Name: フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶDNAアプタマーのin vitro選択と特性評価法。疎水性小分子に結合するグループ特異的アプタマーを選別し、電気化学アプタセンサーへの応用を通じて高感度検出システムを構築する手法を解説します。

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国家自然科学基金 (21675112)、北京教育委員会 (KZ201710028027) と燕若い学者プログラムの首都師範大学の科学技術計画のキー プロジェクトから財政支援に感謝しております。

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<li>Lou, X., He, L. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400507006181">Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection.</a> Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).</li>
</ol>

著者は競争の経済的利害関係を宣言しません。

アプタマーの顕著な利点の 1 つは抗体が生体内で免疫反応を介して生成された SELEX、体外法によって識別されます。したがって、アプタマーは抗体が生理的条件に限定しているに対し、適切に設計された実験条件下で目的のターゲット特異性と選択できます。
無料シーケンスからバインドされたシーケンスの分離を容易にするいくつかの変更された SELEX 最近報告されている、キャピラリー電気泳動30、31マイクロ流体、磁気/アクリル ビーズ/アガロース ビーズ14、 など、硝酸セルロース フィルターまたはより効率的な分離を達成するために親和性列に置き換えています。ビーズ法これらの技術の間で簡単なため小分子ターゲットのアプタマー選択のため最も広く使用されているセットアップ、簡単操作、および小分子の解析に適しています。
小さな分子のアプタマー選択の一般的...

急速な経済発展に伴って、工業化と都市建設公害の加速は今までよりもより厳しいです。代表的な環境汚染物質は、重金属、毒素、抗生物質、農薬、内分泌攪乱物質、残留性有機汚染物質 (POPs) に含まれます。金属イオンおよび毒素のほか他の汚染物質が低分子化合物がかなり多くの場合は、同族の様々 な。たとえば、最も有毒なポップス、ポリ塩化ビフェニル (Pcb)、多環芳香族炭化水素 (PAHs)、ポリ臭化ビフェニル エーテル (PBDEs)、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン (ダイオキシン類)、ポリ塩化ジベンゾ フラン (濃度)、フタル酸と酸エステル (パエス)1、2、すべて多くの同族体から成っています。小分子の検出は、アプリケーション3,4,5,6の多様性のためのクロマトグラフィー/質量分析法を用いたテクニックで主に行われています。オンサイト検出の抗体を用いた方法は最近開発された7,8,9をされています。ただし、これらのメソッドは特定の同族体に非常に特有なので、複数のテストを実行する必要があります。深刻なは新規の同族が非常に高速にその抗体を生成できないことを成長します。したがって、1 つのテストですべての同族体のレベルの合計を監視するグループ固有のバイオ センサーの開発は環境汚染状況を評価するため非常に貴重な指標を提供可能性があります。
最近、核酸アプタマーは広く様々 なイオンと蛋白質と細胞10,11 小分子化合物からのターゲットを認識の彼らの能力のための様々 なバイオセンシング プラットフォームの認識要素として適用されています。 ,12。アプタマーは、指数関数的濃縮 (SELEX)13,14によって配位子の系統進化と呼ばれる体外法によって識別されます。SELEX から始まるランダム合成一本鎖オリゴヌクレオチド ライブラリは、約 10 の14-1015シーケンスが含まれています。ランダムなライブラリのサイズは、RNA または DNA 候補構造の多様性を保証します。SELEX の典型的なプロセスは、ライブラリが高い親和性と特異性をターゲットのシーケンスで濃縮されてまで濃縮の複数のラウンドで構成されます。最終的な豊かなプールがシーケンスをサポートしと解離定数 (Kd) と妨害物質などさまざまな手法によって決定されます潜在的な選択性フィルター、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、表面のバインディングプラズモン共鳴 (SPR)、等。15
非常に貧しい人々 の水の溶解度と表面固定化機能群の不足、Pop のアプタマー選択は理論的に難しい。SELEX にとって重要な進歩がアプタマーの探索を高速化します。しかし、Pop のグループ固有のアプタマーの選択はまだ報告されていません。これまでのところ、特定の同族体の高度だけ基板結合 DNA アプタマーの探索は、識別された16をされています。パエスはポリ塩化ビニール材料、硬質プラスチックから、弾塑性解析、可塑剤として作用するポリ塩化ビニルを変更することで主に使用されます。いくつかのパエス内分泌かく乱物質として識別されている、深刻な損傷を引き起こすことができる肝臓と腎臓機能、男性の精子の運動性の軽減、精子形態の異常および精巣癌17があります。化合物 - もグループ固有 PAE バインディング アプタマーが報告されています。
この作業の目的は、ポップスの代表的なグループ ・ パエスといった高疎水性の小さな分子に DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するための代表的なプロトコルを提供するためにです。また環境汚染検出のため選択したアプタマーのアプリケーションを示します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の指導と洞察力を提供します。

