Name: のタンパク質複合体の同定大腸菌タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 学ぶシーケンシャルペプチドアフィニティ精製とタンデム質量分析を用いた大腸菌タンパク質複合体の同定法。低豊度タンパク質複合体の効率的な回収と相互作用解析が可能です。

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この作品は、イノベーションのためのカナダの財団、ゲノムカナダ、オンタリオゲノム研究所、イノベーションのオンタリオ州省、JGとAE赤発現大腸菌にヘルスリサーチ助成のカナダの協会からの資金によってサポートされていました大腸菌株DY330は、ドナルド·L·コート（米国国立がん研究所、フレデリック、メリーランド州）からの親切な贈り物だった。

1。 大腸菌における遺伝子固有のSPA-タギングの構築大腸菌 DY330ひずみ<ol><li> SPA-タグのDNA配列及びカナマイシン抗生物質耐性マーカーカセット（菅R）が包含プラスミドpJL148は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅7のテンプレートとして使用されています。 27 BP（5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 &#39;）タグ特異的なフォワードプライマーとフレーム内の標的遺伝子の終止コドンのすぐ上流に位置する45 ntの遺伝子特異的なフォワードプライマー、および45 ntの遺伝子特異的リバースプライマーは、すぐに位置して94：27 BP（5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;）タグ特異的リバースプライマーを用いたフレーム内の標的遺伝子の終止コドンの下流には、以下のPCRサイクリング条件を用いpJL148からSPAタグと菅Rのカセットを増幅するために使用される5分間℃、1分間、68で1分間、55°C、10分間68℃に続いて2分10秒の場合はC、94°Cの30サイクル。これらの増幅された配列は、サーブ異所的に導入されたλ-赤相同組換え用機械の基板（下記参照）。 </li><li> PCR産物は、エレクトロポレーションを妨げる可能性が塩を除去するためにQIAQUICK PCR精製キットを用いて精製する。精製したPCR産物は、その後、λ-赤組換え機構が10を発現しているDY330株における特定の遺伝子の3 &#39;末端（ネイティブ終止コドンのすぐ上流側）に統合することをターゲットにしています。 </li><li> DY330λ - レッド発現株を180 rpmで振とうすることにより、32℃で2ミリリットルルリア - ベルターニ（LB）培地中で一晩増殖されています。一晩培養した培養液の1ミリリットルは続いて500ミリリットルの三角フラスコに70 mlの新鮮なLB培地に接種する。接種は、OD 600が約0.8に達するまで、180 rpmで振とうすることにより、32℃で栽培されています。 </li><li>文化は、穏やかに振とうすることにより細胞を42℃の水浴中でフラスコをインキュベートすることによって誘導される新鮮な250ミリリットルの三角フラスコ、°Cに転送されます15分間180回転。すぐに誘導した後、フラスコを振とうしながら、少なくとも30分間氷水スラリー浴でインキュベートする。 </li><li>氷のように冷たい文化は直ちに予冷50mlポリプロピレンチューブに移し、4℃で6分間3993 xgで遠心分離にかけ℃です。細胞ペレットを50mlの氷冷滅菌水に再懸濁し、4℃で6分間3993 xgで再び遠心分離する細胞ペレットを冷水1mlに再懸濁し、1.5ミリリットルEffendorfチューブに移し、4℃で20秒間、最大速度で遠心分離する氷冷水で2または3回の洗浄工程後、細胞ペレットを電気コンピテントセルで、その結果、氷冷滅菌水700μlにようやく再懸濁する。 </li><li>エレクトロポレーションにより、精製されたアンプリコンの1μlをエレクトロコンピテントセル40μlの中に導入される。 2.5kVで、パルスで25μF：細胞は、次の設定を使用してバイオ·ラッドGenePulser IIに​​エレクトロポアール200Ωのコントローラ。相同組換えと統合した後、正常染色体へのタグ/カセットを換え形質転換体は、菅（ 図1A）に対する耐性に基づいて選択されます。