テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

この方法は、ヒト細胞におけるRdRPまたはTERTの生物学的意義は何かなど、RNA生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、このアッセイが、細胞内で発現するヒトRdRP活性を検出する最初の高感度な方法として確立されていることです。この手順は、テキストプロトコールに記載されているHeLa細胞の調製から開始します。

細胞を10ミリリットルのPBSで一度洗浄します。次に、サンプルを1,450倍の重力で摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。1,000万細胞あたり1ミリリットルの氷冷Lysis Buffer Aを使用して、穏やかなピペッティングで細胞を溶解します。

1.5ミリリットルのチューブ内で、25%のソニケーター増幅でサンプルを10秒間超音波処理します。超音波処理後、サンプルを20、400倍の重力で摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を採取し、上清をそれぞれ1ミリリットルずつ1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

ライセート1ミリリットルあたり40マイクロリットルの洗浄済みプロテインA-アガロースビーズを添加して、ライセートを事前にクリアします。チューブを数回反転させてよく混ぜます。次に、サンプルを摂氏4度で30分間回転させます。

サンプルを重力の13, 000倍で摂氏4度で1分間遠心分離し、上清を回収します。次に、40マイクロリットルの洗浄済みプロテインA-アガロースビーズと10マイクログラムの抗ヒトTERT抗体を、事前に透明化したライセートに加えます。チューブを数回反転させてよく混合し、サンプルを摂氏4度で一晩回転させます。

重力3.300倍、摂氏4度で30秒間遠心分離した後、上清を除去します。次に、Wash Buffer Oneでビーズを洗います。ビーズに1ミリリットルのWash Buffer Oneを加え、チューブを反転させてよく混ぜます。

次に、サンプルを摂氏4度で5分間回転させます。サンプルを3,300倍の重力で摂氏4度で30秒間遠心分離します。上清を取り除き、この手順をさらに 3 回繰り返します。

テキストプロトコールに記載されているAGC溶液洗浄後、ビーズを60マイクロリットルのミクロコッカスヌクレアーゼ反応混合物に再懸濁することにより、ビーズをミクロコッカスヌクレアーゼで処理します。次に、ペルチェ型インキュベーターにセットしたシェーカーのターンテーブルで、サンプルを摂氏25度で15分間静かに振とうします。サンプルを重力の3,300倍で摂氏4度で30秒間遠心分離した後、上清を取り除きます。

最後に、3ミリモルのEGTAを含むAGC溶液でビーズを2回洗浄し、テキストプロトコルに記載されているように、ビーズをWash Buffer Twoで1回洗浄します。テキストプロトコルに記載されているように、新しいチューブでRdRP反応混合物を調製します。反応混合物にP dash 32でアルファリン酸基に標識された6マイクロリットルのウリジン三リン酸を添加し、ピペッティングでよく混合します。

次に、1マイクロリットルのテンプレートRNAを混合物に加え、よく混合します。得られたRdRP反応混合物の20マイクロリットルでビーズを再懸濁します。次に、ペルチェ型インキュベーターにセットしたシェーカーのターンテーブルで、サンプルを摂氏32度で2時間静かに振とうします。

インキュベーション後、5.4マイクロリットルの20ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼKと45.4マイクロリットルの2X プロテイナーゼKバッファーを反応混合物に加えます。ピペッティングで混合し、ペルチェ型インキュベーターでサンプルを摂氏37度で30分間振とうします。109.2マイクロリットルのRNaseフリー水をサンプルに加えた後、200マイクロリットルの酸性フェノールクロロホルムを加えます。

ボルテックスでよく混合してから、サンプルを室温で重力の100倍である21倍で5分間遠心分離します。水相を新しいチューブに移します。この手順を一度繰り返します。

次に、20マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウム、pH 5.2、4マイクロリットルの沈殿担体、および250マイクロリットルのエタノールを水相に加えます。チューブをよく振って混ぜます。サンプルを21、100倍の重力で摂氏4度で20分間遠心分離し、上清を捨てます。

次に、摂氏マイナス20度で保存されたエタノール容量あたり700%のエタノールを300マイクロリットルの冷たいエタノールで洗浄します。サンプルを21、100倍の重力で摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを風乾します。

ペレットを20マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。.テキストプロトコルに記載されているように、新しいチューブでRNase反応混合物を調製します。180マイクロリットルのRNase反応混合物をサンプルに加えます。

その後、チューブを摂氏37度で2時間インキュベートします。2.3マイクロリットルの10%容量/体積のSDSをサンプルに加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、20ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼKを2マイクロリットルをサンプルに加え、摂氏37度でさらに15分間インキュベートします。

次に、205マイクロリットルの酸性フェノール-クロロホルムをサンプルに加えます。前と同じように混合して遠心分離した後、水相を新しいチューブに移します。3モルの酢酸ナトリウム、沈殿担体、およびエタノールを水相に加え、続いて以前に行ったようにペレットを混合、遠心分離、および洗浄します。

ここに示されているのは、未操作細胞に対するノコダゾールまたはDMSOで処理されたHeLa細胞におけるIP-RdRPアッセイの3つの代表的な結果です。化学的に合成された34ヌクレオチドRNAをテンプレートとして使用しました。一晩の曝露後、RdRP産物は、特に有糸分裂期のHeLa細胞で、20〜30ヌクレオチドの間で観察されます。

このビデオを見れば、ヒトTERTのRdRP活性を検出する方法について十分に理解できるはずです。