Name: マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学ぶマイクロマニピュレーションとFRAP・光活性化を用いた細胞骨格レギュレーターの動態解析。B16-F1細胞やNIH 3T3線維芽細胞でタンパク質の動的挙動をリアルタイムに追跡し、細胞遊走におけるアクチン細胞骨格の回転と機能を解明する方法です。

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<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
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<li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).</li>
<li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li>
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<li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li>
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<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li>
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<li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li>
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<li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li>
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<li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832(2017).</li>
<li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).</li>
<li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li>
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ここで我々 はこの記事と異なる実験条件でアプリケーションの最適化することができる方法で説明する方法で重要な手順について説明します。
インジェクションは、外因性タンパク質、阻害剤、または薬の導入からインスタントの効果を細胞の監視に適用できる方法です。困難なタンパク質の機能を決定するため特に有利であることができる細胞の種類を使ってまたは長期的な表現が望まれていない場合。それは、特定の種類の細胞の生存率は細胞外マトリックスに播かれるによって異なります注意しなければなりません。最も上皮、内皮細胞や線維芽細胞のような細胞の種類、どんな些細なもののように魚実質細胞 (ダンらを参照してください。21とアンダーソンとクロス22) に正常に注入することができます。ただし、細胞遊走のエクセレント モデル システムを構成するが、未知の理由のための下地のこのタイプの注入と互換性がない、ラミニンでシード B16 F1 セルなどの例外があります。NIH3T3 線維芽細胞を注射を実行定期的にフィブロネクチンの下地とこれら線維芽細胞 (を参照してください FRAP (光とも; B16 F1 セルここに示されている) なども同じように実行できる追加 photomanipulation テクニック例えば、Köstlerら3). また、機能のプロパティと実験目標によると、異なった蛋白質が変化、秒から時間に変化を引き起こす時間の異なる量を取るかもしれないことを考慮されなければなりません。技術の利点は、プラスミド トランスフェクションを使用してときに、外因性物質の用量・濃度をより例えば、単一セルのレベルで正確に制御可能、です。さらに、タンパク質の蛍光タグのセルには、他の蛍光付けられた蛋白質の同時多チャンネル可視化が必要な場合、柔軟性を高めることができますその存在を保証するために必要ではありません。マイクロインジェクションにインスタント細胞の形態や細胞骨格 (例えば、ダンらのダイナミックな変化に及ぼす特定の蛋白質または蛋白質の混合物の分析に特に役立ちます21 Arp2/3 複雑な阻害剤はアーピンによって移行にインスタントの効果の例のため)。技術の欠点は、その侵襲性、細胞損傷を引き起こす可能性や細胞の形態に影響を与えることができます。したがって、薬剤を実行するときの重要な考慮事項は、細胞生存率を監視されています。ここで紹介した方法は、手動操作に依存します。成功した注入、線維芽細胞のフィブロネクチン下地の成長などに対応するテスト条件でここで説明した手動注入プロトコルにより近い 100% の成功率。これは、高度で時間のかかるフォロー アップ実験ビデオ顕微鏡または FRAP、3は、以前公開などでこの方法を結合するときに不可欠です。これは時折それを除外しません、個々 の細胞は核と細胞質、セル端収縮によって続いてのコントラストの急激な変化によって安全に認識できるマイクロインジェクションのイベントから被る可能性が。このようなまれな実験的ケースは除外、さらなる分析のはみ。