<table><tbody><tr><td>UV-2550</td><td>島津</td><td>製作所、日本プロトコール、セクション3.8.2</td>DNAエンニンサーマルサイクラー、PTC0200 BIO-RADセクション3.5.1.2および3.5.2 C1000タッチBIO-RADセクション5.3.6および6.3 VMP3マルチチャネルポテンショスタットバイオロジックサイエンス、クレ、フランスセクション7.4、7.8および7.11エポキシ活性化セファロース6B <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)</td><td>10220020</td><td>アルガロースビーズ、セクション2.3および3.3</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270カルボン酸磁気ビーズ</td><td>Invitrogen、米国</td><td>420420</td><td>磁気ビーズ、セクション5.2.および5.3</td></tr><tr><td>Premix Taq Hot Start Version</td><td>Takara、大連、中国</td><td>R028A</td><td>ポリメラーゼ、セクション3.5.1.1</td></tr><tr><td>PARAFILM シーリング膜</td><td>ベミス、米国</td><td>PM-996</td><td>セクション3.6.5</td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease</td><td>Invitrogen, USA</td><td>EN0561</td><td>section3.7.1.2.The 10 &times; reaction buffer is provided with &lambda; exonuclease. 10 &times; 反応バッファーは、プロバイダーによって & エキソヌクレアーゼと共に提供されます。</td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara,Dalian,China</td><td>9094</td><td>section 3.6.2 and 3.8.1</td></tr><tr><td>UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit</td><td>Sangon Biotech (Shanghai)</td><td>B511135</td><td>section 4.2</td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td><td>Invitrogen, USA</td><td>1811838</td><td>nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara,Dalian,China</td><td>RR820A</td><td>ポリメラーゼとdNTPsを混合したポリメラーゼミックス、セクション5.3.5</td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS:1132-61-2</td><td>セクション5.2.1</td></tr><tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>CAS:25952-53-8</td><td>セクション5.2.2</td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6066-82-6</td><td>セクション5.2.3</td></tr><tr><td>メルカプトヘキサノール(MCH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS:1633-78-9</td><td>セクション7.7</td></tr>金<tr><td>電極</td><td>Shanghai Chenhua</td><td>CHI101</td><td>セクション7.4.-7.11</td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS:51805-45-9</td><td>セクション7.5</td></tr><tr><td>O-(2-メルカプトエチル)-O'-メチル-ヘキサ-(エチレングリコール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS:651042-82-9</td><td>セクション7.7</td></tr><tr><td>フタル酸ジエチルヘキシル(DEHP)</td><td>国立計量研究所、中国</td><td>CAS:117-81-7</td><td>セクション7.11</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS:9005-64-5</td><td>ポリオキシエチレン(20) ソルバイタンモノラウレート</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS:9002-93-1</td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>10 mM リン酸緩衝液1 M NaCl、pH 7.4</td></tr></tbody></table>を含む

