Name: 最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼虫のマイクロインジェクション手法。微細構造デバイスを用いて特定の組織へ正確にアクセスし、感染症やがんモデルなどの大規模研究に応用できます。

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著者は気前よく水槽スペースを提供するためデビッド Langenau を感謝したいです。エリック ・ ストーン、ジョン c. ムーア、秦唐は、ここで使用されるゼブラフィッシュ系統を調達のレナード ・ ゾンのラボからエリオット懸アン ・ ロバートソンと試薬、ゼブラフィッシュ メンテナンスを支援します。彼らはまたオクタビオ ウルタドのフォトリソグラフィー技術に関するアドバイスをありがとうしたいと思います。FE は、子供とアメリカのオーストラリア連合の Shriner の病院からの奨学金で賄われていた。この仕事 NIH によって資金が供給された GM92804 を付与します。

幼虫の研究動物のケアに関するマサチューセッツ総合病院小委員会プロトコル 2011N000127 の下で承認されました。
1. デバイスの作製
注: すべてコンピューター支援図面 (CAD) ファイルここで説明フォトリソグラフィ マスクを設計するために使用 (図 1)、ダウンロード可能。リンクの材料表を参照してください。
<ol><li>標準写真平版の技術7を使用してクラス 1,000 のクリーン ルーム内マスター金型ウェハを作製します。組織アレイとチャンネルは、製造元の指示に従って 3 別のマスクを使用して 3 層の順番にエポキシ系ネガ型フォトレジストをパターン: 浅い機能 100 μ m、200 μ m の機能のため、400 μ m の深層の特徴。イメージング デバイスの 2 つのパターン層の浅い機能および深層の特徴の 600 μ m の 400 μ m を使用します。</li>
	<li>15 cm (図 2) を鋳造用シャーレのベースに完成したウェハーをテープします。</li>
</ol>2. 微細加工表面のアレイ - PDMS の準備
<ol><li>使用可能なデバイスを作る金型としてマスターのウエハーを用いたポリジメチルシロキサン (PDMS) をキャストします。イニシエーターの 5 g と 50 g の PDMS モノマーを組み合わせるし、プラスチック製のプラスチック フォークで皿の重さで徹底的にミックスします。</li>
	<li>慎重に型に混合物を注ぐ。</li>
	<li>1 h の 16-25 inHg (54-85 kPa) で真空デシケータでガスを抜き。</li>
	<li>PDMS を治すためには、少なくとも 3 時間は 65 ° C で焼きます。PDMS を企業が柔軟な固体を治す必要があります。</li>
	<li>慎重にメス、メスの先端とウェーハ表面間の接触を維持するために必ずマスター基板上装置の周りカットします。鉗子を使用して、ウェハとクリーンの 10 cm シャーレ (図 3) を機能面への転送から PDMS レプリカの皮をむきます。</li>
	<li>35 プラズマ オーブンを用いた酸素プラズマとデバイスを扱う s 疎水性を削減します。</li>
	<li>エチル 3-aminobenoate メタンスルホン酸 (MS-222、pH 7.5) 168 mg/L を添加したゼブラフィッシュ胚培地 (E3) でカバーします。転送ピペットを使用してデバイスの表面に水の流れることによって深い機能から任意の泡を削除します。</li>
</ol>3. 微細加工表面のアレイ - アガロースの準備
<ol><li>マイナスモールド PDMS をするためには、まず酸素プラズマによる PDMS デバイスを扱います。</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) シラン蒸気8不活性表面を作成すると PDMS デバイスを扱います。簡潔に。
	<ol>
<li>ヒューム フード内真空チャンバー内で扱われた機能側アップする PDMS を配置します。</li>
		<li>PDMS、横に小さなオープン ガラスやアルミ皿を置き、慎重に PFDTS の 200 μ L をピペット (98% シラン) 皿に。 注意: PFDTS シラン揮発性の高い水と激しく反応する、可燃性があり、接触皮膚や眼の損傷を引き起こします。使用前に詳細に MSDS を参照。</li>
		<li>真空チャンバーを閉じ、15-30 分または PFDTS シランが完全に蒸発するまで真空を適用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペトリ皿にデバイスを配置し、新鮮な PDMS、2.1 から 2.3 の手順で説明されている金型として使用します。</li>
	<li>少なくとも 3 時間、65 ° C で焼く治療デバイスから新鮮な PDMS のレイヤー全体の皮をむくし、新鮮なペトリ皿に配置。その後、アガロースをキャストする否定的な金型として使用これができます。</li>
	<li>アガロースを準備するには、agarose が完全に溶解するまで低ゲル化温度の agarose E3 で電子レンジでの 2% 溶液を沸騰します。</li>