複数の形質転換体はウェスタンSPA-タグのFLAGエピトープに対する選択的な抗FLAG M2抗体によるSPA-タグ融合タンパク質の正しい世代（ すなわち、正信号）を確認するためにブロッティング用に選択されます。 </li><li>確認されたカルボキシ末端のSPA-タグ融合株は、SPA精製プロトコルを使用して採取された細胞から可溶性タンパク質複合体を単離するために、大規模で培養する。アフィニティータグ精製操作に必要な手順の概要を図1Bに示されている。 </li></ol> 2。培養すると超音波処理<ol><li> SPA-タグE.100μlを接種する50ミリリットルTerrificブロス（TB）に大腸菌グリセロールストックは、液体培地は、25μg/ mlのOの50μlを補充250ミリリットルの三角フラスコ中のf菅ソリューションを提供します。 32℃で一晩培養する 注：ひずみDY330の温度誘導性λ赤カセットは温度感受性リプレッサー10の制御下にあるので、SPA-タグ大腸菌株は、32℃で栽培されている </li><li> 4リットルのフラスコに菅の25μg/ mlのを補足した990ミリリットル新鮮結核に一晩培養液10ミリリットルを転送します。 OD 600が約2〜3に達するまで培養は、32℃で一定には5〜6時間、250rpmで振盪しながら成長させる。 </li><li> 1リットルEを転送大腸菌は、SPA-タグ·文化遠心ボトルをきれいにし、15分間ベックマン℃·J6-HCの遠心分離機@ 3993×gで4℃で細胞を回転させる。 </li><li>上清を遠心分離ボトルから削除されます。 大腸菌を懸濁する超音波処理緩衝液25mlを大腸菌細胞ペレット。すべての回で、氷上で遠心ボトルを維持することを確認します。 </li><li>再懸濁ペレットです50ミリリットルポリプロピレンファルコンチューブに移し、液体窒素を用いて凍結した。凍結細胞は-80℃で長期使用するために保存されます。 </li><li>超音波処理に先立って、氷の上にペレットを保つことによって完全に凍結細胞を解凍します。解凍されたサンプルは、超音波処理のために氷上に置い滅菌ステンレス製のカップに移しています。プローブを試料に浸漬し、3分間超音波処理する。追加の2分間は過熱から試料を冷却する。 </li><li>超音波処理した細胞溶解液をあらかじめ冷却滅菌遠心管に移し、そして二回15分間、JA-17ローター@ 35267×gで（16,000 rpm）を用いてベックマン遠心機で、4℃で遠心分離にかけられる。 注：私達は膜タンパク質である画分にわからないので、膜タンパク質の精製の ​​場合には、超音波処理した細胞溶解液を15分間遠心分離し、一度だけ、それはペレット中または上清画分のいずれかです。だからmemの過剰損失を避けるためにブレーンタンパク質は、我々は、高速遠心分離で15分間細胞をスピンさせ、上清を、その後1％の洗剤が膜タンパク質を可溶化するために使用されている場所（以下の手順を参照）精製のために処理されます。 </li><li>遠心チューブから上清を慎重に50ミリリットルポリプロピレンファルコンチューブに移し、液体窒素を用いて凍結されています。超音波処理した凍結細胞抽出物は、将来の使用のために-80℃で6ヶ月の最大期間保存されています。 </li></ol> 3。親和性精製<ol><li>使用前に、抗FLAG M2ビーズ100μlのAFCバッファー（30mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、0.1％の洗剤、および0.1から0.5 mMのTCEP [トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィンの10倍量で洗浄する-洗剤なし塩酸]）と還元剤TCEP（トリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン）。 </li><li>凍結、超音波処理した細胞抽出物を冷たい水にチューブを配置することにより、解凍する。解凍した細胞抽出物をベンゾを3μlとインキュベートされる4℃で30分間naseヌクレアーゼこの混合物に、非イオン性界面活性剤トリトンX-100（界面活性剤の最終濃度が0.1％であるべきである）と抗FLAG M2アガロースビーズを200μlの懸濁液を追加します。 注：すべての可溶性タンパク質の精製の ​​ために、0.1％トリトンX-100などのC12E8（オクタエチレングリコールドデシルエーテル）などの膜タンパク質は、別の軽度の非イオン性界面活性剤を精製するために、DDM（非特異的吸着を最小限に抑えるために使用されn-ドデシル-β-D-マルトシド）とマルトースネオペンチルグリコール（MNG）の可溶化を高めるために、1％の界面活性剤の濃度で使用することができます。