ただし、半自動のアプローチはまた通常使用、例えば急速な採用 (< 300 ms) マシン制御の針を下げる針だけ前にそれぞれ各セルの上に配置されるがある、射出圧力の増加と一致します。インジェクション。半自動注射の成功率は、当然単に上記で説明した手動のアプローチよりも低い速度のために最適化されたに続いて正常にこの治療を生き延びた複数細胞の解析従ってそれは個々 のセルの挿入に依存しません。したがって、単一細胞解析とは対照的には、半自動注射よりなどビデオ顕微鏡低倍率でまたはセル固定および汚損による数百細胞の注入効果の分析に適しています。採用詳細な手法に関係なくマイクロインジェクション エンドポイント アッセイを構成していませんが、さまざまなテクニック、FRAP または photoactivation の3を含むと組み合わせることができます。
顕微鏡のセットアップおよびイメージ投射条件に応じて、レーザーの強度を最適化する必要がある FRAP によるタンパク質の離職率を決定する際 (倍率、目標、等細胞型、構造、および蛍光タンパク質のためだけでなく、フォトブリーチング用)。最適なレーザー出力で効率的な漂白と組み合わせるを最小限の光損傷収縮を避けるため、分析 (例えば、ケラトサイトまたは糸状) あるいは細胞レベルでの損傷の下で構造の後退を完了するために注意してください。理想的には、漂白効果の少なくとも 70-80% を達成する必要がありますの場合に、50% 以上のものも許容があります蛋白質の非常に急速な売り上げ高によって妨げられることがあります完全な漂白が。与えられた構造と蛍光色素の最適な漂白力が実験的に試されるべき、続いて低いレーザー力から始まって、徐々 に増加。もちろん、任意の蛍光色素が定義によって漂白するレーザー光励起のピークの近くで (488 nm FITC や EGFP など頻繁に使用される緑の染料のため)。ただし、近紫外レーザーなどのより短い波長のレーザーは高い力を提供し、したがって、一般的に使用される染料の効率的な漂白のためは使用もできます。我々 は日常的に 405 nm ダイオード レーザーを採用 (120 mW) 後者 (データ表示されません) の場合わずかに低い効率を伴い EGFP と赤の蛍光染料 (mCherry) などの漂白のため。PA GFP (下記参照) の photoactivation の 405 nm のダイオードが使える、柔軟性が最大でこのシステムを与えます。
B16 F1 セル構造と蛍光タンパク質 photobleached ここでは、65-100 mW 405 nm レーザー権限が適用されました。Photobleached 領域を分析する場合、かどうか与えられた構造は元の形にかけて保存、分析期間を考慮することが重要です。例えば、ケラトサイト ヒントで蛋白質の売り上げ高を分析する際注意が必要ケラトサイトの曲率は、大幅に時間をかけて、変更するかどうか、分析領域/輪郭がない場合、曲率の変化が不正確な結果につながる可能性があります。完全に各測定フレームの構造の全体を包含します。さらに、バンドル ケラトサイト、microspikes などに埋め込まれたが、蛍光強度で偏差を引き起こす可能性がありますに注意してください。図 2b (9 s の時間フレームの白い矢印) で示すように、田宇構造測定 photobleached 領域の横にある、測定の期間を通してそれの外側に残ります、したがっていずれかを発生しません不正確さ。タンパク質代謝回転の分析、地域分析の場所とサイズを選択するときの重要な考慮事項は、時間をかけて彼らの蛍光必要があります大幅に左右されない細胞形態の変化以外のハードを避けるために買収フォトブリーチを行なった。例えば、構造分析の構造に大きく量的貢献を提供する移動しないでください測定領域から分析時にさらに、タンパク質を引き付ける小胞の構造など無関係な蛍光灯のエンティティは分析中に興味の分野を入れません。葉状アクチン重合の速度を決定するため注意が必要、後退または機嫌 (すなわち、上向きに折る) ケラトサイトはない分析し、これが強く結果の精度に影響を与えるよう。さらに、潜在的に葉状のアクチン重合率の過大評価につながる葉状地域の急速な後方転として表示されます。追加の考慮事項は、(取得退色の補正のための参照位置として取られる) 細胞内正規化領域の距離直接を避けるために十分に大きいべき退色の実際の位置からphotobleached エリアに影響を与えます。