	<li>ホット アガロースを注ぐ PDMS マイナスモールドと転送ピペットと機能を流れる熱い agarose によってデバイスをカバー agarose 任意の泡を削除します。</li>
	<li>泡を取り外したら、agarose を設定するのには 4 ° C で冷蔵庫で冷やします。</li>
	<li>下から PDMS を手で変形によって負の PDMS 金型からアガロース ブロックを削除、新しいペトリ皿と MS 222 を含む E3 とウェットにアガロース ブロックを転送します。</li>
</ol>4. PDMS イメージング デバイスの準備
<ol><li>使用可能なデバイスを作る金型としてマスターのウエハーを用いた PDMS をキャストします。(ステップ 2.1 で使用した同じ) イニシエーターとプラスチック製のプラスチック フォークで皿の重さを徹底的にミックスの 5 g と PDMS モノマーの 50 g を組み合わせます。</li>
	<li>慎重に型に混合物を注ぐ。</li>
	<li>1 h の 16-25 inHg (54-85 kPa) で真空デシケータでガスを抜き。</li>
	<li>PDMS を治すためには、少なくとも 3 時間は 65 ° C で焼きます。PDMS を企業が柔軟な固体を治す必要があります。</li>
	<li>マスターのウェハからデバイスを切り取って 1.5 mm パンチを使用してポートをパンチします。</li>
	<li>治療デバイスと 6 ウェルのガラス底も 35 の酸素プラズマを用いたプレート s、2.6 の手順で説明されているようです。</li>
	<li>10 分の 85 ° C のホット プレートにすることで 1 つデバイス機能を 6 ウェル プレートの各ガラス基盤を接着します。 注: 成功した結合を確認するため、鉗子を用いた接合デバイスの 1 つの側面にしっかり圧力を適用されます。デバイスは、ガラス基板に接続されたままする必要があります。</li>
</ol>5. ゼブラフィッシュ文化
<ol><li>3標準的な技術を使用して 2 の dpf に文化ゼブラフィッシュ胚。</li>
	<li>鉗子または 1 mg/mL のプロテアーゼを用いた Dechorionate 胚ミックス (参照材料表)3まっすぐにそれらを許可するようにデバイスにロードする前に、少なくとも 30 〜 60 分。</li>
	<li>そのペトリ皿に、e3 (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) 25 X の 1 つの mL を追加して原液を用いた胚を anaesthetize します。</li>
</ol>6. 微細構造面・ ディボット配列のゼブラフィッシュの向き
<ol><li>それは胚を簡単に操作できるように、E3 の薄い (1-2 mm) 層で覆われているようなそのペトリ皿のステップ 2.7 (図 3 a) から PDMS ブロックを準備します。</li>
	<li>転送ピペットを使用して PDMS ブロックの表面に必要な数 (通常 10-20 1 つの条件) の胚を転送します。</li>
	<li>マイクロマニピュレーション ツールを使用 (毛のループまたは類似)、胚を押し込みます (図 3 a) の微細構造の芝生。芝生の使用、背側と腹側の向きに特に適しています。 注: より厳しいと芝生 (背側と腹側) に合わせて、ディボットに平行にブロックの表面に胚を位置決めし、毛のループを使用して位置にそれらを圧延します。それらを安定した保つを助ける、ディボットに深くそれらを押してします。</li>
</ol>7. 微細表面 - ゼブラフィッシュの方向微細加工チャンネル
<ol><li>E3 を PDMS ブロックで微細加工チャンネル (図 3 b) E3 のレベルを下回ると、ブロックの端は、PDMS の薄層、貯留層およびチャネルでまだ存在まで転送ピペットを使用してパターンを描画します。</li>
	<li>エッジをオーバーフローしないように注意して転送ピペットを用いた貯留層にステップ 5.3 から 10 の胚を転送します。</li>
	<li>毛のループを使用して、適切なチャネルの入り口に漏斗にそれぞれの胚を操作し、よう、胚の頭は、チャネルとチャネルに入ると、胚は適切な方向に回転します。</li>
	<li>場所で保つを助けるチャネル壁の方向づけの microfeatures に到達するまで、毛のループを使用してチャネルをそれぞれの胚をスライドさせます。横方向微細チャンネルの使用が特に推奨されます。 注: 胚マイクロインジェクション中にスライディングを減らすためには、貯水池から E3 を描画することによって表面張力の量を調整してください。</li>
</ol>8. ゼブラフィッシュのマイクロインジェクション
<ol><li>
マイクロインジェクション針を準備します。
	<ol>
<li>前述4としてマイクロ ピペットの引き手を使用してホウケイ酸ガラス マイクロキャピ ラリー針を作る。結果針は、テーパ長さ約 10 mm の一方の端にポイントにテーパする必要があります。</li>
		<li>この場合 100 nM の走化性因子で注入されるべきソリューションを準備 (N-Formylmethionine-ロイシル-フェニルアラニン (fMLP) やロイコトリエン B4 (LTB4)) と 100 nM の PBS で 70 kDa ローダミン デキストラン トレーサー。</li>
