のタンパク質複合体の同定大腸菌タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

この実験の目的は、大腸菌由来の天然MultiPro複合体のタンパク質、タンパク質相互作用、およびサブユニット組成を特定することです。これは、配列特異的な線状PCR産物を増幅し、SPAタグおよび選択マーカーをコード化することにより達成され、これらは、細菌を用いたddy3、30バックグラウンドにおけるカルボキシ末端融合としてフレーム内で統合され発現されるFageラムダ組換えシステムを第2ステップとして、牛のモドリンおよびAnti−Flagアフィニティービーズを用いて、低存在量のタンパク質複合体を効率的に回収するために行われる。次に、牛のモドリン、溶出バッファー、またはCEBで言及された結合タンパク質をトリプシンで消化し、タンパク質同定のために質量分析で処理します。

得られた結果は、転写終結、抗決定因子を含むコアRNAポリメラーゼ酵素のいくつかのサブユニットが、タグ付きRNAポリメラーゼサブユニットDタンパク質と効率的に共精製されたことを示しており、このアプローチを使用して新たに関連した成分を効率的に発見できることを示しています。一般に、この方法に不慣れな個体は、2つのラウンドアフィニティー精製に苦労する可能性があり、そこでは、適切な緩衝液による細胞溶解物の慎重な処理が、大規模培養からの低および高存在量の負荷複合体の効率的な回収の成功を確実にするために絶対に必要であるアフィニティー精製および質量分析手順を実証するのは、私の研究室のOlga KaganとHBO郭の2人の技術者である。このプロトコルは、特定の増幅された配列をDDY three 30株に標的化することから始まります。この株では、書かれたプロトコルに記載されているように、ラムダレッド組換え機構が発現されます。

次に、細菌がラムダ組換えシステムをファージするラムダ組換えシステムにより、摂氏32度の2ミリリットルのLuria batiまたはLB培地で一晩でひずみを発現し、翌日180RPMで振とうし、一晩培養した1ミリリットルを500ミリリットルの円錐形フラスコで70ミリリットルの新鮮なLB培地に接種します。OD 600が約0.8に達するまで180 RPMで振とうし、摂氏32度で接種物を成長させます。フラスコを摂氏42度の水浴中で180RPMで15分間穏やかに振とうすることにより、細胞をインキュ

導入直後に、フラスコを氷水スラリー浴中で少なくとも30分間振とうしながらインキュベートします。手順書に記載されたとおりに細胞を回収し、洗浄した後、リースは、細胞ペレットを700マイクロリットルの氷、冷、滅菌水に懸濁し、エレクトロポレーションによりエレクトロコンピテント細胞を作製する。精製したアンプリコンの1マイクロリットルを40マイクロリットルのエレクトロコンピテントセルに導入します。

細胞は、相同組換えおよび統合後にエレクトロポレーションされます。タグスラッシュカセットを染色体に組み換えることに成功した形質転換体は、ウェスタンブロッティング用の複数のトランスフォーマーをマイシン選択できることに対する耐性に基づいて選択され、SPAタグのフラグエピトープに対して選択的なAnti-Flag M 2抗体でSPAタグ融合タンパク質の正しい生成を確認します一晩培養した10ミリリットルを990ミリリットルの新鮮な結核に移します。4リットルのフラスコに1ミリリットルあたり25マイクログラムの缶マイシンを補給

OD 600が2〜3時間に達するまで、250 RPMで5〜6時間絶えず振とうしながら、摂氏32度で培養物を成長させます。1リットルの大腸菌SPAタグ培養物を洗浄遠心分離ボトルに移し、細胞を摂氏4度とGの3,993倍で15分間回転させます。書面によるプロトコルに記載されているように細胞を懸濁した後。

サンプルを氷の上に置いた滅菌ステンレス鋼カップに移し、超音波処理を行います。プローブをサンプルに浸し、3分間超音波処理します。超音波処理後、超音波処理ライセートの遠心分離後にサンプルが過熱しないようにさらに2分間冷却します。

