高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

この方法は、細菌の細胞周期中にDNA構造がどのように変化するかなど、微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、追加の処理なしで、適切な時点で生きた状態に近い全細菌細胞の超微細構造を視覚化できることです。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるChihong Songさんと、金子先生の研究室の大学院生である林真子さんです。

まず、1.5%の寒天と0.3%のチオ硫酸ナトリウムを含む9cmの滅菌BG-11プレートでシアノバクテリアを培養します。プレートを摂氏23度で12-12光サイクルでインキュベートし、1平方メートルあたり毎秒50μEの光でインキュベートします。細胞を維持するために、毎週新鮮なBG-11寒天プレートに細胞を移します。

1週間以内に、カルチャーは緑色の帯として表示されます。炎滅菌ループを使用して細胞の緑色の塊を移し、新しいプレートに縞模様にします。DNAの圧縮を観察するには、光期の終わりに6日間培養した細胞を採取します。

プレートから細胞を放出するには、0.2モルのスクロースを1ミリリットル加えます。次に、細胞懸濁液を回収し、溶液が緑色に変わるまでショ糖の添加と除去を繰り返します。色の変化は、ほとんどのセルが解放されたことを示しています。

次に、500マイクロリットルの懸濁細胞溶液をマイクロチューブに移し、ヘキスト染色剤を添加して、最終濃度を1ミリリットルあたり1マイクログラムにします。その後、細胞を暗闇で10分間インキュベートします。次に、細胞をスピンダウンし、上清を捨てて、10マイクロリットルの0.2モルスクロースに再懸濁します。

次に、懸濁液1マイクロリットルをスライドガラスに移し、カバースリップを装着し、UVフィルターを装着した蛍光顕微鏡で細胞を観察します。100倍の油浸対物レンズを使用して、ほとんどの細胞で観察できるDNA圧縮の証拠を探します。まず、プランジ凍結装置を準備します。

次に、エタン容器と冷却ロッドアタッチメントを挿入して液体窒素容器をセットします。次に、容器に液体窒素を入れ、液体窒素温度まで冷却します。その後、エタンガスをコンテナにロードします。

液体エタンは爆発性があるため、必ず安全メガネを着用してください。最後に、冷却ロッドのアタッチメントを取り外し、霜が付着しないように容器をプラスチック製の蓋で覆います。次に、カーボンコーティングされたEMグリッドのカーボン側を、プラズマイオンバリアを使用して50ミリアンペアで30秒間グロー放電します。

次に、テストプロトコルに従ってVitrobotを準備します。ピンセットを使用して、前処理されたEMグリッドをチャンバーにセットします。EMグリッドを1マイクロリットル、15ナノメートルのBSA金トレーサーで処理し、サンプルを塗布する前に基準マーカーとして使用します。

次に、2.5マイクロリットルの細胞懸濁液をグリッドに分注します。濾紙を使用して余分な溶液を拭き取り、すぐにグリッドを液体エタンで凍結します。凍結したグリッドは、検査できるようになるまで液体窒素で保管してください。

次に、HVEMを起動し、1メガボルトの高電圧に設定します。次に、液体窒素を使用して試料グリッドホルダーをマイナス150°Cに冷却します。冷却したら、凍結したグリッドを冷却したクライオ試料ホルダーに取り付け、HVEMにロードします。

セットアップが氷で汚染されないように注意してください。次に、1, 000 倍の低倍率でイメージング領域を選択します。次に、ユーセントリックZ軸の高さを調整し、試料ステージをマイナス60度に傾けます。

次に、傾斜回転のバックラッシを取り除きます。次に、10, 000倍の倍率でターゲット位置の近くに焦点を合わせます。ピントの合った画像からの偏差により、6〜10ミクロンのアンダーフォーカスを設定します。

イメージングでは、線量を 2 電子/平方オングストローム/秒以下に設定します。電流密度で反射される電子線量に注意し、デジタルカメラや電子膜で撮影します。次に、負の 60 度から正の 60 度までの傾斜画像を 2 度から 4 度刻みで収集します。

可能であれば、顕微鏡の自動機能を使用してください。商用ソフトウェアパッケージを開き、断層撮影再構成用の傾斜画像をロードします。次に、コマンド tif2mrc または newstack を使用して、個々のイメージからイメージ・スタック・ファイルを作成します。

次に、eTomo GUIソフトウェアを起動し、ピクセルサイズ、基準直径、画像の回転などの画像パラメータを入力します。したがって、編集スクリプトを作成します。次に、推奨ソフトウェアを使用して、基準マーカーを使用して位置合わせされ、平均残差誤差が 0.5 未満の傾斜シリーズを作成します。

最後に、SIRT アルゴリズムを使用して 3D 断層撮影を再構築します。次に、断層撮影から関心領域を抽出し、異方性拡散フィルター、両側フィルター、数学的形態フィルターなどのノイズ除去フィルターを適用します。画像のコントラストを強化するパラメーターを使用してフィルタリングを実行します。

次に、関心のあるフィーチャをセグメント化します。スライス機能を使用して断層撮影を開きます。次に、セグメンテーションエディタウィンドウに移動し、新しいラベルフィールドを選択してセグメンテーションファイルを作成します。

次に、最初のスライスで目的のフィーチャの境界を手動でトレースし、次に他の各スライスでトレースします。関心のある追加機能は、同じ操作を使用して追加できます。次に、SurfaceGen メニューのオプションを使用してセグメント化されたボリュームを視覚化するサーフェス レンダリングを生成するには、SurfaceView メニューを選択します。

3D ボリュームを移動、回転、ズームインするには、3D Viewer ウィンドウのツールを使用します。自動セグメンテーションは、Magic Wand Toolを使用して実行できます。オブジェクトをクリックし、[表示] と [マスキング] のスライダーを調整して、オブジェクトの機能が完全に選択

精密な同期培養では、Hoechstで標識されたDNAは、暗所では正常な均一な分布を示し、その後、光期中に細胞内で徐々に圧縮し、光期の終わりまでに波状の棒状構造を帯びます。最後に、ロッドは中央で分裂し、その2つの部分は娘細胞に分配されます。細胞分裂後、圧縮されたDNAはすぐに消え、DNAは正常な均一な分布に戻ります。

DNA圧縮の最終段階にある細胞を凍結し、高電圧電子顕微鏡で観察したところ、多くの細胞が正常細胞と容易に区別できる明確なDNA圧縮を示しました。一部は、細胞分裂前に予想されたように、細胞の中心に狭窄を示しました。3D断層撮影から、コンパクトなDNAは細胞質内で目に見えて分離され、低密度の材料に囲まれています。

チラコイド膜層は、圧縮されたDNAの波状ロッドに沿って歪んでいます。興味深いことに、多くの小さなリン酸塩体が圧縮されたDNAに付着し、通常はペアで現れます。これらのポリリン酸体は、DNA合成のためのリン酸塩の供給者であり得る。

このビデオを見れば、染色などの追加処理を一切行わずに、クライオ高電圧電子顕微鏡により、適切な時点での生存状態に近い全細菌細胞の超微細構造を可視化する方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、光サイクルの終わりにDNAの圧縮状態が毎分変化することを覚えておくことが重要です。サンプルを凍結するのに最適なタイミングを見逃さないようにしてください。

この手順に続いて、圧縮されたDNA中の特定のタンパク質またはヌクレオチドの局在に関する追加の質問に答えるために、CLEMなどの他の方法を実行できます。この手法は、開発後、微生物学の分野の研究者が、細菌や小さな真核生物における細胞分裂、DNA分離、ウイルス感染を探求する道を開くはずです。