別の洗剤は、膜タンパク質の可溶化効率を変化しているので、複数の洗剤を使用して独立したタンパク質の精製を行うことを推奨します。 </li><li>コンテンツは℃LabQuake振とう機を用いて4℃で3時間真空管を回転させることにより穏やかに混合しています。回転の3時間後、チューブを6分間1700 xgで遠心分離する。上清はその後rです緩いビーズペレットを乱さずに、できるだけ、慎重にemoved。 </li><li>ペレットは、残りの上清中に再懸濁させ、その後0.8×4センチメートルBio-Rad社製ポリプロピレンプレップカラムに転送されます。溶出液は、重力流によって排水できるようにするために、カラムの底コンセントプラグを削除することを確認します。 TEV切断工程でカラムを5回洗浄します。 </li><li>洗浄された溶出液を排出した後、カラムの底部出口が閉鎖されている。同じ列に、切断は、カラムにTEVプロテアーゼおよび1X AFCのバッファーを400μlの約5から10μL（50単位）を追加することによって行われます。キャップ付きの列の上部を閉じることを確認します。ビーズを含む列がLabQuake振とう機を用いて4℃で一晩一晩静かに回転される。 </li><li>列の下部に上部とコンセントプラグのキャップを外し、10により洗浄されるカルモジュリンセファロースビーズを200μlの懸濁液を含有する新鮮な列にTEV切断後に回収した溶出液を排出カルモジュリン結合バッファーのボリューム。 </li><li>と塔の上下両方がしっかりと固定され、列の内容は℃のLabQuake振とう機を用いて4℃で3時間回転させることにより穏やかに混合する。 </li><li>回転の3時間後、溶出液をカラムの上部のキャップと底栓を除去することによって排出される。列は、カルモジュリンの洗浄バッファー400μLで1ジェントな洗浄が続く1Xカルモジュリン結合バッファー200μlで4回洗浄する。 </li><li>結合したタンパク質を1Xカルモジュリン溶出緩衝液を用いて新鮮なエッペンドルフチュー​​ブに50μlの4画分に溶出されます。溶出画分を等量の2つのきれいなエッペンドルフチュー​​ブに分配されます。両方の管が続いて高速真空を使用して乾燥させる。 </li><li>他の前の質量分析を使用し、-80℃に保存されているときに、もう1つの管からの溶出液を乾燥させ、銀染色ゲルを実行するために使用されます。 </li></ol> 4。銀染色<ol><li>銀staini用NG、3X SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、サンプルバッファの半分のボリュームは、乾燥した溶出液の50μlに追加されます。 5分間煮沸した後、試料をSDSポリアクリルアミドゲル上にロードされます。 </li><li>ゲルの実行が終了した後、それを慎重に固定液に入れられ（50％メタノールと10％酢酸）と20分間ロータリーシェーカーで穏やかに攪拌されています。その後、ゲルを10分間、20％エタノールでリンスする。 </li><li>固定されたゲルは低い均一な背景を確実にするために10分間再蒸留水500mlで2回徹底的に洗浄する。 </li><li>その後、ゲルを20秒間、蒸留水で2回の洗浄工程に続いて1分間、500mlのチオ硫酸ナトリウムで穏やかに攪拌されています。 </li><li>水を捨て、ゲルを30分間0.1％硝酸銀の200ミリリットルでインキュベートする。その時間が経過した後、硝酸銀が削除され、ゲルは、過剰の硝酸銀を削除するには、20秒間、蒸留水で洗浄する。 </li><li>ゲルがついに75mlに撹拌手である現像液の。所望の強度が達成されると、現像液は廃棄され、酢酸80mlを加えて反応を停止しています。ゲルのバンドの適切な可視化のための20分間の最小値に対して酢酸でゲルをインキュベートすることを確認します。 </li></ol> 5。質量分析のためのタンパク質分解とサンプルの調製<ol><li>乾燥した試料に、消化緩衝液50μlおよび100mM TCEP-塩酸（トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィン-塩酸）0.9μlを添加し、室温で45分間混合物をインキュベート 還元工程のために。次に、500mMのヨードアセトアミドを1μl添加し、サンプルのアルキル化を可能にするために別の40分間、暗所でインキュベートする。 </li><li>インキュベーションの第二ラウンド後、この混合物に固定化トリプシンの1μgを追加し、5時間または室温で一晩37℃でインキュベートどちらか。酢酸1μlを加えて反応を停止することを確認します。 </li><li>プリウェットMillipo湿潤および平衡溶液10μlを吸引による再ジップヒントピペットチップ。無駄にするソリューションを免ずる。その後、洗浄溶液10μLを吸引し、無駄にするソリューションを免ずる。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>先端までのペプチド混合物の効率的な結合は、ピペットは、ペプチド混合物を20回混ぜる。先端に付着したペプチド混合物を吸引し、洗浄溶液を分注することにより洗い流される。先端までのペプチド混合物の効率的な結合のために二度、この手順を繰り返します。 </li><li>結合したペプチドを含む先端で、湿潤および平衡溶液10μlを吸引し、クリーンなエッペンドルフチュー​​ブに分注する。この工程を2回繰り返します。使用する°Cの前速度、真空中で溶出した試料を乾燥させた後、試料を質量分析によって直ちに解析することができ、または-80℃で保存。 </li></ol> 6。 LTQオービトラップVelos質量分析計によるタンパク質同定木曜日隔離された複合体の電子ポリペプチド成分はのLTQオービトラップVelosハイブリッドタンデム質量分析計を使用して識別されます。オービトラップは高速Velosイオントラップしながら、コントロール精製で検出無関係な非特異的なバックグラウンド汚染物のMS / MSサンプリングを最小限に抑えることが非常に優れた解像力（&gt; 60,000全幅半値か、FWHM）と質量精度（&lt;2 ppm）を持ってコンポーネントは、電子移動解離と衝突誘起解離の両方のモードを使用して、低濃度のペプチドを検出およびフラグメントすることができます。結果としてMS / MSスペクトルの間で高い信頼マッチはリファレンスEにマップされSEQUESTとSTATQUEST 11のような確率アルゴリズムの実行中は、評価した各照合シーケンスなどのデータベース検索アルゴリズムを使用して大腸菌タンパク質配列。合計スペクトル番号、陰性コントロール（ すなわち 。モック）精製で検出されたペプチド配列の一意性と共通のバックグラウンド汚染物質をfalse-DISロー経験を達成するために考えられているcovery率。次の手順は、タンパク質の同定のために実行されています： <ol><li>マイクロカラムが3μmルナ〜C 18樹脂の約10 cmの満員とオービトラップ器に沿って配置されProxeonナノエレクトロスプレーイオン源にインタフェースされています。 </li><li> ProxeonナノフローバイナリHPLCポンプは、ペプチド分離の間に約300 nlの分-1の安定した先端流量を提供する目的で使用されます。 </li><li>ペプチド溶出を達成するために、有機緩衝勾配は、サンプルの複雑さに応じて設定されています。たとえば、次のような勾配は、通常、 大腸菌用に設定されている大腸菌 SPA のサンプル：溶媒Bは1分間100パーセントで開催された次の4分間、100％に、38分で24％に、1分間に2〜6％から増加しているが、その後、1分で2％に減少そして最終的には15分間2％に保持します。溶媒Bが5％、HPLCグラジエント水および0.1％ギACIと95％ACNを有しているが、0.1％のギ酸と95％HPLCの勾配の水と5％ACNを持って移動相溶媒D。針の先端で流量を60分間300 nlの分-1に設定されます。 </li><li>質量分析計サイクルが60,000の解像度でフル1質量走査を介して実行すると、10併用タンデムフラグメント化質量スキャンが最も強烈な前駆体イオンのために収集されています。動的除外、モノアイソトピック質量の選択、およびリアルタイムデータ依存取得装置機能が有効になっています。 </li><li>スペクトルは、例えば大腸菌のデータベースに対するSEQUESTなどのデータベース検索アルゴリズムを用いて検索されます大腸菌のタンパク質配列し、その結果を統計的に低い偽の発見率を確保するためにそのようなSTAQUEST 11として確率アルゴリズムを使用してフィルタリングされます。マッチが理論的なペプチド質量に比べて10 ppmの質量誤差を示すさらなる検討の対象から除かれている間のみ、高い信頼性（99％確率）候補が、選択されています。 </li></ol>

