Name: ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぼう、ネイティブな細胞環境でsplit-BioIDを用いてコンテキスト固有のタンパク質複合体を高解像度で同定する方法。この技術は、生細胞内の動的なタンパク質相互作用を解析し、細胞機能の理解を深めるのに役立ちます。

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この作品は、ドイツのエクセレンス イニシアチブ (CellNetworks DFG EXC 81) と共同研究センター SFB638 によって部分的な融資を通じてドイツの研究議会 (DFG) によって融資されました。

<ol><li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules%2C+big+targets%3A+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+smaller+biotin+ligase+for+BioID+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling.</a> Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li>
<li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li>
<li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li>
<li>Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50(2009).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li>
<li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Asc1p%2FReceptor+for+Activated+C+Kinase+1+%28RACK1%29+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li>
<li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962(2017).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSITe%3A+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li>
<li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li>
<li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID%3A+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039(2017).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/10/02/196980">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
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記載の手順では、プラスミド、相互作用に基づく講演をテストする方法および質量分析のためのビオチン化タンパク質を特定する方法の分割 BioID に興味のある遺伝子のクローンを作成する方法について説明します。トランスフェクションに基づいて手順をご紹介します。融合タンパク質の発現は、培地に添加 dox の量によって調整できるトランスフェクション著しく低下、内因性と比較した場合の融合蛋白質が癌細胞と非均質なタンパク質発現につながる可能性があります。対応。これは対応する interactomes の歪みと PPI 内因性のタンパク質を含む相互作用を忠実に反映していない可能性があります。つまり、一般的に分割 BioID を確立する一時的なシステムで安定したセルラインを構築することをお勧め。プラスミッドは Flp を介する組み換えシステムと互換性があり、同じテト応答要素の規則の下で興味の両方の遺伝子を配置します。必要な場合、互換性のある哺乳類セルで使用した場合、彼らは安定した誘導性細胞を簡単に作成できます。たとえば、情報を頼むことテトラサイクリン アクティブ化される転写活性化因子およびテトラサイクリンを介した遺伝子発現が厳しく規制された12をすることができますユニークな対象 genomic 位置を表す HeLa EM2 11 行を使用します。この細胞ラインと Flp を介する組み換えを使用して、遺伝子のコピーを 1 つだけを含む安定したセルラインは 2-3 週間以内に取得できます。また、興味のある遺伝子のネイティブのゲノム遺伝子座の BirA * 断片を紹介するのに現行ゲノム編集技術を使用することも 1 つ。