		<li>細かくテーパー ピペットを使用して針にソリューションの 5 μ L を読み込むヒント (材料表を参照してください)。</li>
		<li>マグネット スタンドにマウントされているし、picopump マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに針をマウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>鉗子でテーパーの先端をつまんで 45 ° の角度で針の先端を破る。</li>
	<li>1 ボーラス注入サイズを調整する picopump コント ローラーで射出時間を調整することによって nL。</li>
	<li>マイクロインジェクション針の角度を調整します。針角 45 ° マイクロ コント ローラーには一般的に胚の長さに平行の針の良い出発点です。急な角度マイクロインジェクションの間に胚の横方向の動きを最小限に抑えるためのもの。</li>
	<li>左の手でシャーレと権限を持つ針マニピュレーターを制御する、この場合は耳胞のインジェクションの目的のサイトにできるだけ近くに針をもたらします。 注: 耳胞は 2 つ小さい異なる暗い楕円形の構造 (耳石) を含む目の後方の長方形の器官として識別できます。</li>
	<li>マイクロ コント ローラーを使用すると、針の先端が、小胞内になるように (この場合は耳胞) でターゲット組織を貫通し、picopump フット スイッチを使用してプリセット ボリュームを挿入します。 注意: 組織の浸透に耐える場合、は、マイクロ コント ローラーのノブをやさしくタッピングみてください。</li>
	<li>胚を解放するには、胚が周囲の E3 に解放されるように皿を旋回、上から転送ピペットを使用して下の表面で E3 はフローします。</li>
	<li>MS 222 転送ピペットを使用せず、E3 の回復料理に胚を転送します。</li>
</ol>9. デバイスをイメージング PDMS を用いた胚のスクリーニング
<ol><li>ポートを介して流れる E3 (+ MS 222) ステップ 4.7 からデバイスを首相します。これを行うことができます 1,000 μ L ピペットまたは狭ヒント転送ピペットを使用しています。</li>
	<li>デバイスが覆われるまでは、E3 + MS 222 井戸を埋めます。</li>
	<li>まあ転送ピペットを使用して各ステップ 8.7 から 4 注入された胚を提供します。胚は、E3 + MS 222 (ステップ 5.3) を読み込む前に 1 〜 2 分のために培養が必要な場合事前麻酔することができます。</li>
	<li>マイクロマニピュレーション ツールを使用 (毛のループまたは類似)、(尾最初または使用するデバイスに応じて先頭) 希望する方向の画像チャネルの入り口で胚の向き、デバイス (図 4 a) に部分的にそれらをプッシュします。均等にデバイスにそれらを描画に役立ちます。</li>
	<li>胚はの画像 (図 4 b) の向きが正しいチャンネルに描画されるまで、1,000 μ L ピペットまたは転送ピペットを使用してポートからデバイスを介して E3 を描画します。 注: 過去のトラップ ポイント胚を吸うように注意して、これは胚を損傷し、その向きを変更します。</li>
	<li>(図 4) をイメージングのための顕微鏡にもプレートを転送します。</li>
	<li>
倒立蛍光顕微鏡を使用してイメージ。
	<ol>
<li>適切なレンズを選択することで倍率を調整します。10 X は通常ゼブラフィッシュ好中球移行のイメージングのための有用な倍率です。</li>
		<li>各信号は明確なしかし、飽和していないように、光源強度と各チャンネル用の露光時間を調整します。</li>
		<li>各チャンネルのイメージをキャプチャします。ここで、緑色蛍光タンパク質を使用 (GFP、Ex: 470/22 Em: 525/50)、テキサス赤 (TxRed、Ex: 585/29 Em: 628/32) チャンネルを送信します。ポスト処理中にマルチ チャンネル画像を組み合わせることができます (図 4 b-私)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここに述べる使用デバイスの最近行った dpf ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション52 を容易にし胚の便利な画像の単純な agarose フリー実装デバイスを導入します。これらのツールは、ゼブラフィッシュのテクニックの有用なデバイスの作製に写真平版の技術の有用性を強調表示します。
我々 MSA デバイス特に有用な発見した細胞や粒子の射出用マイクロインジェクション針、真菌分生子など配信のため大きな穴針の使用を必要とするひと癌細胞内で凝集しやすい。耳胞 (図 4) 注入は、胚は頻繁に針を接触時にロールとして特定の課題を提示します。我々 はオリエントし、の横ゼブラフィッシュを安定させる微細構造チャネルの使用を見つける方向は、スループットと我々 の手でこの手法の精度を大幅に改善します。
好中球動員や異種移植腫瘍転移の評価など、異なる時点で横方向に指向のゼブラフィッシュの急速なイメージングのアガロースを回避する胚との間に損傷...