PA GFP 付けられた構造の photoactivation のための最適な条件を設定する場合 photoactivation の中にインスタント漂白を避けるために注意が必要があります。レーザーの力で我々 の仕事で最良の結果が得られた 5-10 倍低い EGFP の漂白のため通常用いられる。センサー分子の画像を取得する露光時間とフレーム間の時間間隔が地域とセンサー構造のサイズを考慮して最適化して分析する、センサーの潜在的な移動だけでなく、蛋白質は細胞内の他の場所に。蛍光イメージングのすべての種類、細胞生存率の維持は生理学的に関連する結果を取得するため重要です。
次のダイナミクスの均等に強力なメソッドと、lamellipodium など細胞レベル下の構造の売り上げ高は、原則として mEos など質のバリエーション12蛍光タンパク質の緑-赤光変換を構成する (例えば、見なさい・ バーネットら23). PA GFP ではなく後者の方法の利点は前に、と共同その他の赤い蛍光蛋白質を表現する必要性なし、2 つの異なる色で変換後タンパク質ダイナミクスに続く可能性であります。ただし、予備実験でコントラストの変化の程度、PA GFP の photoactivation の時に達成した蛍光信号の強さが大きかった photoconverted プローブと比較しておそらく赤と緑の優れた分光機能のため蛍光プローブ (データは示されていない)。いずれの場合では、詳細な研究ケラトサイトやワクシニア ウイルス性アクチン尾などセル端の突起部にアクチン フィラメントの売り上げ高のところのみ公開されている PA GFP 誘導体5,6,24を使用しています。
次の photoactivation を分析するどのセル領域を考慮する場合いくつかの要因べきである考慮し、(細胞質で活性化セルの端でのアクチン単量体の定款) を示す具体的な例を使用して説明するが、様々 な類似している科学的な問題に確かに推定することができます。まず、測定時葉状 cytosolically センサー蛋白質、例えば、定款の異なる実験条件で (ディムチェフらに示すよう6) ゾル性細胞質領域と葉状の端に彼らの間隔のサイズは、実験群間で同等にする必要があります。また、photoactivating 細胞質領域セル厚が核に近い位置で大きいときそれを考慮することが重要です。厚い細胞領域をアクティブにすると、与えられたがアクティブにする蛋白質の分布、細胞質に分散してゆく活性タンパク質の多量可能性があります。最後に、個々 のセルでアクティブにする蛋白質の表現のレベルを非常に可変することができますは確かに。これら変動の考慮による cytosolically 活性化タンパク質他の起動時に特定の地域で得られた合計の蛍光に対する細胞の混入レベルを比較することが重要です。
マイクロインジェクションを蛋白質の細胞の形態に及ぼす影響を調査するためのツールとしても使え、NIH3T3 と線維芽細胞が microinjected の葉状構造の強力な誘導を示すことによってこれを例示して述べるが、小さい gtp アーゼ Rac1。以前、傷跡/波3の C ターミナル WCA ドメインと microinjected のセルの Arp2/3 機能と干渉するためにこの手法を適用した.FRAP や光など、他の試金による microinjected 細胞の様々 なパラメーターを分析できます。細胞内動態とアクチン単量体の移動を調査するため、縛ると光を活用する方法を説明しました。FRAP は私たちのグループによって使用されています以前5ケラトサイト VASP、Abi、cortactin コフィリンなどにローカライズしてキャッピングの蛋白質、蛋白質の成分存在下における焦点接着斑の回転を解明するための売り上げ高を調査するにはRac の不在通知4.また、退色 EGFP タグ β-アクチン5にアクチンの重合率を測定を行うことができます、代替方法が存在します。生細胞イメージング-互換性のあるプローブ Lifeact25, などの細胞のアクチンを標識で見られるように蛍光の不均一性を追跡雇用6,26をこともできます。ここの利点は、β-アクチンの発現回避できます、セル端突起および移行を高めることができるし、したがって特定のアッセイまたは実験的質問と干渉する可能性がある (例えば、影らを参照26;ペッカムら27). ただし、Lifeact プローブの明瞭な不利な点は、細胞における Lifeact によるアクチン フィラメント構造の漂白プローブ回転でのみ情報を提供しますので、その高速に on/off するアクチン フィラメントに結合の速度論を構成します。25バインドするアクチン フィラメントの売り上げ高ではないが。蛍光の不均一性の追跡を採用した6,26は実用的な妥協を提供する、蛍光スペックルの広く使用されている追跡に似て組み込まれて糸状細胞骨格(例えばサーモンとウォーターマンの28を参照) の構造を使用するとまっすぐ進むと EGFP タグ F アクチン構造の縛るほど正確にできない場合があります。光は、アクチン単量体突出実験調整細胞内アクチン レベル6のコンテキストで、細胞質中での移動性と同様、ケラトサイト、混入率を推定するため私たちが適用されています。テクニックは、ゾル性細胞質領域などの比較的大規模な地域から派生した移動度とタンパク質の分布を調べる場合に役立ちます。しかし、比較的小さなセンサー構造由来のタンパク質の分布を調べるなど成長円錐は、蛍光分子活性の低い数字、弱い信号、およびこうして感度の不足のため困難な可能性があります。光や蛍光 (上記参照) の潜在的な代替技術は逆 FRAP フォトブリーチング依存から離れて蛍光分子の移動を追跡することによって続いて、ROI を除く全体のセルを含めることができます。この地域では。テクニックは、過剰発現タンパク質の活性型バージョンは必要ありませんが、レーザ、光損傷などの望ましくない副作用を引き起こす可能性がありますの異常に高い線量への露出は、常に。
