Name: 創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学ぶ、創薬スクリーニングのための高スループット三次元腫瘍回転楕円体培養法。1536ウェルプレートを使用し、がん細胞株を三次元で培養して生理学的に関連性の高いモデルを構築し、新規抗がん薬の同定を効率化します。

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著者は、彼のサポートとこれらのアッセイの初期の開発に関するガイダンスを進めるトランスレーショナル科学、健康の国民の協会の国立センターでマルク ・ フェレールを認めると思います。さらに、彼らの科学知識とプロジェクト チームのメンバーとの議論のためアリソン ・ フリーマン、マリエラ Jaskelioff、マイケル ・ アッカー、ヤコブ Haling、Vesselina ・ クックに感謝したいと思います。

1. 腫瘍 1536 ウェル 3 D 回転楕円体の培養
<ol><li>ダルベッコ変更イーグルス媒体 (DMEM/f12 キー) の 500 mL に次の試薬を追加して新鮮な 3 D 腫瘍回転楕円体中幹 (細胞培地 + ノックアウト血清交換 + インシュリン ・ トランスフェリン ・ セレニウム) を準備: 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン、人間の 10 ng/mL塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF)、ひと上皮成長因子 (EGF)、0.4% ウシ血清アルブミン (BSA) (一部分 V)、インシュリン ・ トランスフェリン-セレンと 1% のノックアウト (KO) 血清交換 (はない凍結融解) x 1 の 20 ng/mL。</li>
	<li>フィルター - 0.4 μ m ボトル上部フィルター システムを通じてサプリメントで培地全体を滅菌します。</li>
	<li>それらを洗浄することにより伝統的な細胞培養フラスコからの推奨されるルーチン培養条件に従って成長している癌セルラインをデタッチ 3 x 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 0.25% トリプシン (1 mL の適切な量を追加します。5 cm2) あたり細胞の薄層を作成する 5 分間。血清を含む培地の量 × 5 とトリプシンを中和し、セルをカウントに進みます。たとえば、5 ml のトリプシン 25 mL の培地を使用します。</li>
	<li>1536 ウェル組織文化処理板に回転楕円体中の 8 μ L の井戸あたり 500 セルの合計をシードするために4セル/mL の 10 x 62.5 に細胞液の濃度を調整します。</li>
	<li>生物学的安全キャビネット、蠕動ポンプがベース システムと滅菌、小さなステンレス鋼先端のカセットを使用してセルをシードします。別のセル行の間フラッシュ 1 × PBS と 70% とカセットのチューブ 10 用エタノール s。</li>
	<li>また、滅菌、小さなステンレス鋼先端カセットと蠕動性ポンプまたは枚必要なセルの行の数によっての接続されたシリンジ ポンプ使用 HEPA フィルターの部屋内にある液体ハンドラーを使用してセルをシードします。</li>
	<li>どちらか通気性粘着プレート シールを使用して手動でまたはプレート シーラーを使用してプレートをシールします。</li>
	<li>10 rpm と 5% の二酸化炭素 (CO2) と相対湿度 95% の 37 ° C に設定回転インキュベーターにプレートを配置します。3 d のフォームに回転楕円体を許可します。</li>
</ol>2. 1536 ウェル 2D 癌細胞株の培養
注: 1536 ウェル 2 D がん線を 3 D プレートに化合物の付加の前に 24 時間培養する必要があります。
<ol><li>選択した行の適切な成長培地 500 mL に次の試薬を追加して 2 D がん細胞の培地を準備: ペニシリン/ストレプトマイシンと 10% ウシ胎児血清 (FBS) × 1。</li>
	<li>フィルター - 0.4 μ m ボトル上部フィルター システムを通じてサプリメントで培地全体を滅菌します。</li>
