ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

この手順の全体的な目標は、生細胞内で近接依存性タンパク質ビオチン化を誘導するタンパク質フラグメント補完アッセイであるsplit-BioIDを使用して、相互作用する目的のタンパク質のペアの周囲に特異的に集合するタンパク質複合体の組成を調べることです。この方法は、タンパク質複合体がどのように動的に再モデル化してさまざまな細胞機能を調節するかなど、細胞生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ネイティブの細胞環境における状況特異的なタンパク質複合体を非常に高い分解能で容易に同定できることです。

最終的な質量分析では、次の手順をケラチンフリーの条件で実行し、すべての材料と試薬を可能な限りケラチンフリーにする必要があります。目的の2つのタンパク質のORFをスプリットBioIDプラスミドにクローニングした後、一過性トランスフェクションを実施し、テキストプロトコルに従ってビオチン添加培地を添加した後、PBSを使用して細胞を2回洗浄します。各プレートに1.5ミリリットルのPBSを追加し、スクレーパーを使用して細胞を採取し、各条件の細胞を別々の15ミリリットルのチューブに移し、1、200倍の重力と摂氏4度でチューブを5分間回転させます。

上清を取り除き、ペレットを液体窒素でスナップフリーズします。その後、チューブをマイナス80°Cで保管し、さらに処理します。細胞ライセートを調製するには、1ミリリットルのRT溶解バッファーを使用してペレットを再懸濁します。

次に、細胞を25ゲージの針に10〜20回通します。次に、サンプルを超音波処理します。次に、回収された超音波処理溶解物の900マイクロリットルあたり100マイクロリットルの20%Triton X-100を添加し、最終濃度を2%にして、ライセートのミリリットルあたり2.3ミリリットルの50ミリモルトリス、pH 7.4を添加して、NaCl濃度をストレプトアビジンビーズに結合するためのNaCl濃度を150ミリモルに調整します。

次に、調整したライセートを1.5ミリリットルのチューブに分配し、重力の16,000倍、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を15ミリリットルのチューブに移し、50〜100マイクロリットルを入力材料として保持します。ストレプトアビジンプルダウンを行うには、各条件について、200マイクロリットルのストレプトアビジン結合磁気ビーズ懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。

チューブを磁気ラックに置き、約1分間待ってからストレージバッファーを取り外します。1ミリリットルの平衡緩衝液でビーズを穏やかに混合して洗浄します。次に、平衡化したビーズを必要な数のチューブに均等に送り込み、磁気ラックに戻します。

平衡化バッファーを取り出した後、ビーズの各セットを等量の対応する細胞溶解物で再懸濁します。次に、サンプルを摂氏4度で回転するホイールで一晩インキュベートします。翌日、チューブを磁気ラックに置きます。

ビーズがチューブの側面にくっつくまで待ち、上清をフロースルーとラベル付けされた15ミリリットルのチューブに移します。200マイクロリットルの洗浄緩衝液1で、各チューブ内のビーズを再懸濁し、1つの条件に対応する再懸濁ビーズの各セットを1.5ミリリットルのチューブに組み合わせます。1ミリリットルの洗浄バッファー1を使用して、回転ホイールでビーズを8分間2回洗浄します。

次に、洗浄バッファー2、3、および4に対してそれぞれ2回の洗浄を行います。最後の洗浄ステップの後、サンプルをスピンダウンする上清の大部分を除去した後、洗浄バッファーが完全に除去されるようにするため。次に、それらを磁気ラックに戻し、残りのバッファーを取り外します。

ビーズに30マイクロリットルの溶出バッファーを加え、サンプルを摂氏98度で15分間インキュベートし、すぐにチューブを磁気ラックに移動します。溶出したサンプルを新しいチューブに移し、さらなる処理までチューブをマイナス20°Cで保存します。各インプットサンプルについて、同量のタンパク質と適切な容量の3X SDSローディングバッファー(総容量28μL)を混合してPAGEサンプルを調製します。

次に、各溶出サンプルの5マイクロリットルを2.5マイクロリットルの3X SDSローディングバッファーと混合して、PAGEサンプルを調製します。サンプルをSDSポリアクリルアミドゲルにロードします。その後、テキストプロトコルに従って電気泳動およびウェスタンブロッティングに進みます。

MS 分析用の SDS-PAGE を実行するには、各溶出サンプルの 18.75 マイクロリットルに 6.25 マイクロリットルの 4X サンプルバッファーを添加し、サンプルを 4 〜 20% プレキャスト SDS ゲルで 2 〜 3 cm ゲルに移動するまで分析します。15cmのシャーレで、コロイド状Coomassie Brilliant Blue G250染色でゲルを染色します。清潔なメスを使用して、ストレプトアビジンバンドを除く各サンプルの全レーンを切り取り、切り出したバンドをMS分析のために1.5ミリリットルチューブに移します。

BioID、split-BioID実験で同定された内因性ビオチン化タンパク質に加えて、ウェスタンブロットで観察された追加の主要なバンドは、自己ビオチン化した融合タンパク質であり、これは、試験した2つのタンパク質、この例ではAgo2とTNRC6CまたはAgo2とDicerが細胞内で相互作用したことを示しています。さらに、ウェスタンブロットの結果は、NBirA*Ago2融合タンパク質とTNRC6CまたはDicerへのCBirA*融合タンパク質の組み合わせが、CBirA*Ago2と他の2つのタンパク質のNBirA*融合タンパク質との組み合わせよりも効率的であることを示しています。さらに、CBirA*融合のいずれもNBirA*GFP制御融合タンパク質をかなりのレベルまで活性化することができなかったため、活性化は特異的でした。

単離を初めて行うときは、精製のすべてのステップをウェスタンブロッティングで分析する必要があります。ここに示すように、ビーズへの結合はほぼ定量的であり、洗浄液の漏れはほとんど観察されません。タンパク質の発現とビオチン化の誘導後に溶出した物質をクマシー染色ゲル上で泳動すると、観察される最も強いバンドは約17キロダルトンで、単量体のストレプトアビジンに対応します。

ローディングウェルのストレプトアビジンバンドより上のサンプルレーンの領域は、通常、MS 分析のために切除されます。この手順を2つの特定のタンパク質に適用する際には、融合タンパク質の異なる組み合わせをテストすることが重要です。実際、全体的なビオチン化効率は、N末端またはC末端のBirAフラグメントにどのタンパク質が付加されるかに密接に依存することがしばしば観察されています。

ネガティブコントロールのsplit-BioID実験を少なくとも1つ追加することも同様に重要です。例えば、目的のタンパク質のペアとは関係のない相互作用するタンパク質のペアについてです。この手順と質量分析に続いて、同定されたペプチドをネガティブコントロール実験に対してスコアリングするために、計算機分析を適用する必要があります。

例えば、ドイツのミュンヘンにあるCoxとMannの研究所で開発されたMaxQuantとPerseusのソフトウェアを使用しています。