Name: 解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学ぶBiCAP法によるタンパク質相互作用の特定分離技術。GFPナノボディーを利用し、未複合体タンパク質を排除してシグナル伝達経路の動態を解明。細胞生物学・生化学研究に応用可能です。

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D.R.C がん研究所のニューサウス ウェールズ州の研究員であり D.N.S 癌研究所のニューサウス ウェールズ州の研究員であった。がん研究所 NSW (13/FRL/1-02 ・ 09/CDF/2-39)、NHMRC (プロジェクト助成金 GNT1052963)、アイルランド科学財団 (11/SIRG/B2157)、ニューサウス ウェールズ州のオフィスの科学と医学研究、客家によって資金が供給された研究成果を本稿では発表親睦とモスティン家族財団。J.F.H. と r. s. オーストラリアの大学院賞受賞者であった。

1. プラスミッドのクローニング
注: プラスミッドのベクトルを N 末端または C 末端の興味の遺伝子の融合した V1 または V2 タグを生成するため BiFC デスティネーション ベクトルを Addgene に堆積した [N 末端タグ: pDEST-V1-ORF (#73635)、pDEST-V2-ORF (#73636)。C 末端タグ: pDEST-ORF-V1 (#73637)、pDEST-ORF-V2 (#73638)]。興味の遺伝子/s は、コドン、クローン作成を続行することがなく特定の組み変えの互換性エントリ ベクトル (すなわち、 pDONR223 または pENTR221) をクローニングにする必要があります。互換性の多くのクローンは、哺乳類のゲノムのコレクション (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) を含む、さまざまなプラスミド コレクション内で使用できるいます。
<ol><li>適切な BiFC キャスト先のベクトルの attR サイト間興味の遺伝子を挿入する再結合反応を実行します。<ol>
<li>0.2 mL チューブ 150 ng エントリ ベクトル、150 ng BiFC キャスト先のベクトル、および 8 μ L TE バッファー (pH 8.0) を追加します。</li>
		<li>2 μ L シュプリンガー酵素ミックスを追加 (材料の表を参照してください)。よく混ぜ、遠心分離機の簡潔に。</li>
		<li>一晩室温でまたは 16 ° C で 1 時間反応を孵化させなさい。</li>
		<li>1 μ L プロテイナーゼ K 溶液を加え、10 分の 37 ° C で培養して反応を停止します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LR 反応生成物と熱衝撃有能なセル (材料の表を参照) を変換するには。 注: 任意の基本的なひずみ多分使用できますこの時点で挿入を含んでいるプラスミッドの特定の選択を妨げる Ccdb 抗毒素が含まれていない限り。<ol>
<li>氷の上の有能なセルを解凍し、14 mL 丸底ポリプロピレン チューブに細胞の 50 μ L を転送します。</li>
		<li>セルに 1 μ L の反応生成物を加え、軽く混ぜます。氷の上に 20 分間インキュベートします。</li>
		<li>45 42 ° C の水浴の衝撃を熱 s. を 2 分間氷にすぐに戻る。</li>
		<li>ML の LB 培地 1 を追加し、37 ° c 1 時間振とうしながらインキュベートします。</li>
		<li>プレートのアンピシリンを含む 10 cm 寒天プレート上に変換 (100 μ g/mL) し、37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BiFC プラスミッドの浄化。<ol>
<li>個々 のコロニーからのプラスミッドを浄化する大型三角フラスコに mL の LB 培地 100 を追加し、アンピシリンを追加 (100 μ g/mL)。複数のコロニーを画面に 14 mL 丸底のポリプロピレン管に 5 mL の LB 培地を追加し、アンピシリンを追加 (100 μ g/mL)。</li>
		<li>滅菌接種ループを使用すると、寒天培地プレートから単一コロニーを拾います。LB メディアに接種ループを配置し、一時的に混ぜます。</li>
		<li>アルミ箔の三角フラスコの上部を覆うし、揺れで 37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
		<li>標準的な maxiprep または midiprep プラスミド DNA を使用してトランスフェクション グレード プラスミド DNA を作り出す浄化キット (材料の表を参照してください)10。吸光度スペクトルによる DNA の品質を評価します。 メモ: DNA が必要 A260/A280 比 &gt; 1.8 と A260/A230 比 &gt; 2.0。この時点で、挿入とタグの効率的な表現をチェックするため複数の個々 のコロニーを選別することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞培養とトランスフェクション
