のタンパク質複合体の同定

この実験の目的は、E. coli由来の天然MultiPro複合体のタンパク質、タンパク質間相互作用、およびサブユニット組成を同定することです。これは、SPAタグと選択マーカーをコードする配列特異的なリニアPCR産物を増幅し、バクテリアFage lambda組換えシステムを用いてddy 3, 3 0背景にカルボキシ末端融合としてインフレームで組み込み、発現させることで達成されます。第二ステップとして、低含有量のタンパク質複合体を効率的に回収するために、cow modlinおよびAnti-Flagアフィニティービーズを用いた二段階精製を行います。次に、cow modlin、溶出バッファー、またはCEBで溶出した結合タンパク質をトリプシンで消化し、質量分析を用いてタンパク質の同定を行います。

得られた結果から、転写終結因子や抗終結因子を含むコアRNAポリメラーゼ酵素の複数のサブユニットが、タグ付きRNAポリメラーゼサブユニットDタンパク質と共に効率的に共精製されたことが示され、この手法を用いることで新たに結合したコンポーネントを効率的に明らかにできることが示唆されました。一般的に、この方法に不慣れな方は2回の親和性精製に苦労することがありますが、大規模培養から低含有量および高含有量の複合体を効率的に回収して成功させるには、適切な緩衝液を用いて細胞溶解物を慎重に処理することが不可欠です。親和性精製および質量分析の手順は、私の研究室の技術者であるOlga KaganとHBO guoが実演します。本プロトコルは、書面によるプロトコルに記載されている通り、Lambda red組み換え機構が発現しているDDY 3 30株への特定の増幅配列の導入から始まります。

次に、バクテリオファージLambda組み換えシステム発現株を、2 mLのLuria-Bertani（LB）培地を用い、32 °C、180 RPMで振盪しながら一晩培養します。翌日、この一晩培養した菌液1 mLを、500 mLコニカルフラスコに入れた70 mLの新鮮なLB培地に接種します。接種した菌液を32 °C、180 RPMで振盪しながら、OD 600が約0.8に達するまで培養します。その後、フラスコを42 °Cのウォーターバスに入れ、180 RPMで緩やかに振盪しながら15分間インキュベートし、細胞を誘導します。

誘導直後、フラスコを氷水スラリーバスに入れ、振盪しながら少なくとも30分間インキュベートします。記載の手順に従って細胞を回収し洗浄した後、細胞ペレットを700 µLの氷冷滅菌水に再懸濁し、エレクトロポレーションによるエレクトロコンピテント細胞を作成します。精製したアンプリコン1 µLを、40 µLのエレクトロコンピテント細胞に導入します。

相同組換えおよび組み込み後、細胞にエレクトロポレーションを行います。タグ/カセットを染色体に正しく組換えさせた形質転換体を、カナマイシン耐性に基づいて選別します。複数の形質転換体を選出し、SPAタグのFlagエピトープに特異的なAnti-Flag M2抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、SPAタグ融合タンパク質が正しく生成されていることを確認します。4Lフラスコ内の25 µg/mLのカナマイシンを添加した新鮮なTB培地990 mLに、オーバーナイト培養液10 mLを移します。

OD 600が2から3の間になるまで、32 °Cで250 RPMの定常振盪を行い、5〜6時間培養します。1 LのE. coli SPA tag培養液を清潔な遠心チューブに移し、4 °C、3,993 ×gで15分間遠心分離します。その後、記載のプロトコルに従って細胞を再懸濁します。

サンプルを氷上に置いた滅菌済みステンレス製カップに移し、超音波処理を行います。プローブをサンプルに浸し、3分間超音波処理します。超音波処理後、超音波破砕ライセートを遠心分離する前に、過熱したサンプルを冷却させるため、さらに2分間静置します。

遠心管からS上清を50 mLのポリプロピレン製ファルコンチューブに慎重に移します。液体窒素を用いてサンプルを凍結させ、超音波処理した凍結細胞抽出物を、今後の使用に備えて-80 °Cで最大6か月間保存します。凍結した超音波処理細胞抽出物のアフィニティー精製を開始するため、チューブを冷水に浸し、3 µLのベンゾヌクレアーゼと共にTH細胞抽出物を4 °Cで30分間インキュベートします。

この混合液に、非イオン性界面活性剤Triton X 100とAnti-Flag M2アガロースビーズ懸濁液200 µLを加えます。チューブを4 °Cで3時間回転させ、緩やかに混合します。3時間の回転後、チューブを1,700 ×gで6分間遠心分離します。遠心分離後、緩い沈殿物を乱さないように注意しながら、上清を可能な限り慎重に除去します。

ペレットを残りのSNAで再懸濁し、ポリプロピレン製精製カラムに移します。カラムの底部にある流出口プラグを取り外し、溶出液が重力によって流れるようにします。次に、1倍のFCバッファー200 µLでカラムを5回洗浄し、記載されたプロトコルに従ってTEVによる切断に進みます。

切断後、カラムの上下両端をしっかりと密閉します。4°Cで一晩回転させ、カラム内の内容物を穏やかに混合します。その後、上部キャップと底部プラグを取り外し、溶出液を新しいカラムに回収します。

1x Cal Modlin結合バッファー400 µLと、Cal Modlin結合ビーズ懸濁液150 µLで古いカラムを洗浄します。1x Cal Modlin溶出バッファーを用いて、結合したタンパク質を新しいエッペンドルフチューブに50 µLずつ4分画で溶出します。