タンパク質のタグ付けに依存する任意のアッセイのように結果の融合蛋白質が機能している考慮する 1 つ必要があります。利用可能なデータを興味の蛋白質が付いた (たとえばイメージング研究の GFP) と機能的テスト役・ ビラのフラグメントであるべきかどうかを決定するクローン上流または下流遺伝子の発現。このようなデータが利用できない場合、N 末期 1 つテストする必要があります。 または C 末端タグ付きタンパク質の機能アッセイに。たとえば、する内因性のタンパク質ノックアウトされ野生タイプの状況と比較してセル行の融合蛋白質の活動をテストできます。興味の蛋白質は両方の N 末端と C 末端のタグを容認する場合、両方テストする必要があります。確かに、BioID 実験の融合蛋白質の向きは22のラベル付けの効率を影響します。分割 BioID を蛋白質のペアに適用し、2 つのタンパク質のうち、どちらかの NBirA * に追加されますまたは CBirA * フラグメントも影響9のラベル付けの効率とさらに、我々 はそれを観察しました。分割 BioID プラスミッドの 16 アミノ酸長いグリシン/セリン豊かなリンカー ・ ビラのフラグメントに興味の蛋白質を結合は別の PCA23から撮影され、私たちのすべての相互作用の蛋白質の仕事我々 テストしているところです。ただし、いくつかのタンパク質のペアが短いまたは長いリンカーとよりよく働くかもしれない 1 つをお勧めします。最終的な注記のもう一つの試金は Bollen グループ24によって記述されていた。このアッセイの BirA * で分割されます我々 (E256/G257) より別のサイト (E140/Q141)。我々 は両方分割 BioID 味サイド バイ サイドをテストし、E256/G257 このプロトコルで記述されているがより強力な再活性化 2 つの相互作用の蛋白質に結合するときにつながることを発見9。
このメソッドの 1 つの一般的な欠点は、ラベリングの遅い速度です。通常、ビオチンと 6 ~ 24 時間培養時間はかなりビオチン化6、タンパク質複合体の動的な改造を勉強のためこのテクニックの使用は除外を得る必要です。この試金は部分的にそれは 2 つのタンパク質が相互作用するときにのみアクティブ化としてこの警告をアドレス、ラベルの低速は非常にダイナミックなプロセスまたは短命の蛋白質を分析する応答を勉強するための使用を排除します。設計のペルオキシダーゼ APEX2 は 1 分3で近位蛋白質の効率的な分類を促進するために知られています。APEX2 に基づく PCA したがって BioID 由来の試金の遅いラベリング速度の制限に対処可能性があります。原理の実証研究では、このような分割 APEX2 アッセイ25をについて説明します。ただし、homodimerizing 蛋白質は正常にビオチン化の示されるべきままラベルし、相互作用の蛋白質のまわりを組み立てる蛋白質を識別する試金することができます使用もかどうか。非常に最近では、進化は、TurboID と miniTurbo、2 つの亜種の BirA * 活性の増強とはるかに短いラベルの時間ウィンドウを 10 分26まで許可するを作成に使用されました。これらの新しい亜種に分割 BioID を適応させると、アプリケーションの広範な分野にこの技術の使用をさらに拡張します。

ほとんどの携帯電話の機能は、動的に組み立てる高分子複合体蛋白質によって実行される、のでタンパク質間相互作用 (PPI) の同定は生物医学研究における主要な試みです。確かに、PPI は病気で自由化頻繁および1の治療のための潜在的なターゲットを表します。最も広くメソッドの PPI の識別は、アフィニティ精製 (AP) アプローチのセル換散、行列に興味の蛋白質を精製具体的と関連付けられているタンパク質を質量分析法によって識別されますその後(MS)。AP MS 強力なアプローチですが、通常は行わない難溶性タンパク質複合体、非常に一時的な相互作用または無傷の細胞内構造を必要とする PPI でも。また、データの解釈は、単一蛋白質はしばしばいくつかの明瞭な蛋白質の複合体の一部として PPI ネットワークの動的な性質を合併することができます。
BioID2または APEX23,4などの近接ラベリング手法は AP MS アプローチの制限のいくつかに対処する最近開発されました。BioID、酵素・ ビラ * (野生型大腸菌の酵素の G115R の亜種に対応する) は不安定なビオチニル-アンプ (バイオ AMP) アミンと反応できるの形成を触媒します。野生型酵素活性中心の生体アンプを保持するのではなく・ ビラ * 生体アンプ、近隣環境への拡散を許可するを解放します。したがって、興味の蛋白質に融合し、細胞で発現、近位蛋白質は 10 nm5の推定範囲内ビオチン化をすることができます。これらの近位マーク蛋白質は、ストレプトアビジン プルダウンによって隔離され、MS によって識別されます。AP-MS ではなく BioID 融合タンパク質の発現が必要です。それがこうしてにのみ適用蛋白質の機能が、タグ付けによって妨げられていません。また、ラベリングの速度が遅い、通常 6-24 h2,6、短命の蛋白質の検出の挑戦を作るします。BioID MS AP MS と比較して、いくつかの重要な利点を提供してまだ、: 最初に、そのキャプチャ ネイティブな携帯電話環境における相互作用組み立ての複合体ではなく、2 つ目のラベルが付いたタンパク質は次のセル換散; 分離第三に、ストレプトアビジン プルダウンにより変性バッファーと洗う過酷な条件を使用します。したがって、メソッドはより一時的なまたは弱い相互作用7または特定の発生する相互作用を検出する敏感な細胞内構造8を分離するは難しい。
ただし、ほとんどの蛋白質は通常携帯電話合図に従って、または実行する必要があります関数を改造できるより大きい複合体の部分であります。したがって、単一のタンパク質は通常いくつかの複合体、異なる機能単位に対応する、異なるを含むおよび/または PPI を重複の一部です。両方のアプローチは特定の蛋白質があるかもしれません、すべてのアソシエーションの概要を与えるが、彼らは個々 の PPI のコンテキストに対処するため失敗します。後者の解像度を上げる、我々 は BirA * (触媒ドメインを含む NBirA *、CBirA * 再活性化ドメインとして見ることができる) の 2 つ使用頻度の低いフラグメントことができますのタンパク質断片否定回路試金 (PCA) を設計しています。活性酵素 2 近くになったときに再蛋白質9の相互作用。結果として得られる分割 BioID 試金を当ててタンパク質相互作用の蛋白質のまわりを組み立てる、従って依存性蛋白質アセンブリ コンテキストの識別ができるように近接依存ビオチン化。我々 は最近、miRNA を介した遺伝子サイレンシング経路9に関与する 2 つの明瞭な蛋白質の複合体を解決することによって分割 BioID の卓越した解像力を示した。