ゼブラフィッシュ遺伝子を大規模の根本的な発生生物学の研究から多くの分野で強力なモデルとして浮上しているし、化学スクリーン1,2。単一細胞の受精卵は、商業的、簡単・使いやすいの開発につながっているに遺伝物質のマイクロインジェクションに依存して遺伝子の過剰発現、ノックダウン、CRISPR/Cas9 変異、遺伝子導入などのルーチンの遺伝子操作定位と注入3卵の安定化に使用できるツール。移植と感染症などの他のアプローチは、後の段階の胚およびより大きいゲージ キャピラリー針4を使用して幼虫にマイクロインジェクションを必要があります。但しより大きいゲージの針を使用は、押すか、または胚を圧延することがなく標的組織に浸透するより困難だと重要な技術的な課題を示します。これらの条件の下でプロシージャの間に乾燥を避けることは難しい、胎児を安定させるために必要な適切な水分張力と胚を取得できない場合があります理想的な標的組織への注入を指向。
次の顕微注入、注入された胚初期時点の画像をキャプチャして選択する正常に挿入されていることを画面に便利です。これらの課題に対応するマイクロインジェクション5とイメージ ベースの迅速なスクリーニング後注入の両方のさまざまな方向に 2 の dpf 胚を安定させるのに役立ちます微細構造デバイスの範囲を開発しました。
これらのデバイスに十分な構造の解像度を得るためには、我々 は写真平版の技術を活用しました。よく最近マイクロ加工に外挿するマイクロ エレクトロニクス産業で使用される、これらのアプローチは 1 1,000 μ m、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の操作に最適なスケールに至る垂直構造を実現できます。安く、物理的に堅牢な生物学的に不活性で透明なポリジメチルシロキサン (PDMS) を使用してすべてのデバイスを作製しました。
微細加工表面のアレイ (MSAs) PDMS のパターン表面でのブロックとしてフォーマットされた、卵マイクロインジェクションをアガロース ブロックで簡単なチャンネルに似ています一般的に使用します。投与後検診 6 イメージング デバイスに標準ガラス底 6 ウェル プレートに配置できます。これらのデバイスは、胚のイージーローディング向け、アンロード ・ プロシージャは、便利なイメージ ベースの促進、特定胚の救助を可能にする間これらのデバイスよりもより使いやすい方法でスクリーニングのアプローチで作られた、ビービ研究室6。

