創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成
2018年9月5日
さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース システムで上映することができますどのように立体化腫瘍を示しています。
この方法は、ヒットからリードへの同定に最も関連性の高い組織培養設定は何かなど、創薬分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、1536ウェルプレートを使用して、細胞を3次元で高スループットで培養できることです。このプロトコルを実証するのは、私の研究室の上級科学者であるKalyani Gampaです。
3D腫瘍スフェロイド培養をセットアップするには、BBSを3回洗浄して目的のがん細胞株を分離します。続いて、培養フラスコの5センチメートル二乗面積あたり1ミリリットルのトリプシンが追加されます。5分後、各フラスコに5倍の量の血清補充培地でトリプシンを中和し、細胞をカウントします。.
ペリスタルティックポンプベースのシステムを備えた滅菌済みの小型ステンレス製先端カセットを使用して、8マイクロリットルのスフェロイド培地に合計500個の細胞を1,536ウェル組織培養処理プレートの各ウェルに播種します。次に、通気性のある粘着プレートシールを使用してプレートを覆います。そして、プレートを摂氏37度、10rpmに設定された回転インキュベーターに5%の二酸化炭素と95%の相対湿度で3日間置きます。
最も重要なステップは、プレートをインキュベーターに入れる前に、プレートがしっかりと密閉されていることを確認することです。スフェロイドの形成には3日かかりますが、このステップにより培地の蒸発が防止されます。インキュベーションの終了時に、がんが並ぶ培養プレートを重力100倍で素早く回転させて結露を収集し、接着シールをはがします。
処理する各プレートを、各化合物の合計8ナノリットルを供給するようにセットアップされた音響ディスペンサーに置きます。ウェルあたり最終濃度0.1%DMSOまで希釈し、最大化合物用量を10マイクロモルとします。化合物が適切なプレートに追加されたら、蒸発を防ぐためにカスタムメイドのステンレス製細胞培養蓋を各プレートに置き、プレートをさらに5日間回転インキュベーターに戻します。
インキュベーションの終了時に、ルシフェリンを添加した3マイクロリットルの予熱細胞溶解試薬を各細胞培養プレートの各ウェルに加えます。そして、プレートを室温で少なくとも15分間インキュベートします。次に、プレートルミノメーターでATPルミネシスをキャプチャします。
すべてのプレートを分析したら、装置から生データを抽出し、中性コントロールとして、試験化合物を含むすべてのフィールドをDMSOのみを含むすべてのウェルの平均に正規化します。次いで、各化合物の増殖阻害率を式に従って計算することができ、用量反応曲線、および阻害性IC50を生成することができる。2D培養条件下でよく増殖することが知られているさまざまな確立されたがん細胞も、形態学的な違いにもかかわらず、先ほど示したように培養すると3D構造を形成しました。
大規模なスクリーニングに使用すると、2Dで増殖した培養物と3Dで培養した培養物の間で異なる化合物感度が観察されます。各ドットは、両方の培養環境で50%の細胞死滅応答が観察される単一の化合物の阻害濃度を表しています。この代表的な実験では、試験した両方のRAFキナーゼ阻害化合物は、KRASタンパク質に活性化変異を有する非小細胞肺がん株培養の3D条件でより強力でした。
しかし、これらの化合物は、KRASにG13D活性化変異を含む3Dスフェロイドと2D結腸がん株の両方の培養で同様の効力を示します。3Dアッセイはまた、薬物の低濃度での細胞増殖によって証明されるように、高活性化RAF変異株でRAF二量体の不完全な阻害がある場合に発生する逆説的な成長活性化現象の観察を可能にする、それは高濃度で抑制される。開発後、この技術は、がん治療薬の分野の研究者が、既知の標的に対して新しい有効な化学物質を特定するための代替培養条件を探求する道を開きました。
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概要
本記事では、ハイスループットな1536ウェルプレートシステムで培養した3次元腫瘍スフェロイドを用いた、創薬のための新しい手法を紹介します。このアプローチは、潜在的な腫瘍学薬を特定する際の組織培養設定の妥当性を高めることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 腫瘍学
- 創薬
- 細胞培養技術
背景
- 従来の二次元細胞培養では、腫瘍微小環境を再現できないことが多くあります。
- 三次元培養は、がん研究においてより生理学的に適切なモデルを提供します。
- 効率的な創薬には、ハイスループットスクリーニングが不可欠です。
- 本研究では、腫瘍スフェロイドの培養の最適化に焦点を当てています。
研究の目的
- 腫瘍スフェロイドを培養するためのハイスループット法の開発。
- 創薬における本モデルの有用性の評価。
- 新たな抗がん剤の同定の促進。
使用された手法
- BBS洗浄によるがん細胞株の剥離。
- トリプシンを用いた細胞の剥離と、血清添加培地による中和。
- 1536ウェルプレート形式での細胞培養。
- ハイスループット方式による潜在的な候補薬のスクリーニング。
主な結果
- 本手法により、3D腫瘍スフェロイドの効率的な培養が可能になります。
- ハイスループット機能により、薬物候補物質の迅速なスクリーニングが可能です。
- 創薬における3D培養モデルの有用性が実証されています。
- ヒット化合物からリード化合物の同定に至るプロセスの改善が期待されます。
結論