完全に、単一、簡単な試験で分割 BioID により発見し、具体的に定義された機能単位特定の蛋白質が関与、対応するタンパク質複合体の追加相互作用の蛋白質は知られている提供する PPI を割り当てます。

<table><tbody><tr><td>酢酸(氷)</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td>TAEバッファーを作るには</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td>A9539</td><td>DNA分析と抽出のためにTAEアガロースゲルを取る</td></tr><tr><td>アンモニア溶液 25% NH3</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td><td>ビオチンを溶解するには</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ</td><td>A9518</td><td>形質転換細菌を選択するには</td></tr><tr><td>Bioruptor plusソニフィケーションデバイス</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>他のソニフィケーションデバイスも大丈夫です</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>シグマ</td><td>B4639</td><td>効率的なビオチン化を刺激するために増殖培地に加える</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン画分 V</td><td>カール・ロス</td><td>8076</td><td>ウェスタンブロットバッファーおよびブラッドフォードアッセイのタンパク質標準に使用</td></tr><tr><td>ブラッドフォードウルトラ試薬</td><td>Expedeon</td><td>BFU05L</td><td>タンパク質測定のための他の方法/キットは問題ありません、この特定の試薬は他のブラッドフォード試薬よりも界面活性剤に耐性</td></tr>があります <tr><td>細胞スクレーパー</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>他のモデルも問題ありません</td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>スプリットバイオIDプラスミド(NBirA*融合)</td></tr><tr><td>DMEM培地</td><td>シグマ</td><td>D6046</td><td>にクローニングするための制限酵素別の細胞株を使用する場合は、対応する最適な増殖培地を使用してください</td></tr><tr><td>DNAミニプレップキット</td><td>シグマ</td><td>PLN350</td><td>他のキットも問題ありません</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>Applichem</td><td>A2951</td><td>Doxは光感受性</td></tr><tr><td>DTT</td><td>です Applichem</td><td>A2948</td><td>1Mストック溶液を作成し、-20°Cで保存します。Cと常に新鮮な</td></tr><tr><td>DyLight 680結合ストレプトアビジン</td><td>Thermo scientific</td><td>21848</td>を使用して<td>LiCorウェスタンブロットスキャンデバイスと一緒に使用</td></tr>してください <tr><td>Dynabeads MyOne ストレプトアビジンC1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>C1ビーズは、ダウンストリームMSアプリケーションに適したBSAコーティングされていません(最終溶出液にBSAの漏れはありません)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>アプリケーション</td><td>A5097</td><td>500 mMのストックを作成し、EDTA粉末を溶解しながらpHを8に調整</td></tr>します <tr><td>エタノール</td><td>シグマ</td><td>32205</td><td>ドキシサイクリンを10 mg.mL-1</td></tr><tr><td>Fastgeneゲル/PCR DNA抽出キット</td>で溶解できる70%ストック溶液を作成します <td>日本ジェネティクス</td><td>FG-91302</td><td>他のキットも問題ありません</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>メルク</td><td>1.00317.1000</td><td>ビオチンストック溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>のpHを調整するにはCarl Roth</td><td>6763</td><td>500 mM ストック溶液を作成し、pH を 7.4</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF メンブレン 0.45&nbsp;&マイクロ;m</td><td>ミリポア</td><td>IPFL00010</td><td>このメンブレンは、LiCor Western ブロットスキャン装置</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Gr&uuml と併用すると、最小限の自家蛍光を示します。