明らかに、蛋白質はモノマー、ダイマー、または少しでもオリゴマーとして動いているかどうか、彼らは追加の結合パートナーとの組み合わせで移動かどうか photoactivation、FRAP を区別できません。その種の情報は、蛍光相関分光技術29あるいは30FLIM フレットから代わりに取得できます。それにもかかわらず、FRAP と光は、直接細胞、関心、細胞内の場所、または研究細胞型のタンパク質に関係なくローカルおよびグローバルなタンパク質の動態を評価するために簡単な方法を構成します。

蛋白質および他の分子の細胞内の時空間動態細胞および分子生物学の多くの分野で必要不可欠なツールになりました。高度な蛍光顕微鏡技術蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) FRET 蛍光寿命イメージング装置の (フレット FLIM) などまたは FRAP 蛍光退色 (フリップ) と光の損失と同様、他の多くを許可します。時間と空間の拡散の動力学とセル1,2つの蛋白質の局在を決定すると同様、タンパク質間相互作用、構造変化の追跡.特に FRAP 及び光技術、アクチン細胞骨格と細胞移動の規制を調べるため広く適用できます。これらの技術は単独でまたはマイクロインジェクション3など追加マイクロマニピュレーション技術との組み合わせで適用できます、蛍光標識したタンパク質の発現を伴います。彼らは糸状またはケラトサイト、焦点接着斑4蛋白質の売り上げ高など、細胞の移動に関与するタンパク質アクチンの豊富な構造会動態の推定を許可または分岐アクチン ネットワーク5。彼らはまた葉状アクチン重合率の定量、細胞質、突出のアクチン フィラメントの重合に細胞内のアクチン単量体転流の速度内単量体のアクチンの分散の評価を有効にします。ケラトサイト6、およびその他のパラメーター。
FRAP は、可視化とアクセルロッド7によって 1970 年代に開発された生きている細胞内のタンパク質の移動度を定量化の方法です。蛍光標識したタンパク質を設定、セル内の利益 (率 ROI) の領域は、時間の与えられた短い期間中にこの地域に存在の蛍光分子の漂白を引き起こすに十分な高強度レーザーに一過性公開されます。無漂白、ROI 外漂白中に、あるタンパク質を蛍光標識は、拡散し、時間をかけて photobleached 分子の変位を引き起こしている彼らの時空間ダイナミクスに応じて漂白地域に潜入します。漂白領域の蛍光回復率はサイズおよび特定の分子の拡散の速度など、さまざまな要因に依存して、もちろん推定以内の離職率は、漂白構造を関連付けられています。したがって、水溶性タンパク質の焦点接着斑などの構造体にしっかりと関連付けられている蛋白質中の拡散を介して急速に漂白の ROI 内の蛍光回復を仲介、回転時間が長くなる蛍光回復されますよう構造関連の端数のタンパク質と解離・会合反応の可溶性画分の拡散の両方に依存してください。蛍光回復は通常取得し、蛍光の前漂白剤強度の初期レベルに到達するまでを定量化します。ただし、初期の蛍光強度の一部拡散によって補充することができないいわゆる不動分画に属するまたは携帯電話を構成する分子の大半と比べて非常に遅い速度で補給する場合は発生しませんこれ割合です。タンパク質代謝回転の率を決定するには、時間をかけて蛍光回復の程度を表す FRAP 曲線が生成されます。これらの回復曲線からタンパク質の回収の平均半分時間を計算できます。カーブ フィットの平均 FRAP データ、およびそれゆえ数学的な解析を作成すると、それはモバイルの割合の平均離職率分子の 1 つの同質な人口の複合体を構成するかどうかで構成されるを推測することが可能も分子変化率でめくりの 2 つ以上の集団。定量的アプローチによるタンパク質離職率を推定、に加えてラメリポディアにおける photobleached 領域の回復を追跡もできます逆行流れ、前突のような葉状運動パラメーターの正確な定量化のためアクチン重合率。したがって、FRAP は生きている細胞の構造内のさまざまなパラメーターの評価に適用される汎用性の高いツールを構成します。