注: BiFC ベクトルの transfection のため重要です高効率、比較的均質なトランスフェクションを達成するために。ベクトルは、任意の標準的なトランスフェクション試薬と互換性がある可能性が高いとトランスフェクション条件をそれに応じて最適化する必要があります。質量分析を実行するには、私たち通常細胞の培養 10 cm 皿内でこのことができますも比例してにスケール ダウン小さな皿またはより少ない材料を必要とする実験のためのプレートが。
<ol><li>種子 1.0 × 106 HEK293T 細胞 10 cm 皿 mL の 10% を添加した DMEM 培地 10 FBS とペニシリン/ストレプトマイシン (1: 100)。</li>
	<li>遺伝子導入バッファーの 500 μ L に各 BiFC ベクトルの 2.5 μ g を希釈 (材料表参照) 1.5 mL 遠心チューブに。</li>
	<li>トランスフェクション試薬を 10 μ l 添加 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>10 の s、そして簡潔に遠心分離渦混合物。室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>プレートに滴下 DNA トランスフェクション混合物を追加します。対話する BiFC 融合蛋白質折りたたみ金星、fluorophore 成熟、一般的に 8 〜 24 時間の時間の十分な長さのための細胞を孵化させなさい。 注: 金星の最大励起、515 nm とそのピーク発光は 528 nm の, これは容易に標準的な蛍光顕微鏡 GFP 蛍光を視覚化するように設定を使用して表示されますが。</li>
</ol>3. サンプル準備
<ol><li>
Lysates を収穫
	<ol>
<li>ライセートのコレクション前にセル換散バッファーの準備 [50 mM トリス-HCl (pH 7.4) 150 mM NaCl、1 mM EDTA, 1% (v/v) 非イオン性洗剤 (材料の表を参照してください)]。4 ° C でのストア</li>
		<li>収穫の直前にプロテアーゼ阻害剤・ フォスファターゼ阻害剤 (材料の表を参照してください) とセル換散バッファーの 10 mL を補足します。氷の上の補われた細胞換散バッファーを維持します。</li>
		<li>氷冷 PBS で 2 回細胞を洗浄します。PBS を吸引し、冷たい補われた細胞換散バッファーの 1 つの mL を追加します。氷の上の皿を配置、表面全体の面積に広がっているバッファーを確保します。</li>
		<li>細胞スクレーパーを使用して、約 5 分間氷の上を孵化させなさい (材料表を参照)、細胞をこすり中古冷蔵 1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
		<li>収集した遠心分離によって細胞の残骸を削除 18,000 にて 4 ° C と転送で 5 分間 × g 新鮮な遠心チューブに上清をクリアします。 注: この時点でライセート、即座に使用したり-80 ° C で保存また、トランスフェクションの親和性の浄化効率を検証可能なので原油の因数のライセートを維持することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
親和性の浄化 メモ: BiCAP 分離ステップはアガロース ビーズ (材料の表を参照してください) に共役生物学: ナノボディで GFP を使用して実行されます。<ol>
<li>アガロース ビーズを準備するには、1 ml の PBS (サンプルあたり 20 μ L) + 10 μ L 余分な適切なボリュームを洗浄します。300 x g でビーズを遠心し、上清を除去します。</li>
		<li>20 μ L を各ライセート サンプルに追加します。</li>
		<li>エンド ツー エンドの回転と 4 ° C で 2 時間サンプルをインキュベートします。 注: この時点で、サンプル準備できます、SDS ページおよび西部のしみが付くこと、または解析質量分析法による。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
西部にしみが付くことのため BiCAP 溶離液の準備。
	<ol>
<li>300 x gとセル換散バッファーで 3 回洗浄でビーズを遠心します。</li>
		<li>適切に希釈サンプル バッファーの 50 μ L で洗浄のビーズを再懸濁します (材料の表を参照してください) と 2-3 分 95 ° C でサンプルの熱します。 注: この方法で作製したサンプルは-20 ° C で数ヶ月保存できます。</li>
		<li>SDS のページおよび興味の他の同様の蛋白質としてウエスタンブロット11 V1 タグと V2 タグ (材料の表参照) の両方を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BiCAP 溶離液の質量分析のための準備。 注: 少なくとものサンプルを準備すること勧め定量的ラベル無料 (LFQ) 質量分析法による分析のため, 堅牢な統計的検出力を確保するため。<ol>