ssing GmbH</td><td>12083</td><td>5Mストック溶液を作る</td></tr><tr><td>Odyssey CLxイメージングシステム</td><td>LI-COR</td><td>N/A</td><td>蛍光色素標識抗体で装飾されたウェスタンブロット膜をスキャンするには</td></tr><tr><td>線状ポリエチレンイミン (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>他のトランスフェクション試薬も細かい</td></tr><tr><td>粉乳</td><td>カールロス</td><td>T145</td><td>ウェスタンブロット膜をブロックするには</td></tr><tr><td>MluI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td></tr><tr><td>Na-deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>10% (w/v) ストック溶液を作る</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>5M ストック溶液を作る</td></tr><tr><td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td>20% (v/v) ストック溶液を作る</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>スプリットBioIDプラスミドへのクローニング用制限酵素(CBirA*融合)</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)</td><td>シグマ</td><td>806552</td> PmeIを<td>廃棄する前に細胞を洗浄するため</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>R0560</td><td>スプリットバイオIDプラスミド(CBirA*融合)にクローニングするための制限酵素</td></tr> <tr><td>Protease阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>4693132001</td><td>タンパク質を防ぐために溶解緩衝液に添加分解</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90003</td><td>Split-BioIDプラスミドは、NBirA*-FKBPとCBirA*-FRB、FKBP とFRBは、他の2つのORFに置き換えることができます</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90004</td><td>Split-BioIDプラスミドは、FKBP-NBirA*とCBirA*-FRB、FKBP とFRBは、他の2つのORFsで置き換えることができます</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90008</td><td>Split-BioIDプラスミドは、NBirA*-FKBPとFRB-CBirA*の共発現を媒介し、FKBPとFRBは他の2つのORFに置き換えることができます</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>Split-BioIDプラスミドは、FKBP-NBirA*とFRB-CBirA*の共発現を媒介し、FKBPとFRBは他の2つのORFに置き換えることができます</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity PCRキット</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>試験対象のタンパク質のORFコードを増幅する。他の耐熱性DNAポリメラーゼは問題ありません。</td></tr><tr><td>クイックライゲーションキット</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>DNA断片をスプリットBioIDプラスミドにライゲーションするには、他のDNAライゲーションシステムでも問題ありません。</td></tr><tr><td>RunBlue 4-20% SDSプレキャストゲル</td><td>Expedeon</td><td>BCG42012</td><td>MS分析用のサンプルを流すときに使用する</td></tr><tr><td>RunBlue LDSサンプルバッファー</td><td>Expedeon NXB31010</td><td></td><td>RunBlueプレキャストゲル用ランニングバッファー</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>20%ストック溶液として付属</td></tr><tr><td>テットフリー血清</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>融合タンパク質の基礎発現を最小限に抑えるために、テットフリー血清を使用しています</td></tr><tr><td>トランスブロットターボトランスファーシステム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1704150</td><td>高速ウェスタンブロッティングトランスファーシステム、他のトランスファーシステムも問題ありません</td></tr><tr><td>トリス</td><td>カールロス</td><td>4855</td><td>適切なpH(7.4および8)の1Mストック溶液を作る</td></tr> <tr><td>トリトンX-100</td><td>アップリケム</td><td>A4975</td><td>20%(v / v)ストック溶液を作る</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>カールロス</td><td>9127</td><td>ウェスタンブロットバッファーで使用されるTween 20は、バックグラウンド蛍光が高いため、ブロッキングおよび最終洗浄ステップでは省略する必要があります</td></tr></tbody></table>

