最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

この方法論の全体的な目標は、ゼルブラフィッシュの幼生のマイクロインジェクションをより簡単かつ正確にすることです。この手法は、ゼブラフィッシュモデルシステムを使用する研究者が、ゼブラフィッシュの幼生を特定の向きで大きな配列に固定するのに役立ちます。この技術は、マイクロインジェクションやイメージングのために特定の組織へのアクセスを容易にし、感染症や異種移植がんモデルなどのアプリケーションに多数の幼虫が必要な場合に非常に効果的です。

ゼブラフィッシュモデルでの私の製造戦略は、非常に補完的です。1つは人工的でシンプルなものです。もう1つは、ライブで複雑です。

どちらも同じサイズスケールを共有しています。どちらも透明です。また、どちらもシングルセルの分解能で観察できます。

ここに示すように、これらは簡単に組み合わせることができ、事実上すべての主要な疾患の研究に応用できます。E-3の薄膜で覆われたシャーレにPDMSブロックを調製した後、テキストプロトコルに従って、トランスファーピペットを使用して必要な数の胚をPDMSブロックの表面に移します。ヘアループまたは同様のツールを使用して、特に背側と腹側の向きのために、胚を微細構造のくぼみに押し込みます。

幼虫をディボットにロードするときは、簡単に操作できるようにPDMSブロックを十分な水で覆うことが重要です。また、注入中に所定の位置に留まるように、それらをディボットに押し込むことも重要です。テキストプロトコルに従って事前に準備した微細構造チャネルにゼブラフィッシュを配向するには、トランスファーピペットを使用して、パターン化されたPDMSブロックからE-3を引き出します。

E-3のレベルはブロックの端より下に下がるはずですが、リザーバーとチャネルにはまだ存在し、PDMS上に薄い層が残ります。トランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた10個の胚をリザーバーに移し、端がオーバーフローしないように注意します。ヘアループを使用して、各胚を漏斗ヘッドに操作し、まず適切なチャネルの入り口で、胚がチャネルに入るときに適切な向きを持つようにします。

次に、ヘアループを使用して、各胚をチャネルの下にスライドさせ、所定の位置に保持するチャネル壁の配向微小特徴に到達するまでスライドさせます。マイクロインジェクション針とマイクロインジェクション溶液を調製した後、細かくテーパー状のピペットチップを使用して、5マイクロリットルの溶液を針にロードします。マグネットスタンドに取り付けたマイクロマニピュレーターに針を装着し、PICOポンプマイクロインジェクターに接続します。

次に、鉗子を使用して、先細りの先端をつまむことにより、針の先端を45度の角度で折します。PICOポンプコントローラーで注入時間を調整することにより、注入ボーラスサイズを1ナノリットルに調整します。マイクロマニピュレーションコントローラーでマイクロインジェクション針の角度を、針が胚の長さに平行になるように45度から調整します。

マイクロインジェクション中の胚の横方向の動きを最小限に抑えるために、より急な角度を使用することができる。左手でペトリ皿を制御し、右手で必要なマイクロマニピュレータを制御し、針を耳小胞などのマイクロインジェクションの目的部位にできるだけ近づけます。マイクロマニピュレーションコントローラーを使用して、針を標的組織に挿入し、PICOポンプフットスイッチを使用してプリセットボリュームを注入します。

組織が浸透しにくい場合は、マイクロマニピュレーションコントローラーのノブを軽くたたいます。胚を放出するには、トランスファーピペットを使用してE-3を表面上から下に流すか、胚が周囲のE-3に放出されるように皿を渦巻かせます。MS-222を含まないE-3の回収皿に胚を移します。

6ウェルプレートのウェルでPDMSデバイスを使用して胚をスクリーニングするには、1, 000マイクロリットルのピペットまたは先端の狭いトランスファーピペットを使用して、ポートを介してE-3を流すことでデバイスをプライミングします。E-3およびMS-222を使用して、デバイスが覆われるまでウェルを充填します。次に、トランスファーピペットを使用して、以前に注入した4つの胚を各ウェルに導入します。

ヘアループまたは同様のツールを使用して、胚をイメージングチャネルの入口に所望の向きで配置し、それらを部分的にデバイスに押し込みます。これにより、それらをデバイスに均等に引き込むことができます。1, 000マイクロリットルのピペットまたはトランスファーピペットを使用して、ポートからデバイスを介してE-3を引き出し、胚がイメージングのために正しい向きでチャネルに引き込まれるまで

ウェルプレートを倒立型蛍光顕微鏡に移します。胚を画像化するには、ゼブラフィッシュのネツラオヒルの移動をイメージングするための10倍など、適切なレンズを選択して倍率を調整します。各チャンネルの光源の強度と露光時間を調整して、各信号がクリアになり、飽和しないようにします。

最後に、各蛍光チャンネルと透過チャンネルの画像をキャプチャします。マイクロストラクチャードチャネルデバイスを使用して胚を横向きに安定化し、ゼブラフィッシュの受精後2日間の標準的な化学誘引物質fMLPおよびLTB4を耳小胞にマイクロインジェクションした好中球が応答する能力をテストしました。好中球の動員を可視化するために、高分子量ローダミンデキストランを用いた注入を追跡し、緑色蛍光好中球を用いたトランスジェニック胚で実施しました。

非注入胚およびローダミン単独を注入した胚をネガティブコントロールとして用いた。マイクロインジェクション後、胚をイメージングチャネルデバイスに移植し、注入後30分と5時間後にEVOS蛍光顕微鏡を使用してイメージングしました。予想通り、少数の蛍光好中球が模擬注射された耳小胞に早期に動員されましたが、これはおそらく媒介動員が損傷したためです。

興味深いことに、ローダミンデキストラントレーサーは、実験中に耳石に蓄積することが観察されました。どちらの走化性物質についても、好中球は、特にLTB4に応答して、より多く動員されました。この技術を習得すれば、ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションの速度と精度を大幅に向上させることができます。

この技術の開発は、私たちの研究室での課題によって推進されました。私たちは、ゼブラフィッシュモデルにおける真菌感染症と腫瘍異種移植片に関するプロジェクトのニーズに合わせて、このアプローチを改良しました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションや長時間のライブイメージングに微細構造表面アレイを使用する方法についてよく理解できるはずです。