<li>300 x g とセル換散バッファー洗剤なしで 6 回洗浄でビーズを遠心します。これは過剰なタンパク質と質量分析を妨げる洗剤両方を削除する必要は。すぐに、次のステップに進むまたは-80 ° c.ビーズを格納
</li>
		<li>Trypsinize ビーズ 60 μ L のバッファー 1 [2 M 尿素、50 mM トリス-HCl (pH 7.5)、5 μ g/mL のトリプシン]。800 RPM で揺れ thermomixer 27 ° C で 30 分間のダイジェストにビーズを許可します。</li>
		<li>簡単にビーズを遠心し、(材料表参照) 遠心チューブに上清および転送を収集します。</li>
		<li>25 μ L でビーズを洗浄バッファー 2 [50 mM トリス-HCl (pH 7.5) 1 mM ジチオトレイトール 2 M 尿素] バインドされたタンパク質を減らすために。</li>
		<li>1 つ遠心チューブにビーズと上澄みをプールします。室温で一晩で発生する消化力を許可します。</li>
		<li>ヨードアセトアミド (5 mg/mL の純水) の 20 μ L を各サンプルに追加することで、サンプルをアルキレートし、暗闇のなかで 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>1 μ L トリフルオロ酢酸 (TFA) で各サンプルを処理することによって消化を阻害します。この手順がまた舞台転換のための準備のサンプルを酸性化します。</li>
		<li>コンストラクト C18 ステージによる重なり 6 層 1 mm 固相抽出 C18 (オクタデシル) 200 μ L ピペット チップに膜ディスク (材料の表参照) のヒントします。各サンプルの単一の先端を準備します。</li>
		<li>メタノール、ステージのヒントをウェットし、50 μ L 0.1% (v/v) トリフルオロ酢酸 (TFA) 80% (v/v) アセトニ トリルと平衡します。</li>
		<li>50 μ L 0.1% (v/v) TFA のヒントを洗浄します。</li>
		<li>ステージのヒントに酸性ペプチドを読み込み、0.1% (v/v) TFA、アセトニ トリル 80% (v/v) 2 つの手順を使用して、溶出します。</li>
		<li>真空濃縮を使用してサンプルを蒸発させます。</li>
		<li>必要な場合は-80 ° C で乾燥したペプチドを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 質量。
<ol><li>(超純水) で 2% アセトニ トリル 5% ギ酸の 15 μ L のサンプルを再懸濁します。</li>
	<li>慎重に LC プレートと場所に 6 μ L を安価の HPLC システムに読み込む (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>パック 20 cm、75 μ M 内径列 1.9 μ m C18 固定相の粒子 (材料の表を参照してください)。各列に 5 μ L ペプチドをロードします。</li>
	<li>250 nL/min 以上 140 分でアセトニ トリルの線形グラデーションを用いるペプチドの溶出し、安価の HPLC システムに結合された線形トラップ四重極 (焼入れ) ハイブリッド質量 nanoelectrospray によって紹介します。</li>
	<li>時間 140 分勾配以上スキャンごとのトップ 10 最も豊富なイオンのタンデム MS データを収集します。BSA のバイアスを最小限に抑えるために各サンプルの実行とデータの収集とインターチェンジの順序をランダムします。</li>
</ol>5. 分析
<ol><li>MaxQuant ソフトウェア バージョン 1.2.7.4 内で既定の設定を使用して生の MS データを処理し、MaxQuant の R ソフトウェア環境3ペルセウス統計解析ワークフローの修正バージョンを使用して出力を分析します。 注: このポイントから統計解析のワークフローは、図 2のとおりです。簡単に、MaxQuant を使用して識別される蛋白質の LFQ 強度変換、正規化と帰属続いてフィルターします。ダイマーのペアの相互作用の蛋白質は金星制御、非特異的なバック グラウンド バインダー、スチューデント t 検定と多重比較の Benjamini ホフベルク補正を除外すると識別されます。データ品質は、個々 のヒストグラム、回帰、および階層的クラスタ リングの比較によって確認されます。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig2.jpg"> 図 2: 統計解析ワークフローのアウトライン。MaxQuant を使用して処理される生の質量分析データからタンパク質の LFQ 強度を分析するための統計的解析パイプラインのフロー図。