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-bioid-プロテオーム解析

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

タンパク質間相互作用 (PPI) の識別のため近づくと既存の親和性の浄化 (AP) を補完するために、生きている細胞の蛋白質の近接依存ラベリングができる酵素が導入されています。1 つそのような酵素・ ビラ * (BioID アプローチで使用される)、約 10 の範囲内のタンパク質のビオチン化を仲介する nm。したがって、興味の蛋白質に溶けるし、細胞で発現できますネイティブな環境で近位蛋白質の分類します。AP 組み立てタンパク質複合体の精製に依存しているのではなく BioID かどうかまだ通信している興味の蛋白質と分離できたらどんな細胞内のマークされているタンパク質が検出されます。それ以来 biotinylates 近位蛋白質 1 つはさらに非常に効率的に、それらを分離するためにビオチンをストレプトアビジンの例外的な親和性を活用できます。BioID は識別する一時的なまたは弱い相互作用の AP より実行、している間両方の AP-BioID 質量分析法によるアプローチは特定の蛋白質があるかもしれないすべての可能な相互作用の概要を示します。ただし、それぞれの特定の PPI のコンテキストに情報は提供しない彼ら。確かに、ほとんどの蛋白質は、通常異なる成熟手順やさまざまな部門単位に対応するいくつかの複合体の一部です。この両方のメソッドの一般的な制限に対処するため我々 は BirA * 酵素に基づくタンパク質断片否定回路試金を設計しました。このアッセイの BirA * 2 つのアクティブでないフラグメントは活性酵素が融合する 2 つの相互作用の蛋白質によって近くになったときに再構成できます。結果の分割 BioID アッセイでは、相互作用の蛋白質のまわりを組み立てる蛋白質の分類したがってことができます。これらの 2 つの特定のコンテキストでのみ対話、提供分割 BioID は、ネイティブ細胞における特定の文脈依存機能単位の分析をできます。ここでは、テストし、相互作用するタンパク質のペアに分割 BioID を適用する手順を追ってプロトコルを提供します。

このメソッドがどのように動作するか、Ago2 タンパク質の開いたリーディング ・ フレーム (ORFs) を説明するために TNRC6C およびダイサー (すべてのマイクロ Rna を介した遺伝子サイレンシング経路の関係者) は分割 BioID プラスミッドの複製だった。Ago2 翻訳を抑圧する miRNA によるサイレンシング複合 (miRISC) 内で TNRC6C と対話し、ターゲット Mrna14の崩壊を刺激する知られています。MiRISC、Ago2 をアセンブルする前に、ダイサー、複合施設では、miRNA15にロードを取得可能性があります内の成熟 Mirna を生成する酵素と対話します。したがって分割 BioID は Ago2/ダイサー ペアまたは Ago2/TNRC6C ペアに適用されました。テストされた蛋白質の各ペア、Ago2 だった NBirA * または CBirA * 私たちの分割 BioID プラスミド (図 2) を使用していずれかの融合、ダイサーや TNRC6C に対応する同種・ ビラ * フラグメントします。さらに、各蛋白質を融合した CBirA * され、NBirA * と対になって-ネガティブ コントロールとして GFP 融合。テスト蛋白質 (表 1) のペアごとに 4 つのイテレーションのテストでこの結果します。
分割 BioID がテストされた蛋白質のペアが相互にアクティブ化されるかどうかをテストするのには図 1に描かれているスキームを追ったプラスミッドは一過性テト システム互換性のある HeLa 細胞ラインに導入させた。ドキシサイクリン (dox) で誘導された融合タンパク質の発現とビオチン化は成長媒体に過剰なビオチンを追加することによって刺激されました。Dox とビオチン 20 h 培養時間、続いて細胞分離, ビオチン化タンパク質を検出する共役ストレプトアビジンを用いたウェスタンブロッテイングにより分析した.哺乳類セルの 2 つの主要なバンドは、通常融合のサンプル (図 3星) の共役ストレプトアビジンで検出、内生ビオチン化タンパク質 (最もおそらくミトコンドリア カルボキシラーゼ) に対応します。これらの 2 つのバンドがすべてのサンプルに存在し内部のローディング コントロールとして便利に使用ことができます、したがって、同じ蛋白質量の読み込みを制御するハウスキーピング蛋白の検出は不要です。BioID/分割-BioID の実験のために典型的、観察することができます追加の主要なバンド、自己ビオチン標識を持って融合蛋白質であります。他のビオチン化タンパク質を見てない場合でもはこの段階で既に融合タンパク質のビオチン化を検出テストの 2 つの蛋白質が細胞の相互作用を示します。図 3に描かれている実験ではオフに NBirA * を持つ-CBirA * TNRC6C またはダイサー融合と共に Ago2 融合蛋白質がどの CBirA * で逆の組み合わせよりも効率的-Ago2 NBirA * 他の 2 つの融合にペアになっています(図 3、上部のパネル比較レーン 6 7 2 3 車線の強度) 蛋白質。NBirA * CBirA * 融合のどれもを有効にできるようまた、活性化された特定のかなりのレベル (図 3、比較車線 1、融合細胞に対応するレーン 8 4 5) に GFP 制御融合タンパク質。私たちのプラスミッドの NBirA * が myc タグ、CBirA * フラグの札 (図 2) には、それぞれ融合タンパク質の発現レベルはこれらの 2 つのタグ (図 3底板) に対する抗体と分析できます。
