解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体
2018年6月15日
本稿では、二分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) のプロトコルについて説明します。この手法は競合結合パートナーで形成された複合体と同様、国連複合体の個々 のタンパク質を除く、特定の分離と任意の 2 つの相互作用の蛋白質の下流のプロテオーム解析を促進します。
この方法は、タンパク質やタンパク質複合体の動的集合がどのようにシグナル伝達経路や細胞の挙動を制御するかなど、細胞生物学や生化学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、相互作用する2つのタンパク質を特異的に単離できる一方で、複合体を持たない個々のタンパク質や競合する結合パートナーを排除できることです。この方法を使用して、乳がんの受容性チロシンキナーゼ二量体化に関する洞察を提供しますが、他の生理学的環境や疾患にも適用できます。
この手法を思いついたのは、GFPナノボディがGFPなどの蛍光タンパク質の三次元エピトープを認識することに気づいたときでした。まず、0.2 ミリリットルのチューブに 150 ナノグラムの入口ベクトル、150 ナノグラムの目的地ベクトル、8 マイクロリットルの TE バッファーを追加します。次に、2マイクロリットルのリコンビナーゼとZiMexを加え、2つを短時間遠心分離します。
反応を室温で1時間インキュベートした後、1マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートして反応を停止します。次に、ヒートショックコンピテントセルを氷上で解凍します。そして、50マイクロリットルの細胞を14ミリリットルの丸底ポリプロピレンチューブに移します。
1マイクロリットルの反応生成物を細胞に加え、穏やかに混合します。細胞を氷上で20分間インキュベートします。次に、細胞を氷に戻す前に、摂氏42度の水浴で細胞に45秒間熱衝撃を与えます。
1ミリリットルのLB培地を細胞に加えます。そして、サンプルを摂氏37度で1時間振とうしながらインキュベートします。次に、形質転換をアンピシリンを含む10cmの寒天プレートにプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。
プラスミド精製を開始するには、アンピシリンと100ミリリットルのLB培地を大きな円錐形フラスコに加えます。次に、接種ループを使用して、寒天プレートから単一のコロニーを取り出します。接種ループをLB培地に沈め、短時間混合した後、フラスコの上部をアルミホイルで覆い、振とうしながら摂氏37度で一晩インキュベートします。
ここから、トランスフェクションを進める前に、標準的なMaxiprepプラスミドDNA精製キットを使用してプラスミドDNAを精製します。まず、10ミリリットルのDMEMを含む10センチメートルの皿にHEK293T細胞を播種します。次に、各二分子蛍光相補ベクター2.5μgを500マイクロリットルのトランスフェクションバッファーで希釈します。
トランスフェクション試薬を10マイクロリットル加え、混合物を10秒間ボルテックスします。次に、サンプルを短時間遠心分離し、室温で10分間インキュベートします。次に、DNAトランスフェクション混合物を滴下して皿に加えます。
その後、サンプルを8〜24時間インキュベートします。テキストプロトコルに概説されているように、細胞溶解バッファーと補充した細胞溶解バッファーを調製します。次に、細胞を氷冷PBSで2回洗浄します。
PBSを吸引し、氷冷した補充細胞溶解バッファーを1mm加えます。次に、皿を氷の上に置き、5分間インキュベートします。次に、セルスクレーパーを使用して細胞を取り出し、冷却したマイクロ遠心チューブに移します。
細胞の破片を取除くために4°Cで5分間18、000倍の重力で管を遠心分離し、次に新しいマイクロ遠心分離機の管に透明な上清を移す。1ミリリットルのPBSに適量のアガロースビーズを洗浄し、重力300倍でビーズを遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。次に、各サンプルに20マイクロリットルのアガロースビーズを追加します。
そして、摂氏4度で2時間インキュベートし、端から端まで回転させます。ビーズを重力300倍で遠心分離し、細胞溶解バッファーで3回洗浄します。次に、洗浄したビーズを希釈したサンプルバッファー50μLに再懸濁します。
最後に、サンプルを摂氏95度で2〜3分間加熱します。この研究では、BiCAP法を使用して、HEK293T細胞の同時トランスフェクションから約16時間後に、いくつかのタンパク質タイプの正の相互作用を観察します。共焦点顕微鏡法は、原形質膜でのRTKERBB2の二量体化、およびユビキチンのE3リガーゼUBR5への結合を観察するために使用されます。
GFBナノボディによるアフィニティー精製後、全長のVenusコントロールタンパク質、および相互作用するV1およびV2タグ付きタンパク質のみを共トランスフェクションサンプルで検出できます。この手順を試行する際は、二分子蛍光相補タグの配置、および目的のタンパク質のC末端またはN末端のいずれかの配置を最適化することを忘れないでください。これは、タンパク質/タンパク質の正の相互作用を観察するために必要です。
このビデオを見れば、BiCAP技術の実行方法と、それを目的のタンパク質相互作用にどのように適用するかについて十分に理解できるはずです。この手順に続いて、ChIPseekのようなダウンストリームの特性評価手法の多くを使用して、転写因子の二量体化がDNA結合をどのように制御するかなどの追加の質問に答えることができます。
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概要
本稿では、相互作用する2つのタンパク質を特異的に単離することを可能にする、二分子相補性アフィニティー精製（Bimolecular Complementation Affinity Purification：BiCAP）法について解説します。本手法は、複合体を形成していないタンパク質や競合する結合パートナーを除去することができるため、さまざまな生物学的状況におけるタンパク質相互作用の解析に有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 生化学