光は、拡散とタンパク質、分子細胞の指定された場所からの移動を追跡するために使用方法です。技術を採用、例えば、パターソンとリッピンコット シュワルツは8、その蛍光は高度への露出に増加することができる方法で変異が当初開発した野生型緑色蛍光タンパク質 (GFP) のバリアント紫外線 (UV) (約 400 nm; ここでは、405 nm)。パターソンらによる記述で。、野生型 GFP の発色団は、中性フェノールと約 397 で主要な吸収ピークを生成する陰イオンのフェノールの混合された人口として存在する nm および 475 マイナー 1 nm、それぞれ。紫外光を用いたタンパク質の照射、人口は光電、アニオン形へシフトを受けます。488 によって励起され、nm、photoconverted/センサー蛋白質蛍光性、高い固有バック グラウンド蛍光による GFP を非アクティブし、アクティブの間を区別するために練習不足の 3 倍の増加を展示します。ただし、背景強度の低下は GFP シーケンス (ヒスチジン置換位置 203) に単一のアミノ酸変異を導入することで達成されています。結果の T203H の変異、活性型 GFP (PA-GFP) は紫外線を照射後、488 nm の光によって励起され、ほぼ 100 倍増加したマイナー ピークの吸光度の大幅な削減によって特徴付けられるとも呼ばれます。したがって、PA GFP 付けられた蛋白質の過剰発現は細胞内の拡散の定量と分子の運動ができる広く使用されているアプローチです。我々 は以前の突出に細胞質だけでなく、その混入率内で自分たちのモビリティの探査だけでなく許可を PA GFP 付けられたアクチン アクチン単量体ゾル性細胞質の領域からの分散の率を決定するに適用しました。葉状アクチン ネットワーク6。最近の文献では、原則的に類似の方法で使用することができます、新しい写真に変換できるタンパク質についても説明しますが既に写真変換の前に表示されるように潜在的な利点をかくまっています。蛍光蛋白質のこのグループのための例には、Dendra2 と mEos29,10,11,12が含まれて。
この記事では、マイクロインジェクション細胞蛋白質との方法論を説明します。我々 はさらにたたきでこの手法を結合する退色タンパク質アクチン細胞骨格制御と運動性に関与する方法、FRAP 曲線とモバイル分数の回復の時間の半分の派生を説明します。加えて、我々 は FRAP 手法を使用して、葉状ネットワークのアクチン重合率を決定する方法の例を提供します。指示と単量体のアクチンの細胞内移動とアクチン ケラトサイト混入率を決定する使用ことができます光の実験を実行する方法についてのヒントをお願いいたします。もちろん、これらのテクニックはありませんアクチン細胞骨格部品を追跡するが、潜在的に必要な適度な適応または最適化時にのみ、広く適用できる他のセルタイプまたは構造、異なった蛋白質を調査してパラメーター。

<table><tbody><tr><td>B16-F1マウス皮膚黒色腫細胞&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-6323</td><td></td></tr><tr><td>NIH-3T3 cells</td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5g/L グルコース&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ、Thermno Fisher Scientific、ドイツ</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>ハムs F-12 ミディアム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8641</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清&nbsp;(FCSの)</td><td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Fetal wevine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>F7524</td><td>Lot054M3396</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glumatine 200mM (100x)</td><td>Life Technolgies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 5000 U/mL</td><td>Life technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Lamininコーティングバッファー&nbsp;</td><td></td><td></td><td>自作:ヒト血漿由来の50mM Tris ph7.4、150mM NaCl</td></tr><tr><td>Fibronectin&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td><td>11 051 407 001</td><td></td></tr><tr><td>Jetpei</td><td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>JetPei buffer</td><td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td><td>702-50</td><td>150mM