<ol><li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096(2009).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Mak, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+functional+proteomics+approach+identifies+chromatin+remodeling+complexes+important+for+the+induction+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency.</a> Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).</li>
<li>Polanowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+immunoaffinity+purification+of+protein+complexes+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 36, 778-782 (2004).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
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<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%2C+a+generic+large+scale+proteomic+investigation+strategy+for+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals.</a> Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).</li>
<li>Vlasblom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenePro%3A+a+Cytoscape+plug-in+for+advanced+visualization+and+analysis+of+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks.</a> Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).</li>
<li>de Berardinis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで説明するSPAベースAPMSアプローチの重要な側面は、タギングがそれによって正常な遺伝子調節を確保し、自然な染色コンテキスト内で実行される維持（ すなわち 。ネイティブ餌プロモーターが保持され、それ故に発現レベルが乱されていない）と安定的に結合したネイティブであるということですタンパク質複合体は、近内在性レベルで回収される。オペロンの極性の問題は、選択マーカーで外向き志向のプロモーターを含むことによって避けられる。このSPA-タギングの手法は、サブユニットは、細菌の細胞あたりわずか数分子にまで表現されている場合であっても、膜関連アセンブリを含む、ほぼ均一に低濃度の複合体の成分を浄化するのに十分な効果があります。全体的に、このプロトコルは、 大腸菌でタグ付けされた可溶性タンパク質の大規模セットを精製するために容易にスケールアップすることができます大腸菌又は原則としてコンビ経由タギングが可能な他の細菌種、またはtransformaその保有は当然高いもの標的遺伝子ノックアウト13のひずみライブラリを構築するために、例えば、使用されているアシネトバクター、細菌の遺...