溶出画分を2本の清潔なエッペンドルフチューブに等量ずつ分注します。次に、スピードバキュームを用いて両チューブの内容物を乾燥させます。一方のチューブで乾燥させた溶出液は、本文に記載されている通り銀染色ゲルに使用し、もう一方は-80 °Cで保存します。

質量分析での今後の使用に備え、乾燥試料に50 µLの消化バッファーと0.9 µLの100 mM Tris-HClを添加し、還元ステップとして室温で45分間インキュベートします。次に、1 µLの500 mM iodoacetamideを添加し、試料をアルキル化させるため、暗所でさらに40分間インキュベートします。2回目のインキュベート後、混合物に1 µgのtrypsinを添加します。インキュベーション後、試料を37 °Cで5時間、または室温で一晩インキュベートします。

1 µLの酢酸を添加して、必ず反応を停止させてください。次に、ペプチドをチップに効率的に結合させるため、本文の説明に従ってMillipore zip tip（ピペットチップ）を準備します。ペプチド混合物を20回混合し、洗浄液を吸引および吐出することで、チップに結合しなかったペプチド混合物を洗い流してください。

ペプチド混合物をチップに効率的に結合させるため、この手順を2回繰り返します。ペプチドが結合したチップを用いて、濡れおよび平衡化溶液を10 µL吸引し、清潔なエッペンドルフチューブに分注します。このステップを2回繰り返します。

迅速真空濃縮機で溶出サンプルを乾燥させた後、サンプルを直ちに質量分析にかけるか、使用前に-80°Cで保存します。本手順で使用するマイクロカラムには、約10 cmの3 µm Lunar C18樹脂が充填されており、Orbitrap装置に直結したProZionナノエレクトロスプレーイオン源に接続されています。ペプチド分離中のチップ流量を約300 nL/minで安定して供給するためにProZionナノフローバイナリーHPLCポンプを使用し、サンプルの複雑度に応じて有機バッファーグラジエントを設定してペプチドの希釈を行います。

このE. coli SPAサンプルの場合、移動相溶媒Aは0.1%ギ酸を含む95%HPLCグレード水および5%アセトニトリルであり、溶媒Bは0.1%ギ酸を含む5%HPLCグレード水および95%アセトニトリルである。質量分析後、Sequestなどのデータベース検索アルゴリズムを用いて、E. coliタンパク質配列データベースに対してスペクトル検索を行う。偽発見率を低く抑えるため、StarQuestなどの確率アルゴリズムを用いて結果を統計的にフィルタリングする。その結果、SPAタグ付きRNAポリメラーゼシグマ因子と機能未知のyakLAタンパク質の両方が、α、β、およびβ'サブユニットを含むコアRNAポリメラーゼ酵素、ならびにRNAポリメラーゼリサイクリング因子と共に特異的に共精製された。タグ付きRNAポリメラーゼシグマ因子とは対照的に、yakLは必須の転写終結アンチターミネーション因子にもさらに結合しており、転写における特殊な機能が示唆された。

LC-MSにより、ゲル上では確認できなかったRNAポリメラーゼOmegaサブユニット、転写終結および決定因子、USA、NUSDを含む、いくつかの他の小さな共精製タンパク質も検出されました。対照的に、タグ付きの硫黄動員機構を用いた独立した実験では、S-U-F-B、S-U-F-C、およびSUFDが互いに共精製されており、単一のスキャフォールディング複合体として鉄硫黄クラスター生合成に共同で関与していることが示されました。この代表的な例は、必須の生物学的プロセスに関与し、以前から十分に研究され高度にアノテーションされた細菌のMultiPro複合体であっても、効率的に同定可能な未知の関連成分を有していることが多いという事実を強調しています。

この手法を用いると、SUFBタンパク質のコピー数が少ないため、SUFCおよびSUFDのプルダウン実験で観察された強い強度と比較して、信号強度が弱くなった可能性があります。安定した多量体タンパク質複合体の組成を定義するために、ベイト-プレイ、ベイト-ベイト、およびプレイ-プレイ関係の特異性を考慮して、信頼性の高い相互作用に共精製スコアを割り当てました。その後、マルコフクラスターアルゴリズムのようなグラフクラスターの手法を用いました。これにより、分割された確率的PPIネットワークから個別のタンパク質クラスターが特定されます。

推定される相互作用ネットワークは、Cytoscapeを用いて可視化できます。プロテオミクスデータに、ゲノミクス手法によって推論された追加の機能的関連性の根拠を組み合わせることで、すでにアノテーションが付与されているE. coliタンパク質の新たな機序的な役割を調査することが可能です。ここでは、より広範な機能的近傍として関与するタンパク質複合体および機能モジュールのサブネットワークをE. coliにおいて定義しました。

メインの階層的クラスタリング図（Graham）は、e coli の機能未知遺伝子および機能既知遺伝子における機能予測と既存のアノテーションのパターンを示しています。黄色と青色の配色はそれぞれ既存の機能と推論された機能を表し、色の濃淡は信頼度スコアを反映しています。さまざまな近傍に関連する生物学的プロセスが右側に示されており、挿入図では、統合された物理的・機能的な相互作用ネットワークの類似性スコアに基づいた代表的な近傍の個々の構成要素が示されています。このビデオを視聴することで、アフィニティー精製・質量分析（AP-MS）法を用いて e coli から安定したタンパク質複合体をどのように単離できるかについて、十分な理解を得ることができます。

原理的に、この手法は膜タンパク質複合体や、組換え可能なあらゆる他の種のタンパク質複合体の特性解析に適用できます。