相互作用に基づくビオチン化を観察すると、実験をスケール アップすることができます、プロトコル (図 4) の 4 項に示されているように、ストレプトアビジン結合ビーズにビオチン化タンパク質が分離されました。分離の最初の時間を実行すると、西部 (図 5) あぶらとりによって浄化のすべての手順を分析する可能性があります。通常、ビーズに結合がほぼ定量的にする必要があります、事実上を通じてリークする必要がありますも見られなくなる洗浄中。事前処理の質量分析のためのサンプル、誘導ビオチン化想定どおり、融合蛋白質を表現したように西部のしみを実行します。融合蛋白質の表現の欠如は、貧しいトランスフェクション効率か障害のある dox 誘導です。融合蛋白質を表現したビオチン化が認められなかった場合は、余分なビオチン (50 μ M) がメディアに実際に追加されたかどうか、在庫のビオチンがまだアクティブであるを確認します。通常、Coomassie 染色蛋白質ゲル (図 6) の溶出の材料を分析観察する最強のバンドは約 17 kDa で実行され、単量体ストレプトアビジンに対応します。内因性ビオチン化タンパク質との融合タンパク質に対応するバンドも観察することがあります。我々 は通常読み込みも (図 6) までストレプトアビジン バンド上記サンプル車線部を切除します。摘出したバンドを 1.5 mL チューブに格納して質量分析施設に送信できます。または、バインドされた蛋白質はストレプトアビジン結合ビーズのトリプシン消化もあります、消化ペプチドの溶出が列を形成します。我々 は定期的に MaxQuant ソフトウェア16 (ほとんどの既定のパラメーターを使用して、参照 9 典型的な MS の結果の詳細についてを参照してください可能な翻訳後修飾としてリジン ビオチン化を追加する、) を使用して MS の生データを分析して、ペルセウス スイート17以降の統計解析では、両方ともフリー ソフトウェア。サンプルは、3 つの生物学的複製で通常実行されます。無料のラベルの数量を使用して、制御条件を具体的に濃縮タンパク質を識別できます。内生ビオチン化タンパク質とタンパク質・ ビラ * 酵素によりラベル付けされた非具体的にフィルターを適用するには、と六つの無関係な蛋白質で生成された六つのデータセットからのヒットは、豊かさを大幅蛋白質のみ考えています。さらに、我々 はのみによって NBirA * NBirA * の融合蛋白質が置き換えられて分割 BioID データセットに濃縮されてヒットを考慮-GFP。特に定量的プロテオミクス18細胞培養 (SILAC) のアミノ酸組成と安定同位体標識を使用して他のデータ解析方法が提案されています。さらに、様々 な戦略は、ビオチン化ペプチド有機溶剤19またはビオチン固有を使用して特別な溶出条件ビオチン18、弱体化した親和性ストレプトアビジン バリアントを使用しての直接分離について記載されています。抗体20,21。必ずしも多くのタンパク質の発見につながる、ながらビオチン化部位の同定は、ヒットの特異性に関してもっと自信を追加、役に立つときは、相互作用のトポロジに対処します。
<img alt="プロテオミクス解析ワークフロー:Split-BioID、クローニング、トランスフェクション、ビオチン化、MS、ウェスタンブロット。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: 分割 BioID プロシージャの概要。タンパク質 1 対話タンパク質 2 複雑な A の一部として、複雑な B の一部としてタンパク質 3特に体の組成を調べる、分割 BioID は 1 と 2 の蛋白質に適用できます。質量分析計の写真はクリエイティブ ・ コモンズ帰属-シェアも 3.0 unported 派生ライセンスの下で、ThermoScientificOrbitrapElite.JPG のファイル名を https://commons.wikimedia.org からダウンロードしました。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="制限部位BamHI、MluI、ClaIによる遺伝子編集プラスミドマップ。クローン作成セットアップの図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2: 分割 BioID プラスミドの式カセット。NBirA *、CBirA * の融合蛋白質のすべての組み合わせをテストできるように 4 つのプラスミドを提供します。指定された番号の下 addgene.org でプラスミドと完全なマップがあります。プラスミッドはテト応答要素 (7 x テト) とテト式システムと互換性がある細胞ラインで使用する必要があります。またすべてのプラスミッドの Orf の FKBP と FRB は NBirA * に融合し、CBirA * それぞれの断片を注意してください。ラパマイシンの存在下でこれら 2 つのタンパク質が相互作用し、したがって、プラスミドはこの化学9の有無でシステムをすばやく確認する使用ことができます。指定された制限のサイト、ユニークです。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="タンパク質電気泳動の結果;抗体を用いたDicer,TNRC6C,Ago2のウェスタンブロット分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: 分割 BioID 実験のための典型的な西部のしみ方。上部パネル: 蛍光標識ストレプトアビジンとビオチン化タンパク質の検出。下部のパネル: 反 Myc および反フラグ抗体との融合蛋白質の検出。蛋白質の 2 つのペアがテストされた: Ago2/TNRC6C と Ago2/ダイサー。2 &amp; 3 の車線、Ago2 が CBirA の断片に追加されました。6 &amp; 7 の車線、Ago2 が NBirA の断片に追加されました。