解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

この手順の全体的な目標は、蛍光解剖顕微鏡を使用して、任意の方向にドリフトした後の再調整のための簡単な戦略を備えた多様な発生プロセスのタイムラプス分析を可能にすることです。この方法は、生きた胚の組織や臓器の発達を数時間にわたって直接観察できるため、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、レーザースキャンや照明顕微鏡など、発生中の組織や臓器のタイムラプス記録に通常使用されるより複雑な技術に代わる、手頃な価格で使いやすいことです。

この方法は、スイーパーフィッシュの胚や幼生の発生中に発生する空間的および時間的変化についての洞察を得ることができますが、初期の発生過程や他のモデル生物の調査にも適用できます。さらに、成体生物の根の治癒や再生などのダイナミックな過程を観察するのに適しています。準備として、トランスジェニックGFP発現系統から高繁殖の成魚を同定します。

植物のマイクロインジェクションの前日の午後、5つの繁殖容器に5つの繁殖魚のオスとメスのペアをセットアップします。容器の中で、オスとメスを取り外し可能なふるいで一晩分離しておきます。翌朝、明かりがついた直後に、オスとメスをふるいの上に一緒に置くと、卵が食べられなくなるようにします。

次に、魚が産卵する間、魚を観察します。ペアが約50個の卵を産んだら、それらを分離します。次に、パスツールピペットを使用して卵子を胚水で満たされたペトリー皿に移し、最初の注射を行います。

嵌合したペアごとにこのプロセスを繰り返します。追加の卵が必要な場合は、同じ交配ペアをまとめて数回分離することができます。マイクロインジェクションでは、ディッシュと注射針の高度な調製がかなり標準的な方法で行われます。

詳細については、テキストプロトコルを参照してください。準備した注射針を装填することから始めます。マイクロローダーチップを使用して、針に2マイクロリットルのMO作業溶液を埋め戻し、マイクロマニピュレーターに針を取り付けます。

その後、針先を開くことができます。解剖顕微鏡で観察しながら、ピンセットを使用して端をつまんで開くか、先端を硬い表面に押し付けます。次に、経緯線上の鉱物油の滴にMO溶液を注入することにより、注入量を較正します。

注入を調整して、約200ピコリットルの溶液に対応する75ミクロンの滴を作ります。次に、注入する胚を準備します。約21個の細胞期の胚をマイクロインジェクションディッシュの溝に沿って配置し、植物極をマイクロインジェクション針のアプローチ(溝から45度の角度)に向けて

次に、胚を注入します。針で絨毛膜と卵黄に穴を開け、ロードしたモルフォリノ溶液を卵黄に注入します。これは、1細胞または2細胞期の胚に有効です。

すべての胚を注入した後、広口径パスツールを使用して胚を採取します。注入した胚を胚水で満たされたシャーレに移し、摂氏28.5度でインキュベートします。午後遅くに、死んだ胚を吸い上げ、胚の水を交換します。

翌朝、胚が原腸陥入を行った後、微量のPTUを含む胚水で水を置き換えることにより、胚のメラニン化を抑制します。PTUは原腸陥入前の適切な発達を妨害するので注意してください。その後、所望の発達段階で、鋭いピンセットで胚をデコリオネートします。

顕微鏡を使用して、1組のピンセットで絨毛膜をつかみ、2番目のピンセットで絨毛膜の反対側をつかむようにしてください。次に、胚を乱さないようにピンセットを慎重に引き離します。次に、トリカインで胚を麻酔し、カバーガラス底のマイクロディッシュに配置された15ミクロンの再配置グリッドに胚とアガロースを埋め込むことに進みます。

次に、1ミリリットルのアリコートを溶かしたアガロースを1.5ミリリットルの反応チューブにロードします。チューブを摂氏36度に設定されたヒートブロックに入れ、チューブが冷えるのを待ちます。次に、広口径ピペットを使用して、胚をマイクロディッシュに移します。

余分な胚の水分を吸い取り、胚をアガロースで覆います。アガロースがまだ液体である間に、2つの小さなピペットチップを使用して胚の向きを合わせます。対象の構造(この場合はプロネフロ)をガラスの底にできるだけ近づけ、グリッドの近くに配置してください。

グリッドは、対象の構造をオーバーレイしないでください。異なるマイクロディッシュに最大4つの胚を埋め込むと有利で、最適なものをイメージする計画を立てることができます。適切な埋め込みには、ある程度の練習が必要です。

アガロースがまだ液体である間、胚は所望の位置に配向されなければならない。ガラス底に近く、再配置グリッドから適切な距離にあるプロネフロスの場合。アガロースを定期的にチェックしてください。

胚を保持するのに十分な硬さになったら、さらに2〜3分間落ち着かせます。次に、埋め込まれた胚を微量のPTUとトリカインを含む胚水で覆います。余分な胚の水分をデカントまたはサイフォンで取り除き、蓋をロックして蒸発を防ぎます。

結果には気泡があってはなりません。これで、胚のガラス底部を対物レンズに向けて画像化できます。ラプス画像を作成する準備として、例えば数時間にわたって定期的にZスタック画像を撮影するなどして、ピントズレを補正する必要があります。

可能であれば、オートフォーカス戦略を適用します。ソフトウェアコントロールのオートフォーカスオプションを切り替えます。参照チャンネルには、光の毒性を最小限に抑えるために透過光明視野チャンネルを選択します。

また、オートフォーカスが適切に機能するためには、十分に広い標本依存の探索範囲を選択することも不可欠です。画像を収集する前に、ソフトウェアの十字線で目的の構造の近くにインプリントグリッドの特定のポイントを配置し、スクリーンショットを使用してこの位置を保存します。次に、各イメージング時間間隔が終了する直前に、スクリーンショットを参照し、オートフォーカスが使用されていない場合はステージとフォーカスの位置を再調整します。

提示された方法は、トランスジェニックゼブラフィッシュラインのWT1Aモーフェン胚の腎臓発生を分析するために使用されました。初期の腎性の間に、この系統は腎臓の前駆細胞が発生する中間中胚葉で緑色の蛍光を選び、その後、形成細管とネフロン原基での発生中に緑色蛍光を選びました。タイムラプスイメージングにより、対照のモルフォリノ注入胚における正常な腎形成が明らかになった。

受精後20時間で、発達中の前腎尿細管が見えました。その前方の先端には、形成中のネフロン原基を表す細胞の球状の蓄積が検出されました。次の数時間で、尿細管とネフロン原基が成長し、原基は正中線で融合し始めました。

対照的に、突然変異体では腎形成が著しく阻害されました。GFP陽性の尿細管構造は受精後20時間で見えましたが、それらは拡散し、未発達でした。タイムラプスイメージングでは、ネフロン原基が形成されず、発生中のプロネフロンの外側にある蛍光細胞の驚くべき数が腹側に移動し、プロネフリックフィールドを離れていることが示されました。

このプロトコルを試行する際には、温度制御や蒸発防止テーブルなどの追加機器がないため、ドリフトや再調整の定期的なチェックが必要であることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、画像胚を処理して、免疫組織化学、免疫組織増殖、または細胞や組織の特定の成分を同定したり、遺伝子発現を評価したりするために、リアルタイムPCRなどの他の方法を実行できます。