シンプルで効果的な管理と腎臓の注入を使用する小型魚の循環システムの微粒子の可視化

この手順の全体的な目標は、魚の腎臓に注射することにより、成体のゼブラフィッシュの循環系に微粒子を導入する技術を実証することです。導入された微粒子は、魚の鰓の生体内イメージングの単純な技術によって、血管系でさらに視覚化されます。この手順は、例えば、pHのためのマイクロカプセル化蛍光プローブの導入により、インビボで魚の血液pHの反復測定を実施するために用いることができる。

これを行うために、最初の段階で、デキストランと結合したpH感受性色素SNARF-1を、層ごとのアプローチを使用して半透性高分子電解質シェルにカプセル化します。蛍光染料を多孔質炭酸カルシウムマイクロコアに共沈殿させ、コアを対向的に帯電させた非生分解性ポリマーを複数層コーティングし、ポリエチレングリコールを含む生体適合性ポリマーでトップコーティングします。次に、炭酸カルシウムコアを分離して、SNARF-1を包み込んだマイクロカプセル全体を得る。

魚の麻酔と固定の第2段階では、調製されたマイクロカプセルが動物の腎臓に直接注入され、カプセル化された染料が魚の循環系に送達されます。次に、魚の鰓の鰓蓋と蛭毛細血管を取り除くために必要な手術は最小限です。その後、血液中のマイクロカプセルの可視化と蛍光スペクトルの記録を、生体内顕微鏡で血液のpHをモニターすることで行うことができます。

注射が正しく行われた場合、処置直後に魚の鰓に蛍光マイクロカプセルを観察することができます。カプセル化されたプローブの蛍光スペクトルは、蛍光顕微鏡に結合された分光計を使用して記録できます。SNARF-1には2つの発光ピークがあり、そのピークに対応する2つの波長の比でpHを測定することができます。

提案された手順は、蛍光マイクロカプセルを魚の循環系に送達し、生体内で魚の血液中の蛍光を遠隔で監視することを可能にする。生理学的研究の場合、この方法の主な利点は、通常実行が難しい小さな実験動物の血液パラメータの繰り返し測定です。光感受性蛍光プローブを使用する場合は、光の少ない部屋ですべての手順を実行することをお勧めします。

ここで、選択したポリマー結合蛍光染料SNARF-1-デキストランの溶液2ミリリットルを、0.6ミリリットルの1モル塩化カルシウム溶液および0.6ミリリットルの1モル炭酸ナトリウム溶液と混合します。この工程では、蛍光色素を包み込む多孔質炭酸カルシウムマイクロコアを合成します。5、10秒の攪拌の後、懸濁液を2ミリリットルのマイクロチューブに移し、15秒間遠心分離して炭酸カルシウムマイクロコアをペレット化します。

上清を捨て、コアを約2ミリリットルの脱イオン水で洗い、懸濁液を振とうします。遠心分離と洗浄の手順を3回繰り返します。懸濁液を超音波浴中で1分間インキュベートし、マイクロコアの凝集を減少させます。

炭酸カルシウムマイクロコアを、カチオン性ポリマーPAHの4マイクログラム/ミリリットル溶液の約2ミリリットルに再懸濁して、テンプレート上に最初のポリマー層を堆積させます。マイクロコアをpH溶液に約5分間、絶えず振とうしながら保持します。15秒の遠心分離後、非結合PAHで上清を捨て、複数回の遠心分離と洗浄ステップでマイクロコアを水で3回洗浄します。

アニオン性ポリマーPSSの4ミリグラム/ミリリットル溶液で同じ手順を繰り返し、テンプレート上に第2のポリマー層を堆積させます。次の層を追加する直前に、超音波浴で1分間のインキュベーションを適用することをお勧めします。カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーの堆積を6回連続して繰り返し、12層のマイクロカプセルシェルを得ます。

次に、ポリエチレングリコールグラフト化ポリ-L-リジン中のシェルとマイクロコアを少なくとも2時間インキュベートします。次に、被覆したマイクロコアを逐次遠心分離と再懸濁により、水で一度洗浄します。最後に、炭酸カルシウムテンプレートを2ミリリットルの0.1モルEDTA溶液に溶解し、pH約7.1に調整して、中空マイクロカプセルを得ます。

45秒遠心分離後に上清を捨て、EDTAで2回洗浄を繰り返します。45秒遠心分離後に上清を捨て、2ミリリットルの生理食塩水を加えます。生理食塩水による遠心分離洗浄のステップを3回繰り返します。

調製したマイクロカプセルのサイズ分布と濃度を、蛍光顕微鏡下の血球計算盤で調べます。ImageJまたは同等のソフトウェアを使用して、粒子のサイズ解析を行います。得られたカプセル化されたプローブを暗闇に保管します。

光学系を調製するには、塗布した蛍光色素の特性に応じて必要な蛍光フィルターのセットを蛍光顕微鏡にセットし、蛍光ランプを点灯させます。接眼レンズにレバーを引き出します。光ファイバーの一方の端を分光器に接続し、もう一方の端をコリメータに接続します。

アダプターを使用して、カメラチューブまたは蛍光顕微鏡の他の利用可能なポートの焦点でコリメータを再生します。調製したマイクロカプセルの較正のために、マイクロカプセル懸濁液の約5マイクロリットルを顕微鏡スライド上に置き、暗い場所で滴を乾燥させます。分光計の電源を入れます。