NaCl</td></tr><tr><td>PA-GFP-actin プラスミド DNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Koestler et al.2008</td></tr><tr><td>pEGFP-actin plasmid DNA</td><td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rac1 protein for microinjection</td><td></td><td></td><td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST before to injection</td></tr><tr><td>Microinjection buffer</td><td></td><td></td><td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td></tr><tr><td>デキストラン、テキサスレッド、70,000 MW、リジン固定可能</td><td>分子プローブ、Thermno Fisher Scientific、ドイツ</td><td>D1864</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>円形カバーガラス15mm、No.1&nbsp;</td><td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td><td>1001/15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5242 956 003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Grease&nbsp;</td><td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td><td>SGM494</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム オープン ダイヤモンド バス イメージング チャンバー</td><td>ワーナー インスツルメンツ</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>自動温度コントローラー</td><td>ワーナー インスツルメンツ</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡: Axio Observer&nbsp;</td><td>Carl Zeiss、イェーナ、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap-HQ2カメラ&nbsp;</td><td>フォトメトリクス、アリゾナ州</td><td></td><td></td>ツーソン</tr>、<tr><td>ラムダDG4光源&nbsp;</td><td>Sutter Instrucment、Novato、CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー光源&nbsp;</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJetマイクロインジェクター&nbsp;</td><td>エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ</td><td></td><td>圧力供給用コンプレッサー内蔵</td></tr><tr><td>ニコン成重マイクロマニピュレーターシステム</td><td>ニコンインスツルメンツ、日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiviewソフトウェア v2.1.4</td><td>Visitron Systems、プッフハイム、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタモルフソフトウェア v7.8.10</td><td>Molecular Devices、サニーベール、CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シグマプロットv.12</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