グリーン ボックス: フィルター、青色のボックス: 変換/を規準に合わせる/スケーリング、茶色のボックス: データ品質管理、黄色のボックス: 半定量的な除外・比較分析、グレー ボックス: 統計解析。この図は再発行 fromCroucher ら3転載 AAAS から権限を持つです。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<ol><li>Kolch, W., Pitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+proteomics+to+dissect+tyrosine+kinase+signalling+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).</li>
<li>Pawson, T., Kofler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome+signaling+through+regulated+protein-protein+interactions+in+normal+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).</li>
<li>Croucher, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+complementation+affinity+purification+%28BiCAP%29+reveals+dimer-specific+protein+interactions+for+ERBB2+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers.</a> Sci Signal. 9 (436), ra69(2016).</li>
<li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).</li>
<li>Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+protein-protein+interactions+in+intact+eukaryotic+cells+by+beta-galactosidase+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).</li>
<li>Magliery, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-protein+interactions+with+a+green+fluorescent+protein+fragment+reassembly+trap%3A+scope+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism.</a> J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).</li>
<li>Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+thermodynamic+analysis+of+the+GFP%3AGFP-nanobody+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex.</a> Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).</li>
<li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+protein+assembly%3A+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5062/plasmid-purification">Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Shearer, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+UBR5+regulates+centriolar+satellite+stability+and+primary+cilia+formation+via+ubiquitylation+of+CSPP-L%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L.</a> Mol Biol Cell. , (2018).</li>
<li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoscape%3A+A+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).</li>
<li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, 15690(2017).</li>
</ol>