3 つのタンパク質のいずれかが NBirA * と結合されたとき重要な信号が認められなかった-GFP (レーン 1、4-5)。星は、内部のローディング コントロールとして使用できるビオチン化タンパク質内生に対応するバンドを示します。この図は図 5 b出ないでらから適応9クリエイティブ ・ コモンズ帰属 4.0 国際ライセンスの下で。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="磁気ビーズを使用した細胞精製ワークフロー。SDS-PAGEの結果。タンパク質分析法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4: ストレプトアビジン プルダウン手順の概要です。ビオチン化タンパク質質量分析のための分離のための主な手順が描かれています。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="SDS-PAGEタンパク質精製結果、抱合ストレプトアビジン相互作用、電気泳動ゲル。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5: ストレプトアビジン プルダウン実験のための典型的な西部のしみ方。それぞれの指定されたサンプルのボリュームを等しく SDS ポリアクリルアミドのゲルの読み込まれました。次の西部のしみが付くこと、HRP 結合ストレプトアビジンとビオチン化タンパク質が検出されました。NBirA * に対応するバンド-TNRC6C と CBirA *-Ago2 が示されます。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="SDS-PAGEゲル、タンパク質バンド分離、Split-BioID、ストレプトアビジン、分子量マーカー。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図 6: 質量分析の典型的な Coomassie 染色蛋白質ゲル。ストレプトアビジン結合ビーズから溶出サンプルがプレキャスト蛋白質ゲルのロードされ、サンプル 2-3 cm に移行までを実行します。約 17 kDa で見られる主要なバンドは、ストレプトアビジンです。そのバンドの直接上の領域、質量分析施設に送信されます。NBirA * に対応するバンド-TNRC6C と CBirA *-Ago2 が示されます。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>トランスフェクション サンプル</td>
			<td colspan="3">テスト条件</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1/CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1/NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP/CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP/CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">ないトランスフェクション</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: は通常分割 BioID を 2 つの蛋白質に適用する場合の条件をテストしました。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>シーケンス入門</td>
			<td>シーケンス</td>
		</tr>
<tr>
<td>カセット 1 逆プライマー (CBirA * 融合)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>カセット 2 逆プライマー (NBirA * 融合)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 配列分割 BioID プラスミッドのためのプライマー。

分割-BioID、近接ラベリング手法 BioID を用いたタンパク質断片否定回路試金のステップ バイ ステップのプロトコルを提供します。与えられた 2 つのタンパク質の相互作用活性化、彼らのネイティブ セルラ環境での文脈依存的タンパク質のプロテオミクス解析をことができます。メソッドは、シンプルでコスト効果の高い、標準的な実験装置を必要なだけ。

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

この手順の全体的な目標は、生細胞内で近接依存性タンパク質ビオチン化を誘導するタンパク質フラグメント補完アッセイであるsplit-BioIDを使用して、相互作用する目的のタンパク質のペアの周囲に特異的に集合するタンパク質複合体の組成を調べることです。この方法は、タンパク質複合体がどのように動的に再モデル化してさまざまな細胞機能を調節するかなど、細胞生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ネイティブの細胞環境における状況特異的なタンパク質複合体を非常に高い分解能で容易に同定できることです。最終的な質量分析では、次の手順をケラチンフリーの条件で実行し、すべての材料と試薬を可能な限りケラチンフリーにする必要があります。目的の2つのタンパク質のORFをスプリットBioIDプラスミドにクローニングした後、一過性トランスフェクションを実施し、テキストプロトコルに従ってビオチン添加培地を添加した後、PBSを使用して細胞を2回洗浄します。各プレートに1.5ミリリットルのPBSを追加し、スクレーパーを使用して細胞を採取し、各条件の細胞を別々の15ミリリットルのチューブに移し、1、200倍の重力と摂氏4度でチューブを5分間回転させます。上清を取り除き、ペレットを液体窒素でスナップフリーズします。