S上清を遠心分離チューブから50ミリリットルのポリプロピレン製ファルコンチューブに慎重に移します。液体窒素を使用してサンプルを凍結し、超音波処理した凍結細胞抽出物をマイナス80°Cで最大6ヶ月間保存します。チューブを冷水に入れることにより凍結超音波処理細胞抽出物のアフィニティー精製を開始するには、TH細胞抽出物を3マイクロリットルのベンゾ、ヌクレアーゼである4°Cの30分間インキュベー

この混合物に、非イオン性洗剤Triton X 100とAnti-Flag M 2つのアグロビーズの200マイクロリットル懸濁液を追加します。3時間の回転後、チューブを摂氏4度で3時間回転させて内容物を静かに混合し、チューブを1,700倍Gで6分間遠心分離します。遠心分離後、緩い速度のペレットを乱さずに、できるだけ多くのセートを慎重に除去します。

残りのSNAにペレットを懸濁し、次いでポリプロピレン調製カラムに移す。カラムの下部の出口プラグを取り外して、溶出液が重力によって排出されるようにします。流れる。次に、カラムをFCバッファー1回分の200マイクロリットルで5回洗浄し、書面によるプロトコルに記載されているようにTEVでクリーブに進みます。

劈開に追従し、カラムの上部と下部の両方でしっかりと切断します。カラム内の内容物を、一晩回転させてから摂氏4度で一晩回転させて穏やかに混合します。溶出液を排出するには、上部キャップと下部プラグを新しいカラムに取り外します。

古いカラムを 400 マイクロリットルの 1 x cal Modlin 結合バッファーと 150 マイクロリットルの懸濁液 Cal Modlin 結合ビーズで洗浄します。結合したタンパク質を50マイクロリットルの4つの画分で、新鮮なeendオルフチューブで溶出します。1 x cal Modlin溶出バッファーを使用。

溶出したフラクションを2本のきれいなeendオーフチューブに等量で分配します。次に、スピードバキュームを使用して両方のチューブの内容物を乾燥させます。一方のチューブから採取した乾燥溶出液は、本文に記載されている銀染色ゲルの泳動に使用され、もう一方のチューブはマイナス80°Cで保存されます。

乾燥サンプルに質量分析における将来の使用のために、50マイクロリットルの消化緩衝液および0.9マイクロリットルの100ミリモルトリスホスフィン塩酸を加え、混合物を室温で45分間インキュベートし、還元ステップのために次に、500ミリモルIDOアセトアミドの1マイクロリットルを加え、さらに40分間暗所でインキュベートする。サンプルのアルキル化を可能にするには 2回目のインキュベーションの後、混合物に1マイクログラムのトリップを追加します。サンプルを摂氏37度で5時間インキュベートするか、インキュベーション後室温で一晩インキュベートします。

必ず1マイクロリットルの酢酸を加えて反応を止めてください。次に、Milliporeのジップチップ、ピペットチップをテキストに記載されているように調製し、ペプチドをチップパイプペップに効率的に結合します。ペプチド混合物を20回混合し、洗浄液を吸引して分注することにより、先端に行ったペプチド混合物を洗い流します。

この手順を2回繰り返して、結合したペプチドを含むチップとチップへのペプチド混合物の効率的な結合を行います。10マイクロリットルの湿潤液とe平衡化溶液を吸引し、きれいなエンドオーフチューブに分注します。この手順を 2 回繰り返します。

溶出したサンプルをスピード真空で乾燥させた後、サンプルは質量分析ですぐに分析するか、使用前に摂氏マイナス80度で保存することができます。この手順で使用するマイクロカラムには、約 10 cm の 3 ミクロンの月面 C 18 樹脂が充填されており、orbitrap 装置と一直線に配置された pro Zion ナノエレクトロスプレーイオン源にインターフェースされています。pro Zion nano flow binary HPLCポンプは、ペプチド分離中に毎分約300ナノリットルの安定したチップ流量を供給するために使用され、ペプチド希釈を達成し、サンプルの複雑さに応じて有機バッファーグラジエントを設定します。