著者がある何も開示するには

BiCAP は、個別のコンポーネントおよび彼らの競合結合パートナー3を排除しながら特定の蛋白質の二量体を隔離するための強力な方法です。BiCAP は BiFC6と呼ばれる蛍光蛋白質否定回路試金の適応に基づいています。BiFC と近接の結紮アッセイを含む既存の方法7生きているセルの蛋白質の相互作用を定量化を視覚化して広く使用されているが、特性から形成される二量体の分離との効果的な手段を提供しました。これらの相互作用。
タンパク質補完による親和性の浄化技術も進化を続けています。出ないでらは最近、BioID14を使用したタンパク質二量体近接のラベリングのためのシステムを説明します。2 つの相互作用するタンパク質のビオチン リガーゼ ・ ビラの分割フラグメントを融合した、彼らはマイクロ Rna を介した遺伝子サイレンシングに関与するタンパク質複合体を含む Ago2 の濃縮を指示しました。分割 BioI...

蛋白質複雑なアセンブリは多くのシグナル伝達経路の1,2の時空間特異性を維持するために重要なプロセスです。この規制の役割の重要性が広く認識され、これらの複合体を精査する使用できる実験手法の欠如があります。Interactomics 研究のほとんどは個々 のタンパク質や各複雑なコンポーネントの連続濃縮との相互作用に焦点を当てます。ここで競争パートナー3を連結して形成される複合体と同様、タンパク質の個々 の部分を除く、特定の蛋白質の二量体の分離手法を提案します。我々 はこの手法を求めている分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) それとしての小説を使って既存タンパク質フラグメント相補性アッセイは二分子の蛍光補完 (BiFC) の組み合わせである、GFP とその誘導体に向かって生物学: ナノボディでコンホメーション特異の組換え (を参照してください材料テーブル).
典型的なタンパク質フラグメント否定回路試金はルシフェラーゼ4β-ガラクトシダーゼ5、緑色蛍光タンパク質 (GFP)6 (などの記者のフラグメントに分割する溶ける「餌」と「獲物」蛋白質の表現に依存しています。図 1 a)。餌や餌の蛋白質の相互作用によって分割記者ドメインお勧め餌の対話ができるよう、機能的な構造にフォールディングを可視化したり定量化タンパク質を捕食します。BiCAP 作られたこの技術のバージョンから適応された GFP バリアント金星のフラグメントの使用します。蛍光蛋白質否定回路試金は生細胞でのタンパク質間相互作用を可視化するため人気のある方法ですが、今までこの関数を 1 つの7に限られています。BiCAP としてこの手法だけでなく、可視化が、また分離と尋問結果の蛋白質蛋白質の相互作用の点で重要な進歩を表します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57109/57109fig1.jpg"> 図 1: BiCAP 手法の背後にある構造のプリンシパル。(A) 分子蛍光補完表示の背後にあるプリンシパルをアウトライン図 N ターミナル V1 または V2 の C 末端タグ付き '餌' と '捕食' 蛋白質フルレングスの金星タンパク質の断片。(B) GFP 生物学: ナノボディで (緑) と (グレー) V1 と V2 (オレンジ) フラグメント (PDB 加盟 3OGO) の位置を示すられた金星の間 (シアン) 相互作用界面の構造解析。この図は再発行 fromCroucher ら3転載 AAAS から権限を持つです。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57109/57109fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
フュージョン パートナー間の相互作用で発生しない限り親和性の低さに関連付ける (V1 と V2 の名前) 金星の 2 つの非蛍光性フラグメントの手法により BiCAP を使用します。このインスタンスで、2 つの分割ドメインは fluorophore (図 1 b)6の機能 β バレル構造にフォールディングします。BiCAP の重要な技術革新は、組換え GFP 生物学: ナノボディで、正しくられたと折り畳まれた蛍光体 (にある β バレル GFP (と金星などの亜種) の三次元のエピトープを認識するの導入から来る図 1 b)8。重大に、GFP の生物学: ナノボディでは個々 の金星フラグメントのいずれかにバインドされません。これは蛋白質二量体の分離を促進する後にのみ 2 つのタンパク質は、化学物質による、強制相互作用9を使用するメソッドから取得したものより代表的な結果につながる、彼ら自身の意志の複合体を形成しています。
BiCAP は特にこれらの複合体のシグナル伝達における役割の理解の粒度を改善するために下流のアプリケーション数併用できる可能性のある複数のタンパク質を中心に強力な手法.また、蛋白質の相互作用の場の可視化を許可する重要な機能が含まれます。まで BiCAP の受容体チロシン キナーゼ (RTK) ダイマー3のインタラクトームを解析の効果的な方法として実証されていますが、この方法の適応性を意味するそれはほぼすべてのタンパク質相互作用のコンテキストで採用されることができます。