<table><tbody><tr><td>ダウ コーニング シルガード 184 ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>エルスワース Adhsives</td><td>184 SIL エラスト キット 0.5KG</td><td>デバイスの鋳造用。キットに含まれるもの PDMSモノマーと開始剤</td></tr><tr><td>低ゲル化温度 アガロース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9414-10G</td><td>キャスティング用アガロース装置</td></tr><tr><td>PFDTS シラン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>448931-10G</td><td>ネガティブPDMS金型のキャスティング用</td></tr><tr><td>トリカイン (MS-222)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>E10521-10G</td><td>ゼブラフィッシュを麻酔する</td></tr><tr><td>ローダミン デキストラン 70,000 Da</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D1818</td><td>マイクロインジェクションをトレースするには</td></tr><tr><td>ロイコトリエン B4 (LTB4)</td><td>ケイマン ケミカルズ</td><td>20110</td><td>好中球化学誘引剤</td></tr><tr><td>N-ホルミルメチオニン-ロイシル-フェニルアラニン (fMLP)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>F3506-50MG</td><td>好中球化学誘引剤</td></tr><tr><td>15 cm ペトリ皿</td><td>フィッシャー科学</td><td>08-757-148</td><td>マスターウェーハからのキャスティング用</td></tr><tr><td>ガラス底 6 ウェルプレート</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>イメージングデバイス用</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス マイクロキャピラリー</td><td>ワールド・サイエンティフィック・インスツルメンツ</td><td>TW-100-4</td><td>マイクロインジェクション針用</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z350796</td><td>ゼブラフィッシュ胚の移植用</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ックE5242956003</td><td>マイクロインジェクション針の装填用</td></tr><tr><td>ハリス・ユニコア 1.5mmパンチ</td><td>テッド・ペラ株式会社</td><td>15111-15</td><td>PDMSイメージングデバイスのポートを打ち抜くには</td></tr><tr><td>No.11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>PDMSの切断用</td></tr><tr><td>Dumont No.5 鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>胚の解剖とマイクロインジェクション針先を壊すため</td></tr><tr><td>Marzhauser マイクロマニピュレーター</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>マイクロインジェクション針の操作用</td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>マイクロマニピュレーター搭載用</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopumpコントローラー</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>マイクロインジェクションの量とタイミングを制御するため</td></tr><tr><td>EVOS 倒立蛍光顕微鏡</td><td>サーモフィッシャー</td><td>EVOS FL</td><td>注入した胚を画像化する</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ745</td><td>マイクロインジェクションの可視化用</td></tr><tr><td>AutoCADソフト</td><td>Autodesk</td><td></td><td>AutoCAD ファイルのダウンロード元: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853<[> および ZFIN コミュニティ プロトコルの Wiki ページ (https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ プロトコル + Wiki) &nbsp;</td></tr></tbody></table>

