最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス
December 8th, 2017
Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ ツールの範囲とインジェクションとイメージングのゼブラフィッシュの方向を提案します。
この方法論の全体的な目標は、ゼルブラフィッシュの幼生のマイクロインジェクションをより簡単かつ正確にすることです。この手法は、ゼブラフィッシュモデルシステムを使用する研究者が、ゼブラフィッシュの幼生を特定の向きで大きな配列に固定するのに役立ちます。この技術は、マイクロインジェクションやイメージングのために特定の組織へのアクセスを容易にし、感染症や異種移植がんモデルなどのアプリケーションに多数の幼虫が必要な場合に非常に効果的です。
ゼブラフィッシュモデルでの私の製造戦略は、非常に補完的です。1つは人工的でシンプルなものです。もう1つは、ライブで複雑です。
どちらも同じサイズスケールを共有しています。どちらも透明です。また、どちらもシングルセルの分解能で観察できます。
ここに示すように、これらは簡単に組み合わせることができ、事実上すべての主要な疾患の研究に応用できます。E-3の薄膜で覆われたシャーレにPDMSブロックを調製した後、テキストプロトコルに従って、トランスファーピペットを使用して必要な数の胚をPDMSブロックの表面に移します。ヘアループまたは同様のツールを使用して、特に背側と腹側の向きのために、胚を微細構造のくぼみに押し込みます。
幼虫をディボットにロードするときは、簡単に操作できるようにPDMSブロックを十分な水で覆うことが重要です。また、注入中に所定の位置に留まるように、それらをディボットに押し込むことも重要です。テキストプロトコルに従って事前に準備した微細構造チャネルにゼブラフィッシュを配向するには、トランスファーピペットを使用して、パターン化されたPDMSブロックからE-3を引き出します。
E-3のレベルはブロックの端より下に下がるはずですが、リザーバーとチャネルにはまだ存在し、PDMS上に薄い層が残ります。トランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた10個の胚をリザーバーに移し、端がオーバーフローしないように注意します。ヘアループを使用して、各胚を漏斗ヘッドに操作し、まず適切なチャネルの入り口で、胚がチャネルに入るときに適切な向きを持つようにします。
次に、ヘアループを使用して、各胚をチャネルの下にスライドさせ、所定の位置に保持するチャネル壁の配向微小特徴に到達するまでスライドさせます。マイクロインジェクション針とマイクロインジェクション溶液を調製した後、細かくテーパー状のピペットチップを使用して、5マイクロリットルの溶液を針にロードします。マグネットスタンドに取り付けたマイクロマニピュレーターに針を装着し、PICOポンプマイクロインジェクターに接続します。
次に、鉗子を使用して、先細りの先端をつまむことにより、針の先端を45度の角度で折します。PICOポンプコントローラーで注入時間を調整することにより、注入ボーラスサイズを1ナノリットルに調整します。マイクロマニピュレーションコントローラーでマイクロインジェクション針の角度を、針が胚の長さに平行になるように45度から調整します。
マイクロインジェクション中の胚の横方向の動きを最小限に抑えるために、より急な角度を使用することができる。左手でペトリ皿を制御し、右手で必要なマイクロマニピュレータを制御し、針を耳小胞などのマイクロインジェクションの目的部位にできるだけ近づけます。マイクロマニピュレーションコントローラーを使用して、針を標的組織に挿入し、PICOポンプフットスイッチを使用してプリセットボリュームを注入します。
組織が浸透しにくい場合は、マイクロマニピュレーションコントローラーのノブを軽くたたいます。胚を放出するには、トランスファーピペットを使用してE-3を表面上から下に流すか、胚が周囲のE-3に放出されるように皿を渦巻かせます。MS-222を含まないE-3の回収皿に胚を移します。
6ウェルプレートのウェルでPDMSデバイスを使用して胚をスクリーニングするには、1, 000マイクロリットルのピペットまたは先端の狭いトランスファーピペットを使用して、ポートを介してE-3を流すことでデバイスをプライミングします。E-3およびMS-222を使用して、デバイスが覆われるまでウェルを充填します。次に、トランスファーピペットを使用して、以前に注入した4つの胚を各ウェルに導入します。
ヘアループまたは同様のツールを使用して、胚をイメージングチャネルの入口に所望の向きで配置し、それらを部分的にデバイスに押し込みます。これにより、それらをデバイスに均等に引き込むことができます。1, 000マイクロリットルのピペットまたはトランスファーピペットを使用して、ポートからデバイスを介してE-3を引き出し、胚がイメージングのために正しい向きでチャネルに引き込まれるまで
。ウェルプレートを倒立型蛍光顕微鏡に移します。胚を画像化するには、ゼブラフィッシュのネツラオヒルの移動をイメージングするための10倍など、適切なレンズを選択して倍率を調整します。各チャンネルの光源の強度と露光時間を調整して、各信号がクリアになり、飽和しないようにします。
最後に、各蛍光チャンネルと透過チャンネルの画像をキャプチャします。マイクロストラクチャードチャネルデバイスを使用して胚を横向きに安定化し、ゼブラフィッシュの受精後2日間の標準的な化学誘引物質fMLPおよびLTB4を耳小胞にマイクロインジェクションした好中球が応答する能力をテストしました。好中球の動員を可視化するために、高分子量ローダミンデキストランを用いた注入を追跡し、緑色蛍光好中球を用いたトランスジェニック胚で実施しました。
非注入胚およびローダミン単独を注入した胚をネガティブコントロールとして用いた。マイクロインジェクション後、胚をイメージングチャネルデバイスに移植し、注入後30分と5時間後にEVOS蛍光顕微鏡を使用してイメージングしました。予想通り、少数の蛍光好中球が模擬注射された耳小胞に早期に動員されましたが、これはおそらく媒介動員が損傷したためです。
興味深いことに、ローダミンデキストラントレーサーは、実験中に耳石に蓄積することが観察されました。どちらの走化性物質についても、好中球は、特にLTB4に応答して、より多く動員されました。この技術を習得すれば、ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションの速度と精度を大幅に向上させることができます。
この技術の開発は、私たちの研究室での課題によって推進されました。私たちは、ゼブラフィッシュモデルにおける真菌感染症と腫瘍異種移植片に関するプロジェクトのニーズに合わせて、このアプローチを改良しました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションや長時間のライブイメージングに微細構造表面アレイを使用する方法についてよく理解できるはずです。
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概要
この記事では、ゼブラフィッシュ幼生のマイクロインジェクションの方法論を提示し、プロセスの容易さと精度を高めることを目指しています。この技術により、研究者は特定の向きでゼブラフィッシュ幼生を固定し、マイクロインジェクションとイメージングのための対象組織へのアクセスを容易にすることができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 遺伝学
背景
- マイクロインジェクションはゼブラフィッシュ研究において重要な技術です。
- ゼブラフィッシュ幼生の安定化と向き付けに課題があります。
- 大規模応用のための効果的な方法が必要です。
- 研究は多くの場合、感染やがんモデルを含みます。
研究の目的
- ゼブラフィッシュ幼生のマイクロインジェクションプロセスを簡素化すること。
- 注射時の組織ターゲティングの精度を向上させること。
- 様々な実験モデルでのゼブラフィッシュの使用を容易にすること。
使用された方法
- 安定化のためのマイクロスケールツールの開発。
- 幼生を配列で固定するための技術。
- 特定の組織へのアクセス戦略。