<table><tbody><tr><td>LR Clonase II Plus 酵素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイ</td>エンティフィック 12538120 <td>ゲートウェイクローニング(ステップ1)に必要なリコンビナーゼ酵素 pDEST BiFC デスティネーションベクター</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K、組換え、PCR グレード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 丸底ポリプロピレンチューブ</td><td>コーニング</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>ロシュ ダイアグノスティックス オーストラリア</td><td>10835242001</td><td>100 μ;g/mL を蒸留水に溶解します。</td></tr><tr><td>Miniprepのキット</td><td>Promega Corporation</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprepのキット</td><td>生命技術オーストラリアの</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>の生命技術オーストラリアの</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>生命技術オーストラリアの</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIMEのトランスフェクション緩衝液</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME トランスフェクション試薬</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP(ホスファターゼ阻害剤)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4906837001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotek Gmbh</td><td>gta-100</td><td>アガロースビーズに結合したGFPナノボディ</td></tr><tr><td>N末端GFPモノクローナル抗体&nbsp;</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-118P</td><td>BiFC ベクター内の V1 タグを検出します</td></tr><tr><td>C 末端 GFP モノクローナル抗体</td><td>ロシュ</td><td>11814460001</td><td>BiFC ベクター内の V2 タグを検出します</td></tr><tr><td>サンプルバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td>1 mL &β;-メルカプトエタノールを添加。</td></tr><tr><td>シーケンシンググレード修飾トリプシン</td><td>Promega Corporation</td><td>V5117h</td><td></td></tr><tr><td>LoBind 微量遠心チューブ</td><td>ポイントオブケア診断</td><td>0030 108 116</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149-5G</td> 超純水トリフルオロ酢酸で<td>5 mg / mLで調製</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 - シークワナルグレード</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10628494</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore 固相抽出 C18 ディスク (オクタデシル) - 4.7 cm</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-386-2</td><td>ステージチップを準備するには、適切なサイズのホールパンチを使用して 1 mm ディスクをカットします。または、事前に準備されたステージのヒントも購入することもできます(以下を参照)。</td></tr><tr><td>C18ステージチップ、10 & マイクロ;Lベッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸 OPTIMA LC/MSグレード用 50mL</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FSBA117-50</td><td></td></tr><tr><td>1.9 &mu;m C18 ReproSil 粒子</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.</td><td>固定相粒子</td></tr><tr><td>アセトニトリルオプティマLC/MSグレード&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FSBA955-4</td><td></td></tr><tr><td>Easy-nLC HPLC&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>非イオン性界面活性剤 (100%)</td></tr><tr><td>DH5&α; 細胞</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Heat-shock-competent cells</td></tr></tbody></table>

解離性個体の親和性の浄化 (bicap) によって多蛋白質シグナリング複合体

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

蛋白質の複合体のアセンブリは多くの細胞シグナル伝達経路の調節中枢機構です。生物医学研究の主要な焦点は、どのようにこれらの動的蛋白質の複合体は特定の生物学的応答を送信するために複数のソースからの信号を統合する行動し、どのように多くの病気設定この自由化になる解読です。この重要な生化学的メカニズムの重要性にもかかわらずこれらの多分子シグナリング複合体の特定および敏感なデコンボリューションを容易にすることができます実験技術の欠如があります。
ここでこの欠点については、特定の構造生物学: ナノボディで、我々 が分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) と呼ばれる、タンパク質の否定回路試金の組み合わせにより対処します。この手法は、特定の分離と国連複合体の個々 の蛋白質と競合結合パートナーで形成された複合体の排除の相互作用の蛋白質のペアの下流のプロテオーム解析を促進します。
BiCAP 手法は下流の実験的アッセイの広い配列に適応でき、この手法によって与えられる特異性の高いより微妙な捜査蛋白質複雑なアセンブリの力学、現在よりもを使用して標準的な親和性の浄化技術。