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

ゼブラフィッシュは、大規模な遺伝的・化学的画面を通じて基本的な発生生物学にまたがるさまざまな疾患や実験的研究の増加の範囲のための便利なツールの強力なモデルとして浮上しています。しかし、多くの実験、特にこれらの感染症と異種移植モデルに関連はマイクロインジェクションや胚とスキルと専門知識を必要とする困難な技術である幼虫の画像に依存します。精度と現在のマイクロインジェクション技術のスループットを向上させるため前、腹側、背側、または横方向に向き、2 日間ポスト受精 (dpf) でゼブラフィッシュ胚を安定させる微細構造デバイスのシリーズを開発、プロシージャ。胚のイメージングを支援、またオリエントのガラス製カバー スリップに対して平行に横方向に 4 ゼブラフィッシュ チャンネル付きシンプルなデバイスを設計しました。一緒に、ここで紹介するツールは、ゼブラフィッシュ技術の最適化のための有用なデバイスを生成するフォトリソグラフィー アプローチの有効性を示しています。

ここで説明している方法は、デザイン (図 1) および 2 dpf ゼブラフィッシュ、フォトリソグラフィー (図 2) とソフト平版 (図 3) の技術を使用して使用デバイスの作製を示します。このメソッドを使用する多くの設計イテレーションおよび変更の迅速検査、変更および開発の他の段階でゼブラフィッシュ用微細構造寸法の最適化、アプリケーションに拡張可能性があります。
我々 は、挑戦的なマイクロインジェクション技術と便利なイメージングこれらのデバイスの使用を示します。耳胞 (図 4、白点線) は、ゼブラフィッシュ9の好中球動員をテストするために便利、免疫特権および孤立したサ...

Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ ツールの範囲とインジェクションとイメージングのゼブラフィッシュの方向を提案します。