その後、チューブをマイナス80°Cで保管し、さらに処理します。細胞ライセートを調製するには、1ミリリットルのRT溶解バッファーを使用してペレットを再懸濁します。次に、細胞を25ゲージの針に10〜20回通します。次に、サンプルを超音波処理します。次に、回収された超音波処理溶解物の900マイクロリットルあたり100マイクロリットルの20%Triton X-100を添加し、最終濃度を2%にして、ライセートのミリリットルあたり2.3ミリリットルの50ミリモルトリス、pH 7.4を添加して、NaCl濃度をストレプトアビジンビーズに結合するためのNaCl濃度を150ミリモルに調整します。次に、調整したライセートを1.5ミリリットルのチューブに分配し、重力の16,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を15ミリリットルのチューブに移し、50〜100マイクロリットルを入力材料として保持します。ストレプトアビジンプルダウンを行うには、各条件について、200マイクロリットルのストレプトアビジン結合磁気ビーズ懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブを磁気ラックに置き、約1分間待ってからストレージバッファーを取り外します。1ミリリットルの平衡緩衝液でビーズを穏やかに混合して洗浄します。次に、平衡化したビーズを必要な数のチューブに均等に送り込み、磁気ラックに戻します。平衡化バッファーを取り出した後、ビーズの各セットを等量の対応する細胞溶解物で再懸濁します。次に、サンプルを摂氏4度で回転するホイールで一晩インキュベートします。翌日、チューブを磁気ラックに置きます。ビーズがチューブの側面にくっつくまで待ち、上清をフロースルーとラベル付けされた15ミリリットルのチューブに移します。200マイクロリットルの洗浄緩衝液1で、各チューブ内のビーズを再懸濁し、1つの条件に対応する再懸濁ビーズの各セットを1.5ミリリットルのチューブに組み合わせます。1ミリリットルの洗浄バッファー1を使用して、回転ホイールでビーズを8分間2回洗浄します。次に、洗浄バッファー2、3、および4に対してそれぞれ2回の洗浄を行います。最後の洗浄ステップの後、サンプルをスピンダウンする上清の大部分を除去した後、洗浄バッファーが完全に除去されるようにするため。次に、それらを磁気ラックに戻し、残りのバッファーを取り外します。ビーズに30マイクロリットルの溶出バッファーを加え、サンプルを摂氏98度で15分間インキュベートし、すぐにチューブを磁気ラックに移動します。溶出したサンプルを新しいチューブに移し、さらなる処理までチューブをマイナス20°Cで保存します。各インプットサンプルについて、同量のタンパク質と適切な容量の3X SDSローディングバッファー(総容量28μL)を混合してPAGEサンプルを調製します。次に、各溶出サンプルの5マイクロリットルを2.5マイクロリットルの3X SDSローディングバッファーと混合して、PAGEサンプルを調製します。サンプルをSDSポリアクリルアミドゲルにロードします。その後、テキストプロトコルに従って電気泳動およびウェスタンブロッティングに進みます。MS 分析用の SDS-PAGE を実行するには、各溶出サンプルの 18.75 マイクロリットルに 6.25 マイクロリットルの 4X サンプルバッファーを添加し、サンプルを 4 〜 20% プレキャスト SDS ゲルで 2 〜 3 cm ゲルに移動するまで分析します。15cmのシャーレで、コロイド状Coomassie Brilliant Blue G250染色でゲルを染色します。清潔なメスを使用して、ストレプトアビジンバンドを除く各サンプルの全レーンを切り取り、切り出したバンドをMS分析のために1.5ミリリットルチューブに移します。BioID、split-BioID実験で同定された内因性ビオチン化タンパク質に加えて、ウェスタンブロットで観察された追加の主要なバンドは、自己ビオチン化した融合タンパク質であり、これは、試験した2つのタンパク質、この例ではAgo2とTNRC6CまたはAgo2とDicerが細胞内で相互作用したことを示しています。さらに、ウェスタンブロットの結果は、NBirA*Ago2融合タンパク質とTNRC6CまたはDicerへのCBirA*融合タンパク質の組み合わせが、CBirA*Ago2と他の2つのタンパク質のNBirA*融合タンパク質との組み合わせよりも効率的であることを示しています。さらに、CBirA*融合のいずれもNBirA*GFP制御融合タンパク質をかなりのレベルまで活性化することができなかったため、活性化は特異的でした。単離を初めて行うときは、精製のすべてのステップをウェスタンブロッティングで分析する必要があります。ここに示すように、ビーズへの結合はほぼ定量的であり、洗浄液の漏れはほとんど観察されません。タンパク質の発現とビオチン化の誘導後に溶出した物質をクマシー染色ゲル上で泳動すると、観察される最も強いバンドは約17キロダルトンで、単量体のストレプトアビジンに対応します。ローディングウェルのストレプトアビジンバンドより上のサンプルレーンの領域は、通常、MS 分析のために切除されます。この手順を2つの特定のタンパク質に適用する際には、融合タンパク質の異なる組み合わせをテストすることが重要です。実際、全体的なビオチン化効率は、N末端またはC末端のBirAフラグメントにどのタンパク質が付加されるかに密接に依存することがしばしば観察されています。ネガティブコントロールのsplit-BioID実験を少なくとも1つ追加することも同様に重要です。例えば、目的のタンパク質のペアとは関係のない相互作用するタンパク質のペアについてです。この手順と質量分析に続いて、同定されたペプチドをネガティブコントロール実験に対してスコアリングするために、計算機分析を適用する必要があります。例えば、ドイツのミュンヘンにあるCoxとMannの研究所で開発されたMaxQuantとPerseusのソフトウェアを使用しています。

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