分光器制御プログラムを実行し、分光器を測定用に準備します。マイクロカプセル化されたSNARF-1のスペクトル特性を較正するには、異なるpHの一連のバッファーを使用します。乾燥させたマイクロカプセルに約10μLのナトリウム緩衝液をSNARF-1で滴下し、カバースリップで覆います。

顕微鏡ステージにスライドガラスを置きます。マイクロカプセルの位置を約400倍で探します。顕微鏡のレバーをカメラポートに回します。

蛍光を分光計に登録します。スペクトル信号がバックグラウンドレベルをはるかに超えていることを確認し、マイクロカプセルが泡の中にないことを確認します。SNARF-1は光退色に敏感であるため、同じマイクロカプセルの長時間の照明は避けてください。

レバーを接眼レンズに戻します。プロトン化色素と脱プロトン化色素の発光ピークに対応する波長でのカプセル化されたSNARF-1の蛍光強度の比を計算します。培地のpHに対する比率依存性の検量線を作成します。

安楽死させた魚から約10マイクロリットルの血液を採取します。微小電極を備えたpHメーターでpHを測定します。次に、乾燥させたマイクロカプセルをスライド上に血液を滴下し、キャリブレーションバッファーについて説明したように蛍光強度の比率を登録します。

カプセル化されたSNARF-1の読み出しには血液成分の影響を考慮する必要があるため、検量線の線形係数を調整して、曲線が魚の血液の測定値と一致するようにします。注射用の針を準備するには、鋭利なランセットでプラスチックを取り除き、インスリン注射器の先端から鋼製の針を離します。針をガラスマイクロキャピラリーの途中まで挿入します。

ガストーチですばやく優しくはんだ付けします。ガラス製マイクロキャピラリーをマイクロインジェクターに接続し、滅菌水で3回洗い流します。液体が針を通って流れることを確認してください。

システムに水を入れます。システムに気泡がないことを確認してください。実験の日に、マイクロリットルあたり半分から600万のマイクロカプセルを含む滅菌生理食塩水で調製されたマイクロカプセルの懸濁液を取ります。

超音波浴で1分間再懸濁します。次の注入中は、バイアルを定期的に振ってマイクロカプセルを再懸濁し、それらの凝集を防ぎます。スプーンを使用して魚を麻酔薬から取り出し、湿らせたスポンジにそっと置き、右利きの場合は頭を左に、左利きの場合は右に向けて横向きにします。

注入の直前に、マイクロインジェクターで接続されたガラスキャピラリーに1〜2ミリメートルの空気を吸い込みます。次に、分散したマイクロカプセルの約2マイクロリットルをロードします。利き手ではない手でスポンジの上の魚の体をやさしく安定させます。

魚の側線を見つけます。側線の腹部部分の中点の1ミリリットル下に針を置きます。次に、こすり落とす動作で魚の鱗を脇に動かし、穴を開けます。

針をテーブルの表面に対して45度の角度で本体に挿入します。針を背骨に向かって押し、慎重に背骨に当てます。次に、マイクロカプセル懸濁液の約1マイクロリットルをゆっくりと腎臓に放出し、針をゆっくりと引き抜きます。

魚の頭から尾まで水流ですすいで、注入部位にこぼれたマイクロカプセルを取り除きます。解剖ハサミを使用して、魚の頭とデヌードの魚の鰓から鰓カバーを取り外します。えらを水ですすいでください。

スプーンを使って魚を顕微鏡スライドに移し、蛍光顕微鏡のステージに置きます。以下の手順を行う際は、魚のえらが乾かないように注意してください。これを行うには、パスツールピペットを使用して定期的に水で湿らせます。

部屋を暗くし、低倍率でえらを検査して蛍光マイクロカプセルを見つけます。見つけたら、レンズを高い等級に切り替えて、視野の中央に合わせます。レバーをスペクトロメータが接続されたポートに回します。

スペクトル信号を録音します。レバーを接眼レンズに戻します。異なるマイクロカプセルの測定を数回繰り返します。

回復のために適切な通気で魚を水槽に移します。測定手順は、反復麻酔または別の固定方法を使用して、1人の個人に対して数回繰り返すことができる。写真は、カプセル化された蛍光色素SNARF-1によるゼブラフィッシュの血液と高炭酸ガス血症のin vivo測定の代表的な例を示しています。

対照条件下では、マイクロカプセルの注入後4時間は血液のpHが安定していますが、高濃度の二酸化炭素の下で5分間の曝露は魚の血液の酸性化を引き起こします。施術を行う際には、取り扱いや手術による動物のストレスを最小限に抑えることが重要です。いくつかの練習では、注入と信号登録の両方が平均して約2、3分かかるため、このプロトコルでは、魚が軽度の麻酔から目覚める前に操作を完了することができます。

処置中は、魚のえらが常に湿っていることを確認してください。このビデオを見た後、小魚の循環器系に微粒子を簡単かつ効果的に移植する方法をよく理解しているはずです。実証されているように、この手法は、蛍光プローブを充填したマイクロカプセルを使用して、成体ゼブラフィッシュの血液pHのin vivo記録を繰り返すのに非常に便利です。