タグ付き BiFC pDEST プラスミドを興味のある遺伝子の組換えの V1 と V2 の生成するクローニングの使用に続く、蛋白質の相互作用のペアを含む 2 つのプラスミドとの共トランスフェクション後の金星の蛍光信号の生成になります約 8 〜 24 時間。それはタンパク質間相互作用が細胞の選択により発生する可能性がない可能な肯定的な信号がない場合は、低トランスフェクション効率または BiFC タグの向きが最適でないです。これらの各シナリオのトラブルシューティングを説明します。
我々 は以前 HEK 293 t 細胞の共トランスフェクション後 〜 16 時間の異なるタンパク質の種類の数のための肯定的な相互作用を観察しました。ユビキチンの結合 E3 ユビキチンリ ガーゼ UBR5、核 (図 3 a)12の内で主に発生するプラズマ膜 (<strong ...

本稿では、二分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) のプロトコルについて説明します。この手法は競合結合パートナーで形成された複合体と同様、国連複合体の個々 のタンパク質を除く、特定の分離と任意の 2 つの相互作用の蛋白質の下流のプロテオーム解析を促進します。

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

この方法は、タンパク質やタンパク質複合体の動的集合がどのようにシグナル伝達経路や細胞の挙動を制御するかなど、細胞生物学や生化学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、相互作用する2つのタンパク質を特異的に単離できる一方で、複合体を持たない個々のタンパク質や競合する結合パートナーを排除できることです。この方法を使用して、乳がんの受容性チロシンキナーゼ二量体化に関する洞察を提供しますが、他の生理学的環境や疾患にも適用できます。この手法を思いついたのは、GFPナノボディがGFPなどの蛍光タンパク質の三次元エピトープを認識することに気づいたときでした。まず、0.2 ミリリットルのチューブに 150 ナノグラムの入口ベクトル、150 ナノグラムの目的地ベクトル、8 マイクロリットルの TE バッファーを追加します。次に、2マイクロリットルのリコンビナーゼとZiMexを加え、2つを短時間遠心分離します。反応を室温で1時間インキュベートした後、1マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートして反応を停止します。次に、ヒートショックコンピテントセルを氷上で解凍します。そして、50マイクロリットルの細胞を14ミリリットルの丸底ポリプロピレンチューブに移します。1マイクロリットルの反応生成物を細胞に加え、穏やかに混合します。細胞を氷上で20分間インキュベートします。次に、細胞を氷に戻す前に、摂氏42度の水浴で細胞に45秒間熱衝撃を与えます。1ミリリットルのLB培地を細胞に加えます。そして、サンプルを摂氏37度で1時間振とうしながらインキュベートします。次に、形質転換をアンピシリンを含む10cmの寒天プレートにプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。プラスミド精製を開始するには、アンピシリンと100ミリリットルのLB培地を大きな円錐形フラスコに加えます。次に、接種ループを使用して、寒天プレートから単一のコロニーを取り出します。接種ループをLB培地に沈め、短時間混合した後、フラスコの上部をアルミホイルで覆い、振とうしながら摂氏37度で一晩インキュベートします。ここから、トランスフェクションを進める前に、標準的なMaxiprepプラスミドDNA精製キットを使用してプラスミドDNAを精製します。まず、10ミリリットルのDMEMを含む10センチメートルの皿にHEK293T細胞を播種します。次に、各二分子蛍光相補ベクター2.5μgを500マイクロリットルのトランスフェクションバッファーで希釈します。トランスフェクション試薬を10マイクロリットル加え、混合物を10秒間ボルテックスします。次に、サンプルを短時間遠心分離し、室温で10分間インキュベートします。次に、DNAトランスフェクション混合物を滴下して皿に加えます。その後、サンプルを8〜24時間インキュベートします。テキストプロトコルに概説されているように、細胞溶解バッファーと補充した細胞溶解バッファーを調製します。次に、細胞を氷冷PBSで2回洗浄します。PBSを吸引し、氷冷した補充細胞溶解バッファーを1mm加えます。次に、皿を氷の上に置き、5分間インキュベートします。次に、セルスクレーパーを使用して細胞を取り出し、冷却したマイクロ遠心チューブに移します。細胞の破片を取除くために4°Cで5分間18、000倍の重力で管を遠心分離し、次に新しいマイクロ遠心分離機の管に透明な上清を移す。1ミリリットルのPBSに適量のアガロースビーズを洗浄し、重力300倍でビーズを遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。次に、各サンプルに20マイクロリットルのアガロースビーズを追加します。そして、摂氏4度で2時間インキュベートし、端から端まで回転させます。ビーズを重力300倍で遠心分離し、細胞溶解バッファーで3回洗浄します。次に、洗浄したビーズを希釈したサンプルバッファー50μLに再懸濁します。最後に、サンプルを摂氏95度で2〜3分間加熱します。この研究では、BiCAP法を使用して、HEK293T細胞の同時トランスフェクションから約16時間後に、いくつかのタンパク質タイプの正の相互作用を観察します。共焦点顕微鏡法は、原形質膜でのRTKERBB2の二量体化、およびユビキチンのE3リガーゼUBR5への結合を観察するために使用されます。GFBナノボディによるアフィニティー精製後、全長のVenusコントロールタンパク質、および相互作用するV1およびV2タグ付きタンパク質のみを共トランスフェクションサンプルで検出できます。この手順を試行する際は、二分子蛍光相補タグの配置、および目的のタンパク質のC末端またはN末端のいずれかの配置を最適化することを忘れないでください。これは、タンパク質/タンパク質の正の相互作用を観察するために必要です。このビデオを見れば、BiCAP技術の実行方法と、それを目的のタンパク質相互作用にどのように適用するかについて十分に理解できるはずです。この手順に続いて、ChIPseekのようなダウンストリームの特性評価手法の多くを使用して、転写因子の二量体化がDNA結合をどのように制御するかなどの追加の質問に答えることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