<table><tbody><tr><td colspan="4">I. 抗生物質</strong</td></tr><tr><td>>Kanamycin</td><td>Bioshop</td> <td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Bioshop</td> <td>#AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2.Terrific-Broth medium</td></tr><tr><td>Bio-Tryptone</td><td>Bioshop</td> <td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Bioshop</td> <td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td> <td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td> <td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3.細菌株とプラスミド</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al.(2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>ゼグーフet al.(2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4.PCRおよび電気泳動試薬</strong</td></tr><tr><td>>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 X PCRバッファー</td><td>Fermentas</td><td>#EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td>#EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td>#EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>#AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Loading染料</td><td>NEB</td> <td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td> <td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Bioshop</td> <td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5.プラスミド単離およびクリーンアップキット</td></tr><tr><td>プラスミドMIDIキット</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6.PCRおよび形質転換装置</ストロング></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm エレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg;CウォーターバスシェーカーInnova</td><td></td><td>3100</td><td></td></tr>ベ<tr><td>ックマンコールターTJ-25遠心分離機</td><td>ベックマンコール</td><td>ターTS-5.1-500</td><td></td></tr><tr><td>32 &deg;C シェーカー</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィック アメリカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg;C 大型シェーカー</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィック、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 >Cプレートインキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">7.電気泳動およびウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>アクリルアミドモノマー、N,N'-メチレンビスアクリルアミド</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-ブタノール</td><td>Sigma</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td> <td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman No. 1 ろ紙</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr><td>Mini protean 3 cell</td><td>Bio-Rad</td><td>#165-3301</td><td></td></tr><tr><td>iBlot gel transfer device</td><td>Invitrogen</td> <td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membranes</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Flag M2 antibody</td><td>Sigma</td> <td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Horserad peroxidase</td><td>Amersham</td> <td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>Pre-stainedタンパク質分子量標準</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>化学発光試薬</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>オートラジオグラフィーフィルム</td><td>Clonex Corp</td> <td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>Quick Draw 吸い取り紙</td><td>Sigma</td> <td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>C2 platform rocking shaker</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"><強い>8。超音波処理装置および試薬</strong</td></tr><tr><td>>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td> <td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">9.Affinity Purification 試薬および装置</td></tr><tr><td>0.8 x 4 cm Bio-Rad ポリプロピレンカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>#732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 agarose beads</td><td>Sigma</td> <td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin-sepharose beads</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100 Σ</td><td></td> <td>Σ #T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td> <td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Σ</td> <td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake シェーカー</td><td>サーモリン</td> <td>#59558</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10.銀染色試薬</強></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>バイオショップ</td> <td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>バイオショップ</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>チオ硫酸ナトリウム</td><td>Sigma</td> <td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>硝酸銀</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>バイオショップ</td> <td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>Bioshop</td> <td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11.蛋白質の同一証明のための試薬そして装置 </td></tr><tr><td>Trypsin Gold、質量分析の等級</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td> <td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td> <td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma</td> <td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Formic酸性</td><td>シグマ</td> <td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td>Sigma</td><td>#95304</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>Sigma</td><td>#16125</td><td></td></tr><tr><td>ミリポア ジップチップ</td><td>ミリポア</td><td>#ZTC18M960</td><td></td></tr><tr><td>~10 cm of 3 &mu;m Luna-C18 樹脂</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano HPLC ポンプ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos 質量分析計</td><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td><td></td></tr>ック<tr><td colspan="4">12.実験器具</ストロング></td></tr><tr><td>4リットル 円錐形フラスコ</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>50 ml ポリプロピレン製ファルコンチューブ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロ遠心チューブ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 円錐形フラック</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 滅菌培養チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg;C 冷凍庫</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>スピード真空システム</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g 酵母抽出物 2% Glycerol 50 ml カリウム塩ストックsolution 2.カリウム塩原液 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3.超音波処理バッファー 20 mM Tris-HCl（pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 10%グリセロール 使用前にプロテアーゼ阻害剤（PI)と0.1-0.5 mM TCEP 4を加えてください。AFCバッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.1% 界面活性剤 使用前にPIと0.1-0.5 mM TCEP 5.TEV切断バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 0.2 mM EDTA 0.1% 界面活性剤 使用前にPIと0.1-0.5 mM TCEP 6.カルモジュリン結合バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% 界面活性剤 使用前に、PIと0.1-0.5 mM TCEP 7.カルモジュリン洗浄バッファー 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8.カルモジュリン溶出バッファー 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9.現像液(1L) 37%ホルムアルデヒド 30 g炭酸ナトリウム 1000ml蒸留水 10。消化バッファー 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11.0.1%ギ酸</pに含まれる70%アセトニトリル(ACN) > <12 jove_step">12.洗浄液 0.1%ギ酸</p中の100%H2O></td></tr></tbody></table>