	<li>それらを洗浄することにより伝統的な細胞培養フラスコからの推奨されるルーチン培養条件に従って成長している癌セルラインをデタッチ x PBS と 0.25% トリプシン (5 cm2あたり 1 mL) の適切な量を追加する 5 分の 1 と 3 倍セル上の薄層を作成します。血清を含む培地の量 × 5 とトリプシンを中和し、セルをカウントに進みます。たとえば、5 ml のトリプシン 25 mL の培地を使用します。</li>
	<li>1536 ウェル組織文化処理板に完全培地の 8 μ L の井戸あたり 500 セルの合計をシードするために4セル/mL の 10 x 62.5 に細胞液の濃度を調整します。</li>
	<li>生物学的安全キャビネット、蠕動ポンプがベース システムと滅菌、小さなステンレス鋼先端のカセットを使用してセルをシードします。異なる細胞間フラッシュ滅菌 PBS と 70% × 1 カセットのチューブ 10 用エタノール s。</li>
	<li>また、滅菌、小さなステンレス鋼先端カセットと蠕動性ポンプまたはセルごとプレートの量に応じて、添付のシリンジ ポンプを使用してロボットの HEPA フィルター部屋内にある液体ハンドラーを使用してセルをシードします。必要な行。</li>
	<li>どちらか通気性粘着プレート シールを使用して手動でまたはプレート シーラーを使用してプレートをシールします。</li>
	<li>10 rpm と 5% CO2と 95% 相対湿度と、化合物の添加前に 24 h の 37 ° C に設定回転インキュベーターにプレートを配置します。</li>
</ol>3. 化合物添加
<ol><li>10 mM トップ濃度液体ハンドリング ロボットの 100% ジメチルスルホキシド (DMSO) における MAPK の阻害剤の 8 ポイント、3 倍連続希釈液を準備します。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブは、完全な細胞アッセイのダイナミック レンジを決定する殺害のポジティブ コントロールとして使用されます。</li>
	<li>クイック スピンすべてアッセイ プレートおよび結露を収集する 100 x g で複合板。各板から粘着のシールを外して、8 の合計を追加する音響ディスペンサー セットアップ上プレート ウェルあたり 0.1 %dmso の最終濃度と 10 μ M の最上化合物線量を表す各化合物/希釈の nL。</li>
	<li>化合物の添加が完了した後は、プレート上の蒸発を防ぎ、5 d、5% CO2と 95% 相対湿度の 37 ° C で回転の定温器にプレートを置きオーダーメイドのステンレス製細胞文化ふたを配置します。</li>
</ol>4. 検出試薬の追加と生データの獲得
<ol><li>あらかじめ暖かい室温で増殖、37 ° C の水浴アデニン三リン酸 (ATP) の変更と、つまり、変更を検出するためルシフェリンを含むセル換散試薬の適切なボリューム。蠕動ポンプを使用しても検出試薬の 3 μ L の合計を追加し、少なくとも 15 分間室温でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>プレート ルミノの発光をキャプチャします。</li>
</ol>5 データ処理
<ol><li>計測器から生データを抽出し、ニュートラル制御として単独で DMSO を含むすべての井戸のなかにテスト化合物を含むすべてのフィールドを正規化します。この値は、各化合物のパーセントの成長阻害を算出します。Microsoft Excel で数式関数を使用が完了すると、 f (x) = {(サンプルの値の相対的な光の単位 (RLUs)/(平均 DMSO 値 RLUs) * 100)}。</li>
	<li>グラフのプログラムを使用して化合物の濃度に対して手順 5.1 から正規化されたデータの値をグラフ化して用量-反応曲線と抑制 IC50s を生成します。 注: ヘリオス、内部の NIBR ソフトウェア ツールを使用してデータ分析を行った。この関数を完了するには、ノンパラ メトリック曲線分析ツールを選択しました。</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

