解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

この方法は、タンパク質やタンパク質複合体の動的集合がどのようにシグナル伝達経路や細胞の挙動を制御するかなど、細胞生物学や生化学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、相互作用する2つのタンパク質を特異的に単離できる一方で、複合体を持たない個々のタンパク質や競合する結合パートナーを排除できることです。この方法を使用して、乳がんの受容性チロシンキナーゼ二量体化に関する洞察を提供しますが、他の生理学的環境や疾患にも適用できます。

この手法を思いついたのは、GFPナノボディがGFPなどの蛍光タンパク質の三次元エピトープを認識することに気づいたときでした。まず、0.2 ミリリットルのチューブに 150 ナノグラムの入口ベクトル、150 ナノグラムの目的地ベクトル、8 マイクロリットルの TE バッファーを追加します。次に、2マイクロリットルのリコンビナーゼとZiMexを加え、2つを短時間遠心分離します。

反応を室温で1時間インキュベートした後、1マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートして反応を停止します。次に、ヒートショックコンピテントセルを氷上で解凍します。そして、50マイクロリットルの細胞を14ミリリットルの丸底ポリプロピレンチューブに移します。

1マイクロリットルの反応生成物を細胞に加え、穏やかに混合します。細胞を氷上で20分間インキュベートします。次に、細胞を氷に戻す前に、摂氏42度の水浴で細胞に45秒間熱衝撃を与えます。

1ミリリットルのLB培地を細胞に加えます。そして、サンプルを摂氏37度で1時間振とうしながらインキュベートします。次に、形質転換をアンピシリンを含む10cmの寒天プレートにプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。

プラスミド精製を開始するには、アンピシリンと100ミリリットルのLB培地を大きな円錐形フラスコに加えます。次に、接種ループを使用して、寒天プレートから単一のコロニーを取り出します。接種ループをLB培地に沈め、短時間混合した後、フラスコの上部をアルミホイルで覆い、振とうしながら摂氏37度で一晩インキュベートします。

ここから、トランスフェクションを進める前に、標準的なMaxiprepプラスミドDNA精製キットを使用してプラスミドDNAを精製します。まず、10ミリリットルのDMEMを含む10センチメートルの皿にHEK293T細胞を播種します。次に、各二分子蛍光相補ベクター2.5μgを500マイクロリットルのトランスフェクションバッファーで希釈します。

トランスフェクション試薬を10マイクロリットル加え、混合物を10秒間ボルテックスします。次に、サンプルを短時間遠心分離し、室温で10分間インキュベートします。次に、DNAトランスフェクション混合物を滴下して皿に加えます。

その後、サンプルを8〜24時間インキュベートします。テキストプロトコルに概説されているように、細胞溶解バッファーと補充した細胞溶解バッファーを調製します。次に、細胞を氷冷PBSで2回洗浄します。

PBSを吸引し、氷冷した補充細胞溶解バッファーを1mm加えます。次に、皿を氷の上に置き、5分間インキュベートします。次に、セルスクレーパーを使用して細胞を取り出し、冷却したマイクロ遠心チューブに移します。

細胞の破片を取除くために4°Cで5分間18、000倍の重力で管を遠心分離し、次に新しいマイクロ遠心分離機の管に透明な上清を移す。1ミリリットルのPBSに適量のアガロースビーズを洗浄し、重力300倍でビーズを遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。次に、各サンプルに20マイクロリットルのアガロースビーズを追加します。

そして、摂氏4度で2時間インキュベートし、端から端まで回転させます。ビーズを重力300倍で遠心分離し、細胞溶解バッファーで3回洗浄します。次に、洗浄したビーズを希釈したサンプルバッファー50μLに再懸濁します。

最後に、サンプルを摂氏95度で2〜3分間加熱します。この研究では、BiCAP法を使用して、HEK293T細胞の同時トランスフェクションから約16時間後に、いくつかのタンパク質タイプの正の相互作用を観察します。共焦点顕微鏡法は、原形質膜でのRTKERBB2の二量体化、およびユビキチンのE3リガーゼUBR5への結合を観察するために使用されます。

GFBナノボディによるアフィニティー精製後、全長のVenusコントロールタンパク質、および相互作用するV1およびV2タグ付きタンパク質のみを共トランスフェクションサンプルで検出できます。この手順を試行する際は、二分子蛍光相補タグの配置、および目的のタンパク質のC末端またはN末端のいずれかの配置を最適化することを忘れないでください。これは、タンパク質/タンパク質の正の相互作用を観察するために必要です。

このビデオを見れば、BiCAP技術の実行方法と、それを目的のタンパク質相互作用にどのように適用するかについて十分に理解できるはずです。この手順に続いて、ChIPseekのようなダウンストリームの特性評価手法の多くを使用して、転写因子の二量体化がDNA結合をどのように制御するかなどの追加の質問に答えることができます。