- この3D腫瘍スフェロイド培養法は、創薬研究を促進します。
- これにより、腫瘍生物学をより正確に再現することが可能になります。
- このアプローチは、新たな腫瘍学治療法の同定につながる可能性があります。
よくある質問
業界における重要性
この手法は、生理学的に妥当な3D腫瘍スフェロイドモデルでのハイスループットスクリーニングを可能にすることで、腫瘍学の創薬におけるトランスレーショナルギャップを解消します。2Dおよび3D培養条件下での薬剤応答の差を明らかにすることで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。このアプローチにより、遺伝的に定義されたがんモデルにおけるMAPK経路阻害剤のヒット・トゥ・リード同定が促進されます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 3D細胞間相互作用および空間的組織化を再現した疾患関連システムにおいて、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 2D培養と3D培養における化合物の有効性を比較し、コンテキスト依存的な活性を特定することで、メカニズム面でのリスク低減をサポートする。
- 予測的価値： 3D条件下でのKRAS変異非小細胞肺癌モデルにおける感度の差を検出することで、リード化合物の同定を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 大規模な化合物スクリーニングに適した1536ウェルフォーマット互換の、標準化され再現性のある3D培養システムを提供する。
- 運用の価値： ATPベースの定量的な発光読み取りにより、増殖抑制を測定し、用量反応曲線およびIC50値を算出することを可能にする。
- アッセイの準備： アコースティックディスペンサーを用いてナノリットル単位で正確に化合物を分注し、封印インキュベーションによって蒸発を防ぐことで、アッセイの完全性を確保する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：腫瘍とストロマの相互作用および細胞外マトリックス様条件をスケーラブルな形式でモデル化することにより、基盤研究と前臨床ワークフローを橋渡しします。
- リスク調整済み進展：RAFダイマー変異体における逆説的な増殖活性化の観察を可能にし、併用療法戦略への情報提供および臨床候補物質のリスク低減を実現します。
- バイオマーカーの整合性：遺伝学的に定義された背景における経路特異的阻害剤（例：MAPK）の評価をサポートし、遺伝型と薬物反応を相関させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットの検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、前臨床段階への投資を行う前に、より生理学的に適切な条件下で化合物の有効性を早期に評価することを可能にします。
- 探索生物学：KRAS変異NSCLCなどのオンコジンドリブンモデルにおいて、3D培養が薬物感受性をどのように変化させるかを明らかにすることで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：制御されたインキュベーションおよびシーリングプロトコルを用いた1536ウェルプレートでの標準化されたスフェロイド形成により、アッセイの準備状態と再現性を実現します。
- 分析：DMSOコントロールに対するATPルミネッセンスの正規化を通じて、定量的な従属変数の測定を可能にし、IC50の算出および比較効力分析を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：2Dシステムでは欠落している腫瘍の空間的構造およびクローン間相互作用をモデル化することで、前臨床段階への連続性を構築します。
- エンタープライズ再利用：MAPKなどの保存された経路を標的とする多様ながん細胞株および化合物ライブラリのスクリーニングに利用可能な、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 2Dおよび3Dの薬物応答を直接比較することで機序的な曖昧さを低減し、予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値： ロボット対応の1536ウェルプレートワークフローと密閉インキュベーションにより、標準化、再現性、および拡張性を実現する。
- 戦略的価値： コンテキスト特有の活性を持つ化合物を特定することで、go/no-go決定を改善し、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： 生理学的に適切なモデルにおける有効性の差に基づき、リスク調整済みのリード化合物の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- トリプシンの中和、細胞計数、および無菌的な播種を含む、3D細胞培養技術の専門知識が必要です。
- ペリスタルティックポンプベースのカセットシステム、アコースティックディスペンサー、回転インキュベーター、およびプレートルミノメーターなどの器具に依存します。
- シーリングプロトコル、インキュベーションパラメータ（37°C, 10rpm, 5% CO2, 95% humidity）、およびデータ正規化手順について、チーム間での標準化が必要です。
- 確立された細胞株で形成に成功しても、スフェロイドの形成効率は異なる可能性があるため、異なるがん細胞株への適応に関する検討が含まれます。
- 長時間のインキュベーション中の蒸発防止の必要性や、ナノリットル量での化合物投与の最適化などの実用的な制限が含まれます。