著者は、ノバルティス社の社員、何人かの従業員も株主です。

紹介した方法は、大規模化合物スクリーニングのための 1536 ウェル プレートで腫瘍を回転楕円体を生成する方法の詳細なプロトコルを示します。これらのメソッドは当初腫瘍回転楕円体が遺伝的依存関係および化合物の感度13,について質問をする 6 ウェルや 96 ウェルのプレートの低スループット試金で育った国立がん研究所での仕事から合わせられました。14,15します。 このプロトコルの重要な機能は、回転楕円体は、1536 プレートを使用して定義されている伝統的な 2 d の組織培養細胞から形成されている SCM + KO + ITS と呼ばれるメディアです。セルのシードは、一度 3 d 回転楕円体形成の期間にわたって任意の蒸発を防ぐために通気性のある接着プレート シールでシールされます。回転楕円体は、このアプローチの16を使用して時間の長い期間も培養することができます。球形成の 3 d は、化合物が 5 d の試...

過去 10 年間より多くの研究は、プラスチックで 2 D のセルの成長によって完全に締めくくっているない概念を理解する 3 D 細胞培養モデルの使用を実装しています。これらの概念の例としては、生存率と細胞の運命を制御する細胞外のマトリックスの役割と同様、細胞の樹状突起と基底層の空間的なオリエンテーションが失われ、正常な上皮細胞極性1交替。特に、腫瘍学研究は、がん細胞と 2 D と 3 D 細胞培養システム3,4の違いの基本的な生物学を理解するのに 3 D モデルを使用います。高度な細胞培養の技術とウェル フォーマットへ彼らのさらに適応の開発は、3 D 設定で新しい薬剤のための検索を可能にしました。階層型セルラー システム5から異なるサイズの単一細胞型球を複雑腫瘍範囲の 3 D モデル、2 D 条件の下で複雑なマルチ マルチセル型球6,7,細胞とは対照的8します。 新規化合物または強力これら 3 d モデル システムの細胞死を誘発する生物学的製剤の発見は、したがって、薬物開発キャンペーンで高金利。これらのアッセイのエンドポイントは通常は細胞増殖の変化を評価するために 2D 文化で実行されるものと同じ、彼らはターゲット遺伝子や経路中の依存性の本当のレベルを明らかにするかもしれないときにもっと生理学的に関連する設定で実施し、尋問。
3次元培養系における薬物応答を検討するさまざまなモデル システムを開発されていると上記で紹介したが、大半どちらか 96 または 384 ウェルのマイクロ プレートを使用でよく使われる高スループットス クリーニング (HTS) 形式に容易に適応しません。薬物探索スクリーニング キャンペーン。このようなシステムは、液滴技術、回転楕円体の文化、天然または合成ゲル コラーゲン、マトリゲル、ポリエチレング リコール (PEG)2 などを組み込んだ浮上、文化を誘発する磁性粒子と細胞を脈動をぶら下げの使用を含む.1536 ウェル プレート形式で確立された細胞株から 3 D 回転楕円体文化を生成する手法の開発済みの詳細な方法を紹介します。このプロトコルでは、通常付着性のセル行9の添付ファイルを防止する非常に定義された媒体が使用されます。このシステムの制限があります (すなわちがんの複雑なモデル システムに完全に要約するだろうことはできません)、それにもかかわらず、これらの試金は低分子化合物の大規模なコレクションおよび薬剤応答の横比較のハイスループットス クリーニングを有効にします。間細胞および化合物のさまざまな 2D および 3D の文化。
細胞株は MAPK シグナル伝達経路は非常に癌の調節不全を経路に関係する遺伝子の突然変異港すべてこの資料の方法を示すが選択し、多くの治療法があります。路線の多くがあるもと呼ばれ、KRA、神経芽細胞腫 RAS または nras 登録で、ハーヴェイ ラット肉腫ウイルスの癌遺伝子または HRA、関連するキナーゼ、急速に加速する Fibrosarcomas として知られているキルステン ラット肉腫ウイルス発癌性突然変異をアクティブにします。Raf。最近の文献では、この経路の異なるノードの阻害剤は、3 D の条件9,10の下で育てられたときの細胞のサブセットの一意により効果があることを示唆しています。1 つの研究が見つかりました 3 D でアクティブな RAS 癌細胞培養、それら MAPK の阻害剤への感受性の増加を示したし、さらに、このアプローチは経路を識別することができるし、伝統的な 2 D で逃したかもしれない阻害剤を対象と設定します。本研究の目的はこれらの細胞株を培養するために使用方法を提示する、さらに、差分を示す 3 D を使用して場合にのみに観察することができますこれらの阻害剤への応答細胞培養システム。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>調製済み溶液として購入しました。このレシーペは、他のベンダーと比較して好ましいことがわかりました。</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>調製済み溶液として購入しました。</td></tr><tr><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)</td><td>ロンザ</td><td>12-115Q</td><td>調製溶液として購入。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>調製溶液として購入しました。</td></tr><tr><td>1x 0.25% トリプシンとエチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>調製済み溶液として購入しました。</td></tr><tr><td>1x ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>調製溶液として購入しました。</td></tr><tr><td>10 ng/mL ヒト塩基性線維靭性成長因子(bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>滅菌水に再懸濁します。</td></tr><tr><td>20 ng/mL ヒト上皮成長因子(EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>滅菌水に再懸濁します。</td></tr><tr><td>0.4% ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>滅菌PBSに再懸濁し、ろ過します。</td></tr><tr><td>1x インスリントランスフェリンセレン (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% ノックアウト (KO) 血清交換</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>使用直前に新鮮なものを追加してください。</td></tr><tr><td>100%ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>調製済み溶液として購入しました。</td></tr><tr><td><強力>消耗品</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型コンビカセット</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>小型マルチフローカセット</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536ウェル滅菌TCプレート(白)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>1536ウェル滅菌TCプレート(黒)</td><td>Corning</td><td>3893</td><td></td></tr><tr><td>Scivaxプレート</td><td>MBLインターナショナル</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接着剤シールサー</td><td>モフィ</td><td>ッシャーAB0718</td><td></td></tr><tr><td>スピニングインキュベータ</td><td>ーLiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼蓋ノ</td><td>バルティス研究財団のゲノミクス研究所(GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSアコースティックディスペン</td><td>サーEDSBiosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispensor</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ-Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リキッドハンドラー-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

