マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

次の実験の全体的な目標は、均一なサイズで制御された腫瘍スフェロイドを大量に生成することです。これは、最初にマイクロウェルプレートを調製して、形成する細胞をステロイドにクラスター化することによって達成されます。第2のステップとして、所望の細胞型の培養物を回収し、それによりOIDのサイズおよび組成を決定する細胞懸濁液を提供する。

次いで、細胞懸濁液をマイクロウェルに遠心分離し、ステロイドを形成するためにインキュベーションする。得られたステロイドは非常に均一であり、それらが形成されたマイクロウェルで収集または培養することができます。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、非常に多数の均一な凝集体を同時に作ることができることです。

この方法に不慣れな人は、燃料のサイズが非常に大きいことに気付くかもしれません。セル懸濁液がプレート全体に均等に分散されていること、および中央のフージのスイングプレートキャリアが自由に動くようにして、力が表面に対して垂直になるようにすることが重要です。まず、各ウェルに0.5ミリリットルの界面活性剤含有リンス溶液を加えて、滅菌アグロウェル400プレートを準備します。

界面活性剤を使用すると、細胞がマイクロウェル表面と相互作用しないようにします。マイクロウェルに気泡が閉じ込められないように、片側に液体を追加し、表面に垂直に落とすのではなく、表面全体に広がるようにします。溶液をウェルに追加した後、蓋を元に戻します。

プレートを2000回で2分間遠心分離する前に、ローターが適切にバランス G.To とれていることを確認してから、低倍率倒立顕微鏡を使用して気泡を除去し、マイクロウェルから気泡が除去されたことを確認します。蓋をした状態でプレートを室温で少なくとも30分間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。ウェルからすすぎ液を吸引し、使用直前にプレートを滅菌水またはPBSで洗浄します。

コーディング後、プレートを乾燥させないでください。細胞調製の詳細は、研究対象の特定の細胞タイプによって異なります。しかし、我々は、この状態が、ここで論じた系統だけでなく、ヒトおよびニューロン胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、線維芽細胞、推定細胞、原始エンドン細胞、および間質細胞を含む広範囲の細胞に対して有効であることを観察した細胞を調製するために、HT29細胞のT75フラスコから始める。

フラスコから増殖培地を吸引し、3ミリリットルのトリプシンを加えます。細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。トリプシンの消化を止めるために、3ミリリットルの成長培地を加えます。

残りを15ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、15ミリリットルのチューブから、細胞計数用のアリコートを取り出します。遠心分離の進行中に、細胞を200倍Gで5分間遠心分離します。

セルを数えます。次に、tryin培地混合物を吸引し、新鮮な成長と交換します。任意のステップとしてテキストプロトコルに記載されているように、以前に計算された必要な細胞密度によって決定される容量の培地。

細胞懸濁液をストレーナに通して、塊を取り除きます。スフェロイドは、さまざまな培地製剤で生成することができますが、最初の試験は細胞を培養した培地を使用して実施する必要があります。三次元培養システムへの移行による影響と培地組成の変更による影響を区別するために、まず、各ウェルに0.4ミリリットルの増殖培地を2000回で2分間遠心分離 G.To、低倍率倒立顕微鏡で気泡を除去し、マイクロウェルから気泡が除去されたことを確認します。

次に、必要な密度の0.4ミリリットルの細胞懸濁液をマイクロウェルに加えます。次に、マイクロウェルに気泡を導入せずにピペッティングで上下させて穏やかに混合し、細胞がウェル全体に均一に分布していることを確認します。一貫したステロイドを得るため。

プレートを200回で5分間遠心分離します。G、プレートは、重量がプレートキャリアの両側に均等に分散されるように、プレートは他のプレートに対して内部でバランスをとる必要があります。これにより、遠心分離中にプレートが自己水平になるため、対流電流が発生してマイクロウェル全体に細胞が不均一に分布することがなくなります。

倒立顕微鏡を使用して、細胞がマイクロウェル内に集まっていること、および細胞がウェル全体に均一に分布していることを確認します。その後、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。スフェロイド形成の過程を倒立顕微鏡で観察します。一部の細胞株は、24時間以内にコンパクトなステロイドを形成します。

それ以外のものはもっと時間がかかるかもしれません。HT 29細胞のクラスターから凝集体への進行をここに示しています。この手順の最も難しい部分は、構造を乱すことなくインテックスステロイドを取り出すことです マイクロウェルからステロイドを抽出するには、スフェロイドが非常に穏やかに上下にピペットで動き、スフェロイドがマイクロウェルから出てくるようにします。

次に、プレートを傾けて中程度のステロイド混合物を吸引します。ステロイドの分解を避けるために、より大きなサイズのステロイドには幅の広いオリフィスピペットチップを使用してください。マイクロウェルからステロイドを回収した後、ピペットで静かに噴射して懸濁培養

あるいは、シビアローズは、中程度の交換で発作状態を維持することができます。期間は、初期サイズと成長率によって異なり、マイクロウェルを超えるまでの時間を定義します。まあ、彼らは形成されました ステロイドを失うことなく媒体を置き換えるために。

ウェルの端で培地を吸引します。牧草地のピペットを使用して、先端をゆっくりと下げて、半月板から液体を吸い込み始め、半月板が下がるのを追いかけます。次に、同じ場所の井戸の壁に対して新しい培地を追加します。

新鮮な培地を追加するときは、ピペッターをそっと押し、チップを壁に当てたままにして、マイクロウェル内のPHEの乱れを防ぐことを忘れないでください。いくつかのステロイドが失われる可能性があります。ただし、媒体を常に吸引して同じ位置で交換する場合、この数は少ないままです。

井戸の多数のステロイドと比較して、異なる解剖学的起源の複数の腫瘍ラインからのステロイドは、懸濁液に容易に抽出することができます。この方法で得られる一貫したサイズ制御は、非常に均一なステロイド集団でここで実証されています。各条件下では、700または1, 500個の細胞から形成されました。

HT 29結腸がん細胞とTE6食道がん細胞が、境界がはっきりとした密集したステロイドを形成することで、挙動の明確なインターラインの違いも見られます。逆に、リンキャップ前立腺癌細胞は、不規則な境界を持つ一貫性の低いステロイドを生じさせます。よりコヒーレントな凝集体のより強い内力は、それらが形成されたマイクロウェル内にまだいる間でさえ、より対称的な形に崩壊する結果にもなりました。

しかし、リンキャップ凝集体は、特に大きなサイズでは、マイクロウェルの正方形のパラメタル形状を視覚的に保持します。この手順を試みるときは、細胞を追加する前に、別のマイクロウェルを移動して泡立つことを確認することを覚えておくことが重要です。