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

ほとんどの細胞プロセスを高分子アセンブリによって媒介されているので、タンパク質-タンパク質相互作用（PPI）および多タンパク質複合体のサブユニット組成の同定を体系的に同定は、遺伝子の機能への洞察を提供し、生物学的システム1,2の理解を高めることができます。物理的な相互作用は、質量分析法（APMS）と組み合わせて染色体タグ融合タンパク質のアフィニティー精製に基づいて近い生理的条件下で内因性のタンパク質複合体の高い信頼vialargeスケールの単離および特性をマッピングすることができます。このアプローチは正常酵母、ハエ、虫、哺乳類細胞、細菌1月6日を含め進化的に多様な生物に適用されています。特に、我々はGEを使用して、培養したグラム陰性大腸菌からアフィニティー精製、天然のタンパク質複合体のためのカルボキシ末端シーケンシャルペプチドアフィニティー（SPA）をデュアルタギングシステムを生成した基礎生物学と生物1、2、7の保存プロセスのゲノムワイドな研究に適していnetically-扱いやすいホスト実験室株。当社SPA-タグシステムは、酵母8,9のために最初に開発されたタンデムアフィニティー精製法に類似していて、非常に特異的なタバコエッチウイルス （TEV）プロテアーゼと3つのコピーの切断部位が続くカルモジュリン結合ペプチド（CBP）から構成されていFLAGエピトープ（3X FLAG）の、親和性濃縮の2連続ラウンドを可能にする。カセットの増幅後、SPA-タグおよび選択可能なマーカーをコードする配列特異線形PCR産物が統合されており、一時的に非常に効率的な異種バクテリオファージラムダ組換え系10の発現が誘導さDY330背景にカルボキシ末端融合としてフレームで表現されます。カルモジュリンと抗FLAGアフィニティービーズを使用して、後続のデュアルステップ精製が高度に選択が可能大規模な文化からでも低濃度のタンパク質複合体と効率的な回収。タンデム質量分析を高感度（低ナノグラム検出限界）で安定して共同精製タンパク質を同定するために使用されます。 ここでは、 大腸菌由来の可溶性タンパク質複合体の精製と質量分析ベースの分析、我々は一般的に体系的タンパク質のタグ付けに使用する詳細なステップバイステップの手順を説明します大腸菌 、スケールアップと潜在的にコンビに従順である特定の日和見病原体を含む他の細菌種に合わせて調整することができます。結果の物理的相互作用は、しばしば小説序のリンクを示唆して興味深い予想外のコンポーネントと接続を明らかにすることができます。予測はBI内多タンパク質複合体のグローバルな分子組織の解明を容易にすることができますこのような遺伝的（遺伝子遺伝子）の相互作用とゲノム·コンテキスト（GC）などの代替分子会合データとPPIデータの統合ological経路。 大腸菌に対して生成されたネットワーク大腸菌は、機能アノテーションは現在欠けているために他の微生物のオーソログ遺伝子産物の機能アーキテクチャへの洞察を得るために使用することができます。

内因性レベルで発現させたタグ付きベイトタンパク質を対数増殖期の培養物からアフィニティー精製した後、分離された安定複合体の個々のポリペプチド成分を可視化するために、サンプルを銀染色ゲルで電気泳動しました。また、アフィニティー精製したタンパク質サンプルの別の分画を、対応するポリペプチド配列を同定するために、ゲルフリータンデム質量分析（LCMS）に供しました。このAPMSの手法の有効性は、E. coliからアフィニティー精製したRNAポリメラーゼ（RNAP）およびSufBCD鉄・硫黄（Fe-S）タンパク質複合体の成分の代表的なSDS-PAGE分析によって示されています(Figure 1C and D)。SPAタグ付きのRNAP σ70 (RpoD)と、機能未知のタンパク質であるYacLはともに、コアRNAP酵素（e.g.、α (RpoA)、β (RpoB)、β' (RpoC)サブユニット）およびRNAPリサイクル因子（HepA）と特異的に共精製されました。タグ付きRpoDとは対照的に、YacLは必須の転写終結/抗終結因子（NusG）にも結合しており、転...