プラスチックの表面を 2 次元 (2 D) 中がん細胞で培養されたが日常的に。この手法は、しかし、欠けている腫瘍の真の環境質量は、 in vivoにさらされています。固形腫瘍はプラスチック、関連付けられているシートではなく育つが、三次元 (3 D) のクローン細胞のコレクションとして代わりにスペースの彼らの隣人と正常細胞の極性の中断などの空間特性の相互作用します。これらの相互作用を引き起こす 3 D 培養細胞の生体内で腫瘍により関連している形態学的および細胞の特性を獲得します。さらに、腫瘍間質と免疫細胞だけでなく、他のすべてのセル型から細胞外マトリックスなど他の細胞型との直接接触、質量。堆積したマトリックスは、コラーゲンとフィブロネクチンなどの高分子で構成されます。
ベンチから枕元に腫瘍学の研究成果の翻訳を向上しようとして、多くのグループは、医薬品開発戦略における 3 D モデル システムの使用を調査し始めています。これらのシステムは、彼らは腫瘍の複雑な異機種混在環境を再現しようと思うのでもっと生理学的に関連すると考えられます。これらのシステムはしかし、非常に複雑にすることができますが 96-ウェル フォーマットおよび 384 でも今いくつかの成長に従う、彼らは大規模な成長とスクリーニングのためのいくつかの選択肢を提供します。これは、観察のギャップは、1536 ウェル プレートの高スループット能力における文化腫瘍スフェロイドを詳しくここで説明する方法の開発につながっています。これらのメソッドは、画面、および従来の 2 D の試金することは困難である非常に複雑な行列ベース システムに妥協を表します。さまざまな遺伝的変異を異なるがん細胞は Mitogen-Activated 蛋白質キナーゼや MAPK 経路をターゲット化合物の精選されたライブラリを使用して化合物の有効性を調べること、正常に上映されます。スフェロイド培養反応を比較する、2次元の成長細胞の応答と差分の活動が報告されます。これらのメソッドは、高スループットの 3 D 設定の複合アクティビティをテストするための独自のプロトコルを提供します。

2次元培養条件下でよく成長する知られている行は、ここで説明した方法を使用してテストされた確立されたがん細胞の様々 な。細胞株における MAPK 変異癌のさまざまなから代表的なイメージ (Calu-6:KRAS、NCI-H1299:NRAS、SK-メル-30:NRAS と教訓集-62:HRAS)図 1に示します。これらの画像は、その細胞株には、様々 な形態があるが、それぞれに形成された 3 D 構造 1536 ウェル アッセイ プレートを示しています。図 2は、ことを示します、大規模スクリーニングを行う際文化 3 D、2 D対で栽培間差分化合物の感度を観察できます。グラフの各ドットを表す 1 つの化合物の阻害濃度 50% セル殺害または両方の設定で化合物の IC50 応答があります。効果はさまざまなメディアによってもっぱらプロテストを示すため、Calu 6 セルは、2 D の組織培養プレートまたは添付ファイルを防ぐため 3 D Sciva...

さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース システムで上映することができますどのように立体化腫瘍を示しています。