フタル酸エステル結合 dna アプタマーの選択、評価、および電気化学 aptasensor への応用

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

フタル酸エステル (パエス) は残留性有機汚染物質の主要なグループの一人。・ パエスのグループ固有の検出が同族体の急速な成長のために望ましい。DNA アプタマーは、ますますバイオ センサー プラットフォーム上の認識要素として適用されているが、パエスなどの高い疎水性小分子目標に向かって選択するアプタマーはほとんど報告します。この作業では、・ パエスに DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するように設計ビーズ法について説明します。アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) アンカー ターゲットを合成し、エポキシ活性化アガロース ビーズに固定化した、固定マトリックスの表面でフタル酸エステルのグループの表示を許可してしたがって、グループ固有のバインダーの選択。我々 は、磁気分離と結合の定量的重合連鎖反応によるアプタマー候補の解離定数を決定しました。相対的な親和性と選択性他のパエスにアプタマーの競争の試金によって定められた磁気ビーズを添付アプタマー候補あった DBP NH2限定事前どこと培養上清にリリーステスト ・ パエスまたは他の潜在的な妨害物質。競争の試金は、表面固定化のための機能グループがなかった・ パエスの安易な親和性の比較を提供されるために適用しました。最後に、我々 は電気化学 aptasensor の作製を実証し、bis(2-ethylhexyl) フタル酸の超高感度かつ選択的な検出のためにそれを使用します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の洞察力を提供します。

私たちは設計・ アンカー ターゲット (図 1 階) として、アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) を合成します。・ パエス DBP NH2を使用してアンカー ターゲットとして、次の古典的なターゲット固定ベース メソッド (図 2) の DNA アプタマーの選択を行った。各ラウンドでパイロットの PCR は PCR (図 3) のサイクル数を最適化する変性のページを用いて行った。高いサイクル数でネイティブのゲルに疑われる高分子量副産物が実際に架橋複合体である我々 と他の同僚を発見したので変性] ページで、ネイティブのページの代わりにお勧め適切なサイズのシーケンス。したがって、変性のページのバンドの強度は本当に適切な製品の量を反映できます。単一の孤立した DNA 生成は別の重要なステップと、このステップのための多くの方法が報告されている<su...

生体外の選択グループ特定フタル酸エステル結合 DNA アプタマーのキャラクタリゼーションのためのプロトコルが表示されます。電気化学 aptasensor で選択したアプタマーのアプリケーションが含まれています。

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

この手順の全体的な目標は、グループ特異的なDNAアプタマーから高疎水性の低分子までを選択し、選択したアプタマーを使用して高感度の電気化学バイオセンサーを開発することです。この方法は、ターゲットが疎水性の高い分子である場合に、グループ特異的なアプタマーをどのように選択し、特性評価するかという、アプタマー選択分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の最も有用な部分は、タイトルの検出のための電気化学バイオセンサーの開発です。これらのバイオセンサーは、アプタマー親和性測定にも機能するはずです。反応を開始するには、精製したアプタマーPCR産物に100マイクロリットルのRNase-Free水を加えます。沈殿物が溶解するまで混合物をボルテックスします。ラムダエキソヌクレアーゼ反応は、塩濃度に敏感であり、エタノール沈殿によって増殖すべき生成物ですが、別のイソプロパノールです。5本のマイクロ遠心チューブ、5マイクロリットルのアプタマー溶液、11マイクロリットルのRnaseフリー水、および2マイクロリットルの10x反応バッファーのそれぞれに入れます。2マイクロリットルのRnaseフリー水と、Rnaseフリー水中の2、5、8、および10ユニットのラムダエキソヌクレアーゼの溶液をそれぞれ1本のチューブに加えます。穏やかなピペッティングでよく混ぜます。チューブを摂氏37度で35分間、摂氏80度で15分間インキュベートします。次に、チューブを摂氏4度に保持し、12%ネイティブページジェルを準備します。各チューブに1マイクロリットルのローディング染料と4マイクロリットルのRnaseフリー水を加えます。ネイティブページゲルで混合物を150ボルトで45分間泳ぎます。一本鎖DNAを完全に生成するために必要なラムダエキソヌクレアーゼの最小量を特定します。大規模な反応を行い、一本鎖DNAを作製します。試験する結合ターゲットごとに、10マイクロリットルの平均官能基DBPコード磁気ビーズと500マイクロリットルのDBP-1の1マイクロモル溶液を室温で1時間回転しながらインキュベートします。次に、上清を捨てます。200マイクロリットルのPAE結合緩衝液でビーズを4回洗浄し、ビーズを10マイクロリットルのPAE結合緩衝液に再懸濁します。PAE結合緩衝液中で10マイクロモルの結合標的試験分散液を入手します。PAE結合バッファー中の疎水性ターゲットの分散に最適です。それを確実にするために、ライブラリの濃縮があり、アフィニティテストの下で選択されました。各ターゲットテスト溶液の110マイクロリットルに10マイクロリットルのDBP-1コードビーズを追加します。混合物を1時間インキュベートし、磁気分離によって上清を収集します。上清を100倍に希釈し、定量PCRごとに3マイクロリットルを使用します。テス