- 大規模研究における方法の適用。
主な結果
- 手順中のゼブラフィッシュ幼生の安定化の向上。
- ターゲットマイクロインジェクションのための向き付けの改善。
- 高スループット応用に効果的。
- イメージングと注射のための組織へのアクセスを容易に。
結論
- この方法論はゼブラフィッシュ研究に大きく貢献します。
- 様々な実験ニーズに対して信頼性の高いアプローチを提供します。
- 将来的には他のモデルシステムに応用が拡大する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Microstructured devices for zebrafish larval microinjection address throughput and precision bottlenecks in phenotypic screening and target validation workflows. By enabling standardized embryo orientation and immobilization, the method supports reproducible compound testing in disease-relevant systems. This improves predictive confidence in early discovery for infection and oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise tissue targeting for microinjection of pathogens or tumor cells, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Standardizes larval positioning across large arrays, reducing variability in infection or xenograft model initiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative imaging readouts of neutrophil recruitment in response to chemoattractants like fMLP and LTB4, enabling dose-response assessment.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of larvae in microfluidic channels, increasing throughput for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal imaging of immune cell dynamics post-injection, aligning with translational biomarker studies in inflammation and metastasis.
- Operational Value: Integrates with fluorescent microscopy platforms for standardized readout across preclinical validation stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges early discovery and preclinical evaluation by enabling standardized microinjection and live imaging in zebrafish larvae, a disease-relevant system for target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through controlled delivery of agents to specific tissues such as the otic vesicle.
- Screening: Enables assay-ready preparation of larvae in consistent orientations for reproducible compound exposure.
- Analytics: Generates fluorescent and transmitted light imaging outputs for quantifying cellular recruitment and tracer distribution.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via standardized imaging of neutrophil responses relevant to human inflammation and cancer models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform technology adaptable across multiple larval stages and experimental endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing technical variability in microinjection and imaging procedures.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of larval handling in multi-well formats.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing data quality in early-stage phenotypic screens.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on robust zebrafish model data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling and zebrafish larval manipulation.
- Depends on access to PDMS fabrication, micromanipulators, and fluorescent microscopy systems.
- Necessitates standardization of embryo staging and anesthetic protocols across teams.
- Adaptation considerations include channel dimensions for different larval sizes and orientation requirements.
- Practical limitations include device clogging risk and the need for careful fluidic priming to ensure consistent larval loading.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Orientation of Zebrafish on Divot Arrays and Microstructured Channels
2:39
Microinjection of Zebrafish
4:20
Screening of Embryos Using the PDMS Imaging Device
5:45
Results: Microinjection and Imagingof Zebrafish Larvae Using Microstructured Devices
7:04
Conclusion