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明<em&gt;大腸菌</emでも、セルあたりの低コピー数から始まるほぼ均一に安定した多タンパク質複合体を分離し、特徴付けるために使用することができます&gt;。

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

この実験の目的は、E. coli由来の天然MultiPro複合体のタンパク質、タンパク質間相互作用、およびサブユニット組成を同定することです。これは、SPAタグと選択マーカーをコードする配列特異的なリニアPCR産物を増幅し、バクテリアFage lambda組換えシステムを用いてddy 3, 3 0背景にカルボキシ末端融合としてインフレームで組み込み、発現させることで達成されます。第二ステップとして、低含有量のタンパク質複合体を効率的に回収するために、cow modlinおよびAnti-Flagアフィニティービーズを用いた二段階精製を行います。次に、cow modlin、溶出バッファー、またはCEBで溶出した結合タンパク質をトリプシンで消化し、質量分析を用いてタンパク質の同定を行います。得られた結果から、転写終結因子や抗終結因子を含むコアRNAポリメラーゼ酵素の複数のサブユニットが、タグ付きRNAポリメラーゼサブユニットDタンパク質と共に効率的に共精製されたことが示され、この手法を用いることで新たに結合したコンポーネントを効率的に明らかにできることが示唆されました。一般的に、この方法に不慣れな方は2回の親和性精製に苦労することがありますが、大規模培養から低含有量および高含有量の複合体を効率的に回収して成功させるには、適切な緩衝液を用いて細胞溶解物を慎重に処理することが不可欠です。親和性精製および質量分析の手順は、私の研究室の技術者であるOlga KaganとHBO guoが実演します。本プロトコルは、書面によるプロトコルに記載されている通り、Lambda red組み換え機構が発現しているDDY 3 30株への特定の増幅配列の導入から始まります。次に、バクテリオファージLambda組み換えシステム発現株を、2 mLのLuria-Bertani（LB）培地を用い、32 °C、180 RPMで振盪しながら一晩培養します。翌日、この一晩培養した菌液1 mLを、500 mLコニカルフラスコに入れた70 mLの新鮮なLB培地に接種します。接種した菌液を32 °C、180 RPMで振盪しながら、OD 600が約0.8に達するまで培養します。その後、フラスコを42 °Cのウォーターバスに入れ、180 RPMで緩やかに振盪しながら15分間インキュベートし、細胞を誘導します。誘導直後、フラスコを氷水スラリーバスに入れ、振盪しながら少なくとも30分間インキュベートします。記載の手順に従って細胞を回収し洗浄した後、細胞ペレットを700 µLの氷冷滅菌水に再懸濁し、エレクトロポレーションによるエレクトロコンピテント細胞を作成します。精製したアンプリコン1 µLを、40 µLのエレクトロコンピテント細胞に導入します。相同組換えおよび組み込み後、細胞にエレクトロポレーションを行います。タグ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。...

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。...

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

このビデオは、タンデムアフィニティー精製 -...

タンパク質間相互作用を研究するためのタンデムアフィニティー精製アッセイ

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

&gt;jove_content&lt;ここでは、真核細胞からのタンパク質複合体の発現、単離、および特性評価のための、新しく、堅牢で、効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法について説明します。このプロトコルは、離散的な複合体の生化学的特性評価、ならびにそれらの機能を調節する新規相互作用因子および翻訳後修飾の同定に利用できる可能性があります。...

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。...

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

学ぶシーケンシャルペプチドアフィニティ精製とタンデム質量分析を用いた大腸菌タンパク質複合体の同定法。低豊度タンパク質複合体の効率的な回収と相互作用解析が可能です。

のタンパク質複合体の同定

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