に生成するために必要なラムダエキソヌクレアーゼの最小量を特定します。

大規模な反応を行い、一本鎖DNAを作製します。試験する結合ターゲットごとに、10マイクロリットルの平均官能基DBPコード磁気ビーズと500マイクロリットルのDBP-1の1マイクロモル溶液を室温で1時間回転しながらインキュベートします。次に、上清を捨てます。

200マイクロリットルのPAE結合緩衝液でビーズを4回洗浄し、ビーズを10マイクロリットルのPAE結合緩衝液に再懸濁します。PAE結合緩衝液中で10マイクロモルの結合標的試験分散液を入手します。PAE結合バッファー中の疎水性ターゲットの分散に最適です。

それを確実にするために、ライブラリの濃縮があり、アフィニティテストの下で選択されました。各ターゲットテスト溶液の110マイクロリットルに10マイクロリットルのDBP-1コードビーズを追加します。混合物を1時間インキュベートし、磁気分離によって上清を収集します。

上清を100倍に希釈し、定量PCRごとに3マイクロリットルを使用します。テストサンプルの存在下で放出されたDBP-1の数を、PAE結合バッファーのみで放出されたDBP-1の数で割ることにより、相対的な親和性を計算します。測定を行う前に、DBP-1ベースのチオレートコアシーケンスプローブとシグナル伝達プローブを合成および精製します。

チオレーテッドプローブとシグナル伝達プローブを、ヌクレアーゼフリー水中の100マイクロモル溶液として再構成します。次に、直径2mmの金電極を、0.3ミクロンと0.5ミクロンのアルミナ粉末とマイクロファイバークロスをそれぞれ5分間、鏡のような表面に研磨します。各研磨後、電極を超純水で5分間超音波処理します。

研磨された電極を0.5モルの硫酸溶液に浸します。マイナス0.4ボルトから正の1.2ボルトまで、毎秒100ミリボルトの水銀カロメルに対して35回の連続したサイクリックボルタンメトリースキャンで電極を清掃します。次に、薄肉の遠心分離チューブに0.5マイクロモルのチオレートプローブDBP-1の混合物を調製します。

また、0.5マイクロモルFCは、PBSの100マイクロリットルでDBP-1を修飾しました。混合物を摂氏95度に設定したウォーターバスで10分間加熱します。次に、混合物をウォーターバスで室温まで冷まします。

冷却した混合物に1マイクロリットルの10ミリモルTCEPストック溶液を加え、室温で1時間保持します。次に、きれいな金電極を室温で12時間混合物に浸します。電極をPBSですすぎ、次に電極をPBS中のチオロール化PEGの1ミリモル溶液に1時間浸します。

ターゲットフリーのPAE結合バッファーで電極を十分にすすぎ、電極をバッファーに浸します。次に、白金対極と飽和カロメル参照電極の電解細胞を、超純水とPAE結合緩衝液中でそれぞれ2分間、順番に超音波処理します。ボルタンメトリー機器ソフトウェアの方形波を開き、実験パラメータを入力します。

クリーンな電解セルに、ターゲットフリーのPAE結合バッファーを充填します。3つのクリーンな電極をポテンショスタットに接続し、電極をバッファーに浸します。バックグラウンドSWVスキャンを取得します。

次に、金作用電極をPAE結合緩衝液中の10ピカモラーDEHP溶液に室温で30分間浸します。電極をPAE結合緩衝液で十分にすすいでください。3つの電極すべてを新しいPAE結合バッファーに浸し、前と同じパラメータを使用して別のSWV曲線を収集します。

このプロセスをDEHPの濃度を上げて繰り返し、滴定曲線を求めます。一本鎖DNAのみを得るために必要なラムダエキソヌクレアーゼの最小量は、小規模の反応に基づいて2単位であることがわかりました。アプタマー候補DBP-1は、SELEXとハイスループットシーケンシングによって同定されました。

DBP-1はPAE同族体に対して良好な群特異性を示した。DBP-1を用いた電気化学アプタセンサーは、他の一般的な環境汚染物質よりもDEHPに選択的に応答した。アプタセンサーはDEHPに対して非常に感度が高く、10ピカモラーという低い濃度で応答しました。

レーザー粒子は、ハザード疎水性小分子のアプタマーの選択と特性評価を行います。PAEのような疎水性低分子のアプタマーの特性評価と揮発は、水溶性が非常に限られており、PAEの分子量が少ないため、一般的に非常に困難です。このビデオを見た後、電気化学アプタセンサーの作り方と、それを使用してタイトルを検出する方法についてよく理解しているはずです。