この e coli SPA サンプルでは、移動相溶媒 A には 95% HPLC グラジエント水と 5%アセトニトリルと 0.1% ギ酸が含まれ、溶媒 B には 5%HPLC グラジエント水と 95%アセトニトリルと 0.1% ギ酸が含まれています。質量分析により、ecoli タンパク質配列のデータベースに対して seaquest などのデータベース検索アルゴリズムを使用してスペクトルを検索します。スタークエストなどの確率アルゴリズムを使用して結果を統計的にフィルタリングし、誤発見率を低く抑え、SPAタグ付きRNAポリメラーゼシグマ因子と機能不明のyak LAタンパク質の両方を、アルファベータおよびベータプライムサブユニットを含むコアRNAポリメラーゼ酵素、およびRNAポリメラーゼリサイクル因子と特異的に共精製します。タグ付きRNAポリメラーゼシグマ因子とは対照的に、ヤクLはさらに必須の転写終結抗決定因子に結合し、転写における特殊な機能を示唆しています。

また、RNAポリメラーゼOmegaサブユニットと転写、終結および決定因子、USAおよびNUSDなど、ゲル上では明らかでない他のいくつかの小さな共精製タンパク質もLCMSによって検出されました。一方、硫黄機械の動員をタグ付けした独立した実験では、S-U-F-B-S-U-F-CとSUFDが互いに共精製され、鉄硫黄クラスター生合成に単一の足場複合体として共同で参加していることが示されました。この代表的な例は、重要な生物学的プロセスに関与する、以前によく研究され、高度にアノテーションされた細菌MultiPro複合体が、効率的に同定できる新しい関連成分を持っていることが多いという事実を強調しています。

このアプローチを用いて、SUFBタンパク質の低コピー数は、安定なマルチユニットタンパク質複合体の組成を定義するためのSUFCおよびSUFDプルダウン実験から観察された強い強度に比べて弱いシグナル強度をもたらした可能性があり、ベイト獲物の特異性を考慮に入れることにより、共精製スコアを高信頼性相互作用に割り当てた。 餌餌と獲物の獲物の関係。次に、マークオフ クラスタリング アルゴリズムなどのグラフ クラスタリング手順を使用します。離散的なタンパク質クラスターは、分割された確率的PPIネットワークから同定されます。

推定相互作用ネットワークは、サイトスケープを使用して視覚化できます。プロテオミクスのデータと、ゲノミクス法によって推測される追加の機能的関連性の証拠を組み合わせることで、以前にアノテーションされた大腸菌タンパク質の新たなメカニズムの役割を調査することができます。ここでは、タンパク質複合体のサブネットと、より広範な機能的近傍として関与する機能モジュールが大腸菌で定義されています。

主な階層クラスターGrahamは、機能的に孤立した遺伝子と大腸菌の特徴付けられた遺伝子の機能予測と既存の注釈のパターンを示しており、黄色と青色はそれぞれ既存の機能と推測された機能を表し、陰影の強度は信頼度スコアを反映しています。さまざまな近傍に関連する生物学的プロセスは、右側の挿入図に示されており、統合された物理的および機能的相互作用ネットワークの類似性スコアに基づいて、代表的な近傍の個々のコンポーネントを示しています。このビデオを見れば、アフィニティー精製と質量分析アプローチを組み合わせて、大腸菌由来の安定したタンパク質複合体を分離する方法を十分に理解できるはずです。

原則として、この手法は、膜タンパク質複合体または他の種由来のタンパク質複合体の特性評価に適用でき、可能な限り組み換えることができます。