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

この方法論の全体的な目標は、ゼルブラフィッシュの幼生のマイクロインジェクションをより簡単かつ正確にすることです。この手法は、ゼブラフィッシュモデルシステムを使用する研究者が、ゼブラフィッシュの幼生を特定の向きで大きな配列に固定するのに役立ちます。この技術は、マイクロインジェクションやイメージングのために特定の組織へのアクセスを容易にし、感染症や異種移植がんモデルなどのアプリケーションに多数の幼虫が必要な場合に非常に効果的です。ゼブラフィッシュモデルでの私の製造戦略は、非常に補完的です。1つは人工的でシンプルなものです。もう1つは、ライブで複雑です。どちらも同じサイズスケールを共有しています。どちらも透明です。また、どちらもシングルセルの分解能で観察できます。ここに示すように、これらは簡単に組み合わせることができ、事実上すべての主要な疾患の研究に応用できます。E-3の薄膜で覆われたシャーレにPDMSブロックを調製した後、テキストプロトコルに従って、トランスファーピペットを使用して必要な数の胚をPDMSブロックの表面に移します。ヘアループまたは同様のツールを使用して、特に背側と腹側の向きのために、胚を微細構造のくぼみに押し込みます。幼虫をディボットにロードするときは、簡単に操作できるようにPDMSブロックを十分な水で覆うことが重要です。また、注入中に所定の位置に留まるように、それらをディボットに押し込むことも重要です。テキストプロトコルに従って事前に準備した微細構造チャネルにゼブラフィッシュを配向するには、トランスファーピペットを使用して、パターン化されたPDMSブロックからE-3を引き出します。E-3のレベルはブロックの端より下に下がるはずですが、リザーバーとチャネルにはまだ存在し、PDMS上に薄い層が残ります。トランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた10個の胚をリザーバーに移し、端がオーバーフローしないように注意します。ヘアループを使用して、各胚を漏斗ヘッドに操作し、まず適切なチャネルの入り口で、胚がチャネルに入るときに適切な向きを持つようにします。次に、ヘアループを使用して、各胚をチャネルの下にスライドさせ、所定の位置に保持するチャネル壁の配向微小特徴に到達するまでスライドさせます。マイクロインジェクション針とマイクロインジェクション溶液を調製した後、細かくテーパー状のピペットチップを使用して、5マイクロリットルの溶液を針にロードします。マグネットスタンドに取り付けたマイクロマニピュレーターに針を装着し、PICOポンプマイクロインジェクターに接続します。次に、鉗子を使用して、先細りの先端をつまむことにより、針の先端を45度の角度で折します。PICOポンプコントローラーで注入時間を調整することにより、注入ボーラスサイズを1ナノリットルに調整します。マイクロマニピュレーションコントローラーでマイクロインジェクション針の角度を、針が胚の長さに平行になるように45度から調整します。マイクロインジェクション中の胚の横方向の動きを最小限に抑えるために、より急な角度を使用することができる。左手でペトリ皿を制御し、右手で必要なマイクロマニピュレータを制御し、針を耳小胞などのマイクロインジェクションの目的部位にできるだけ近づけます。マイクロマニピュレーションコントローラーを使用して、針を標的組織に挿入し、PICOポンプフットスイッチを使用してプリセットボリュームを注入します。組織が浸透しにくい場合は、マイクロマニピュレーションコントローラーのノブを軽くたたいます。胚を放出するには、トランスファーピペットを使用してE-3を表面上から下に流すか、胚が周囲のE-3に放出されるように皿を渦巻かせます。MS-222を含まないE-3の回収皿に胚を移します。6ウェルプレートのウェルでPDMSデバイスを使用して胚をスクリーニングするには、1, 000マイクロリットルのピペットまたは先端の狭いトランスファーピペットを使用して、ポートを介してE-3を流すことでデバイスをプライミングします。E-3およびMS-222を使用して、デバイスが覆われるまでウェルを充填します。次に、トランスファーピペットを使用して、以前に注入した4つの胚を各ウェルに導入します。ヘアループまたは同様のツールを使用して、胚をイメージングチャネルの入口に所望の向きで配置し、それらを部分的にデバイスに押し込みます。これにより、それらをデバイスに均等に引き込むことができます。1, 000マイクロリットルのピペットまたはトランスファーピペットを使用して、ポートからデバイスを介してE-3を引き出し、胚がイメージングのために正しい向きでチャネルに引き込まれるまで。ウェルプレートを倒立型蛍光顕微鏡に移します。胚を画像化するには、ゼブラフィッシュのネツラオヒルの移動をイメージングするための10倍など、適切なレンズを選択して倍率を調整します。各チャンネルの光源の強度と露光時間を調整して、各信号がクリアになり、飽和しないようにします。最後に、各蛍光チャンネルと透過チャンネルの画像をキャプチャします。マイクロストラクチャードチャネルデバイスを使用して胚を横向きに安定化し、ゼブラフィッシュの受精後2日間の標準的な化学誘引物質fMLPおよびLTB4を耳小胞にマイクロインジェクションした好中球が応答する能力をテストしました。好中球の動員を可視化するために、高分子量ローダミンデキストランを用いた注入を追跡し、緑色蛍光好中球を用いたトランスジェニック胚で実施しました。非注入胚およびローダミン単独を注入した胚をネガティブコントロールとして用いた。マイクロインジェクション後、胚をイメージングチャネルデバイスに移植し、注入後30分と5時間後にEVOS蛍光顕微鏡を使用してイメージングしました。予想通り、少数の蛍光好中球が模擬注射された耳小胞に早期に動員されましたが、これはおそらく媒介動員が損傷したためです。興味深いことに、ローダミンデキストラントレーサーは、実験中に耳石に蓄積することが観察されました。どちらの走化性物質についても、好中球は、特にLTB4に応答して、より多く動員されました。この技術を習得すれば、ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションの速度と精度を大幅に向上させることができます。この技術の開発は、私たちの研究室での課題によって推進されました。私たちは、ゼブラフィッシュモデルにおける真菌感染症と腫瘍異種移植片に関するプロジェクトのニーズに合わせて、このアプローチを改良しました。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションや長時間のライブイメージングに微細構造表面アレイを使用する方法についてよく理解できるはずです。

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。...

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されました...

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

&gt;jove_content&lt;細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin...

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。...

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。...

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

本稿では、zWEDGI を説明します...

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。...

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

ここでは、3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ仔魚の in vivo...

インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

ポリエチレンテレフタレート(PET)ラミネートを用いたマイクロ流体デバイスの革新的な作製方法により、複数の生きたゼブラフィッシュ胚の捕捉とイメージングのコストと複雑さが大幅に軽減されます。...

低コストポリエチレンテレフタレートラミネートラミネートマイクロ流体工学による多重ゼブラフィッシュイメージングのための設計

学ぶゼブラフィッシュ幼虫のマイクロインジェクション手法。微細構造デバイスを用いて特定の組織へ正確にアクセスし、感染症やがんモデルなどの大規模研究に応用できます。

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

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