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Chemistry

化学

SELEXのプロトコールは、順番にランダムライブラリ領域に隣接する固定プライマー配列を必要とする結合リガンドの再生を必要とするそれぞれの選択の複数のラウンドを、含み。これらの固定プライマー配列は、選択プロセス（偽陽性と陰性）の妨げになることがあります。ここでは、プライマーのないプロトコルを提示する。...

ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

Aプロトコルは、調整可能なストリンジェンシー磁気ビーズ選択法に基づいて、低分子ターゲットの構造スイッチングアプタマーを選択するために提供されています。構造スイッチング特性で選択されたアプタマーは、前述の金ナノ粒子アッセイなど、ターゲットの存在を知らせるためにコンフォメーションの変更が必要なアッセイに有益です。...

比色金ナノ粒子アッセイに適用される構造スイッチングアプタマーを選択するための方法

マイクロスケールの熱泳動を使用してATPのアプタマーの結合部位のマッピング

腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA...

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

変化したヌクレアーゼ活性は、バイオマーカーとしての可能性の根底にある異なるヒト条件に関連している。本論文で提示されるモジュラーで実施しやすいスクリーニング方法論により、疾患のバイオマーカーとしてヌクレアーゼ活性を利用するための特異的核酸プローブを選択することができる。...

核酸プローブを用いたヌクレアーゼ活性の運動スクリーニング

本プロトコルは、等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、DNAアプタマーとテトラサイクリンの間の結合の会合および解離速度論を分析し、サンプル調製、標準およびサンプルの実行、および結果のデータの解釈を含むことを説明しています。...

等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

抗がんアプタマー開発に必要なステップは、標的への結合をテストすることです。この結合を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを実証し、ネガティブコントロールのアプタマーとその特定のタンパク質に対して陽性または陰性の癌細胞を含めることの重要性を強調しています。...

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

本プロトコルは、標的を検出するための高速3段階のアプタマーベースの指数増幅アッセイの使用を実証する。サンプル調製、シグナル増幅、および発色をカバーして、カフェインよりもテオフィリンの存在を認識するこのシステムを実装します。...

3段階G四重鎖等温指数増幅反応によるアプタマーベースのターゲット検出(英語)

このプロトコールでは、蛍光灯アプタマーDAP-10-42をシグナルレポーターとして利用するスプリットハイブリダイゼーションプローブの設計と、核酸検出および単一ヌクレオチド置換を持つターゲット間の分化への応用について概説します。...

DNA蛍光発光アプタマーをシグナルレポーターとして用いたスプリットハイブリダイゼーションプローブによる塩基配列特異的核酸解析

学ぶDNAアプタマーのin vitro選択と特性評価法。疎水性小分子に結合するグループ特異的アプタマーを選別し、電気化学アプタセンサーへの応用を通じて高感度検出システムを構築する手法を解説します。

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

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