細胞透過性架橋剤DSP [ジチオビス -...

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。...

二分子蛍光相補

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明...

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

この動画では、コンフォメーション特異的なシングルドメイン抗体を用いて特異的なタンパク質二量体を検出・単離するためのBiCAPという二分子相補型アフィニティー精製のデモを行っています。...

相互作用する2つのタンパク質を単離するための二分子相補的アフィニティー精製

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。...

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

&gt;jove_content&lt;ここでは、真核細胞からのタンパク質複合体の発現、単離、および特性評価のための、新しく、堅牢で、効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法について説明します。このプロトコルは、離散的な複合体の生化学的特性評価、ならびにそれらの機能を調節する新規相互作用因子および翻訳後修飾の同定に利用できる可能性があります。...

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。...

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

分割-BioID、近接ラベリング手法 BioID を用いたタンパク質断片否定回路試金のステップ バイ ステップのプロトコルを提供します。与えられた 2 つのタンパク質の相互作用活性化、彼らのネイティブ...

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

定量多重免疫沈殿(QMI)は、2つのサンプル間の標的タンパク質相互作用の豊富さの違いを敏感に検出するためにフローサイトメトリーを使用します。QMIは、少量の生体材料を用いて行うことができ、遺伝子組み換えタグを必要とせず、以前に定義されたタンパク質相互作用ネットワークに適応させることができる。...

多重共免疫沈殿を用いたタンパク質相互作用ネットワークダイナミクスの定量化

学ぶBiCAP法によるタンパク質相互作用の特定分離技術。GFPナノボディーを利用し、未複合体タンパク質を排除してシグナル伝達経路の動態を解明。細胞生物学・生化学研究に応用可能です。

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

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