- プロテオミクス
背景
- タンパク質相互作用を理解することは、細胞シグナル伝達経路を解明する上で極めて重要です。
- 従来の手法では、特定のタンパク質複合体を効果的に単離できない場合があります。
- BiCAPは、ナノボディによるGFPの認識を利用して標的の単離を行います。
- この手法は、さまざまな生理学的環境や疾患に適用可能です。
研究目的
- 相互作用するタンパク質を特異的に単離する方法を開発すること。
- 細胞挙動におけるタンパク質複合体ダイナミクスの理解を深めること。
- 乳がんなどの疾患メカニズムに関する知見を提供すること。
使用した方法
- エントリーベクターおよびデスティネーションベクターの調製。
- タンパク質相互作用解析におけるリコンビナーゼおよびZiMexの使用。
- 反応を促進するための遠心分離。
- さまざまなコンテキストにおけるタンパク質相互作用を研究するためのBiCAPの適用。
主な結果
- 2つの相互作用するタンパク質の単離に成功した。
- 複合体を形成していないタンパク質および競合相手の除外。
- 受容体チロシンキナーゼの二量体化に関する知見の獲得。
- 他の疾患や生理学的状況への応用の可能性。
結論
- BiCAPはタンパク質相互作用を研究するための有用なツールです。
- この手法は、さまざまな研究アプリケーションに適応させることが可能です。
- これにより、複雑な生物学的プロセスへの理解が深まります。
よくある質問
業界における実用的意義
動的なマルチプロテインシグナリング複合体を解析することは、初期創薬におけるターゲット検証のリスク低減およびパスウェイメカニズムの解明に不可欠です。BiCAP法を用いることで、非複合体形成タンパク質や競合パートナーを除外した、相互作用するタンパク質ペアの特異的な単離とプロテオミクスによる特性解析が可能となり、メカニズム研究における予測の信頼性が向上します。この機能は、創薬およびトランスレーショナルリサーチにおける、十分な情報に基づいたポートフォリオの選別や、リスクを調整した開発推進の意思決定を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- シグナル伝達経路の調節に不可欠なタンパク質間相互作用の精密な解析を可能にします。
- 真の相互作用パートナーのみを単離することで、機能的なターゲット検証をサポートします。
- 非特異的な複合体や競合する複合体を除外することで、メカニズムのリスク低減を促進します。
- 下流の生物学的仮説に対する予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 定量的で再現性のある後続のアッセイに向けた、検証済み生物学的システムの調製が可能です。
- 関連するタンパク質複合体のみを単離することで、アッセイの特異性を向上させます。
- タンパク質相互作用を標的としたスクリーニングキャンペーンにおける、標準化とスケーラビリティをサポートします。
- 複合体の形成に対する化合物の影響を、信頼性高く評価することが可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- がんモデルにおける受容体の二量体化など、疾患に関連するタンパク質相互作用とメカニズム的な知見を整合させます。
- 下流のプロテオーム解析および機能アッセイを可能にすることで、発見から前臨床検証までの継続性を提供します。
- 標的複合体の生物学的関連性を明確にすることで、リスクを調整した意思決定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
BiCAPは、初期の仮説検証からリード化合物の同定、そして前臨床バリデーションに至るまでの創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、メカニズム研究とトランスレーショナルリサーチの両方を支援します。
- 探索生物学：タンパク質複合体の形成およびパスウェイ統合に関する、仮説に基づいた検証を可能にします。
- スクリーニング：再現性のある定量分析のために、アッセイにそのまま使用可能な、特異的に単離された複合体を提供します。
- 分析：相互作用の条件や摂動を比較するための、明確なプロテオミクス解析結果を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：メカニズムに関する知見を疾患モデルに結びつけ、バイオマーカーや標的の整合性をサポートします。
- 企業での再利用：治療領域を問わず、多様なタンパク質相互作用研究に幅広く適応可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを低減します。
- 運用的価値： タンパク質複合体の単離を標準化し、再現性と拡張性を向上させます。
- 戦略的価値： 生物学的リスクを早期に明確にすることで、Go/No-go決定に有用な情報を提供し、資本効率を高めます。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けおよび、バリデーション済みターゲットの推進を支援します。
実施上の検討事項
- 分子クローニング、細胞培養、およびプロテオーム解析の専門知識が必要です。
- 蛍光検出装置、ナノボディ試薬、およびアフィニティー精製設備へのアクセスが必要です。
- タグの配置およびアッセイ条件について、チーム間での標準化が求められます。
- さまざまなモデルシステムに適用可能ですが、特定のタンパク質ペアに対する最適化が必要な場合があります。
- タグの配置と複合体の安定性は実用上の制限であり、経験的に対処する必要があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Plasmid Cloning
2:54
Cell Culture and Transfection
3:41
Harvesting Lysates
4:31
Affinity Purification and Preparation of BiCAP Eluant for Western Blotting
5:22
Results: BiCAP Method is a Powerful Technique to Specifically Purify and Characterize Interacting Proteins
6:06
Conclusion