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

この方法は、ヒットからリードへの同定に最も関連性の高い組織培養設定は何かなど、創薬分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1536ウェルプレートを使用して、細胞を3次元で高スループットで培養できることです。このプロトコルを実証するのは、私の研究室の上級科学者であるKalyani Gampaです。3D腫瘍スフェロイド培養をセットアップするには、BBSを3回洗浄して目的のがん細胞株を分離します。続いて、培養フラスコの5センチメートル二乗面積あたり1ミリリットルのトリプシンが追加されます。5分後、各フラスコに5倍の量の血清補充培地でトリプシンを中和し、細胞をカウントします。.ペリスタルティックポンプベースのシステムを備えた滅菌済みの小型ステンレス製先端カセットを使用して、8マイクロリットルのスフェロイド培地に合計500個の細胞を1,536ウェル組織培養処理プレートの各ウェルに播種します。次に、通気性のある粘着プレートシールを使用してプレートを覆います。そして、プレートを摂氏37度、10rpmに設定された回転インキュベーターに5%の二酸化炭素と95%の相対湿度で3日間置きます。最も重要なステップは、プレートをインキュベーターに入れる前に、プレートがしっかりと密閉されていることを確認することです。スフェロイドの形成には3日かかりますが、このステップにより培地の蒸発が防止されます。インキュベーションの終了時に、がんが並ぶ培養プレートを重力100倍で素早く回転させて結露を収集し、接着シールをはがします。処理する各プレートを、各化合物の合計8ナノリットルを供給するようにセットアップされた音響ディスペンサーに置きます。ウェルあたり最終濃度0.1%DMSOまで希釈し、最大化合物用量を10マイクロモルとします。化合物が適切なプレートに追加されたら、蒸発を防ぐためにカスタムメイドのステンレス製細胞培養蓋を各プレートに置き、プレートをさらに5日間回転インキュベーターに戻します。インキュベーションの終了時に、ルシフェリンを添加した3マイクロリットルの予熱細胞溶解試薬を各細胞培養プレートの各ウェルに加えます。そして、プレートを室温で少なくとも15分間インキュベートします。次に、プレートルミノメーターでATPルミネシスをキャプチャします。すべてのプレートを分析したら、装置から生データを抽出し、中性コントロールとして、試験化合物を含むすべてのフィールドをDMSOのみを含むすべてのウェルの平均に正規化します。次いで、各化合物の増殖阻害率を式に従って計算することができ、用量反応曲線、および阻害性IC50を生成することができる。2D培養条件下でよく増殖することが知られているさまざまな確立されたがん細胞も、形態学的な違いにもかかわらず、先ほど示したように培養すると3D構造を形成しました。大規模なスクリーニングに使用すると、2Dで増殖した培養物と3Dで培養した培養物の間で異なる化合物感度が観察されます。各ドットは、両方の培養環境で50%の細胞死滅応答が観察される単一の化合物の阻害濃度を表しています。この代表的な実験では、試験した両方のRAFキナーゼ阻害化合物は、KRASタンパク質に活性化変異を有する非小細胞肺がん株培養の3D条件でより強力でした。しかし、これらの化合物は、KRASにG13D活性化変異を含む3Dスフェロイドと2D結腸がん株の両方の培養で同様の効力を示します。3Dアッセイはまた、薬物の低濃度での細胞増殖によって証明されるように、高活性化RAF変異株でRAF二量体の不完全な阻害がある場合に発生する逆説的な成長活性化現象の観察を可能にする、それは高濃度で抑制される。開発後、この技術は、がん治療薬の分野の研究者が、既知の標的に対して新しい有効な化学物質を特定するための代替培養条件を探求する道を開きました。

generation-high-throughput-three-dimensional-tumor-spheroids-for-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

我々は、市販のマイクロウェルプレートを使用して、均一なサイズや組成制御の腫瘍スフェロイドの大量（数十万、何千）の生成のためのプロトコルを紹介する。...

マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

水性二相システムを使用して、がん細胞スフェロイドをハイスループット96ウェルプレートフォーマットでロボット印刷するためのプロトコールが紹介されています。...

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

患者由来の多形性膠芽腫の異種移植片は、3Dヒトバイオゲル培養システムを使用して生きた微小腫瘍に小型化することができます。このin vivo様3D腫瘍アッセイは、薬物反応試験やキノミクス解析を含む分子プロファイリングに適しています。...

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

光コヒーレンストモグラフィ...

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。...

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

このプロトコルは、大規模なハイコンテンツスクリーニングおよび分析に適した方法で3つの異なるタイプのスフェロイドを製造する方法を詳述する。さらに、回転楕円体および個々の細胞レベルでそれらをどのように分析できるかを示す例を提示する。...

ハイコンテンツスクリーニングおよび分析アプリケーションのためのスフェロイドの大規模生産のための堅牢な方法

腫瘍スフェロイドは、腫瘍細胞と微小環境の相互作用および治療応答を評価するためにますます利用されつつある。本プロトコルは、迅速な光学的クリアリングを用いた3D腫瘍スフェロイドの半ハイスループットイメージングのための堅牢かつ簡単な方法を記載する。...

腫瘍スフェロイドの半ハイスループット分析のための迅速な光学的クリアリング

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。...

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

ここでは、3次元(3D)神経膠腫スフェロイドと細胞外フラックス分析によるイメージングベースの正規化を統合した代謝プロファイリングプラットフォームを確立します。このアプローチにより、薬物治療に対する腫瘍代謝反応をより正確に評価できるようになり、耐性の潜在的なメカニズムについての洞察が得られます。...

薬物スクリーニングのための三次元脳腫瘍スフェロイドの代謝プロファイリングの進歩

学ぶ、創薬スクリーニングのための高スループット三次元腫瘍回転楕円体培養法。1536ウェルプレートを使用し、がん細胞株を三次元で培養して生理学的に関連性の高いモデルを構築し、新規抗がん薬の同定を効率化します。

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

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