蛋白質の時空間的ダイナミクスを調べることは、さまざまなコンテキストでその機能の重要性を明らかにできます。この記事でそれは細胞レベル下の場所で蛋白質の時空間的ダイナミクスを研究する議論方法蛍光回復退色 (FRAP) と光技術を使用ことができますです。またこれらの技術がアクチン細胞骨格の調節および細胞の運動性にリンクされているさまざまなパラメーターの簡単な測定を有効にする方法を示す.さらに、細胞のマイクロインジェクションさらに記載されます (前または前述の photomanipulation 技術を補完する可能性のある) 代替治療としてトリガー瞬時に及ぼす転蛋白質の細胞形態と機能。マイクロマニピュレーション タンパク質注射または細胞膜透過性の薬や細胞骨格阻害剤の外用などが単一の細胞で、細胞内の細胞の変化を与えられた治療の直接の結果を記録するための強力なツールとして使用できます。レベル。これによって例証されるここで葉状の細胞の端の突起の即時誘導蛋白遺伝子組換え Rac1 注入による四半世紀の前を確立。さらに、我々 は強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) の売り上げ高を決定するためプロトコルを提供-VASP、B16 F1 セルの葉状のヒントで蓄積され目立つようにアクチン フィラメント ポリメラーゼ FRAP を用いたなど関連データ解析と曲線フィット。タグ付きの EGFP β-アクチンを発現する細胞に代表されるよう、また葉状アクチン ネットワーク重合率を推定するためのガイドラインを提案します。急速なフィラメントのアセンブリ、ケラトサイト、突出のヒントなど photoactivation を使用してのサイトにおいてアクチンの設立に続いて、細胞の細胞内のアクチン単量体移動の率を調査する方法について指示がある最後に、近づきます。これらのプロトコルのどれもがコンポーネントまたはアクチン細胞骨格の調節だけでは類似しているファッション時空間ダイナミクスとさまざまな異なる細胞構造や機能タンパク質の機能を探索する簡単に拡張することができます。コンテキストです。

図 1 ghは、事前 NIH3T3 線維芽細胞の位相コントラスト画像と 10 分後マイクロインジェクション Rac1、小さな Rho ファミリー GTPase の複雑な波との相互作用を通じてケラトサイト形成を誘導することが可能であるを示しています。セルは、最初その生存率と形態、ケラトサイトの欠如など、確認してマイクロインジェクション (図 1g)、前に可視化します。10 分後のインジェクションでセルは明らかに成功した注入 (図 1h) を表し、この治療から期待されて、その形態を変更されました。
シンプルさと透明度、次の細胞は、さらに microinjected されていない FRAP ・光分析模範的な結果を提供します。
図 2a ~ fに EGFP タグ VASP lamellipodium 先端の回転の分析を示します。VASP さらに新生と焦点接着斑、小さくて細長い細胞内部18,19ドット対象であることに注意してください。先端に明確な VASP 蓄積と葉状領域の蛍光強度は漂白され、各時間フレームの前に、中、および、lamellipodium 突出転送、漂白後、ROI の輪郭に従うことによって測定します。漂白の EGFP VASP タンパク質は、これらのサイトでの分子の非漂白によってリサイクルされています、蛍光の緩やかな回復は観察した (図 2b)。FRAP 復旧曲線 (表記 1) 事前ブリーチ強度に正規化し、この方法で得られるは、図 2cで見ることができます。フォトブリーチング効率が変わることができるし、t0 の値から決定するように、この例では漂白する前に、値の約 20% であった (退色後最初のフレーム)。漂白する前に蛍光の約 80% で示されている例では高原を蛍光の増加に達する。回復は、(の場合、図 2の赤い矢印の不動の割合として定義後に事前ブリーチ強度と高原蛍光の違いに達して焦点接着などの実験の経過中に静的な構造でc、e)、漂白および完全復旧の時間の間回復した蛍光性の量に対しはモバイルの分数 (図 2c、eの緑矢印に変わったら) として定義されます。ここ分析 lamellipodium ヒントなど動的に変化する構造で IF の範囲可能性がありますだけでなく不動の分子を表すが、EGFP VASP 強度はこれに依存して知られている隆起速度の減少を由来パラメーター18。回復の半分の時間を計算するため、フィット カーブはシグマ プロット (図 2d) に作成されました。この場合、方程式 2を解決から抽出した"b"パラメーターの値は等しい 0.0754、するときに対数関数 (式 4) に適用 9.19 の回復の半分の推定時間の結果 s (図 2d、右端のパネル) は比較的高速、平均と比較してこの特定のセルには、以前5公開します。それは、回復 1.5 倍異なることがあります時々 大幅セルからセルに同じ集団内で注意しなければなりません。したがって、代表的な結果を得るため、少なくとも 15-20 セルから平均値としてこのパラメーターを決定することをお勧めします。15 セルの平均 EGFP VASP 回復の算術平均の分散の度合いを説明するために各時点が生成された (図 2e) と平均曲線適合作成し、似ています (図 2で表示されます。f)。
葉状アクチン ネットワークの重合率には、フォワード ネットワーク突起と逆行の流れの合計が装備されています。FRAP は、EGFP タグ β-アクチンとフォトブリーチング葉状突出地域 (図 2g) (この場合は B16 F1) で株細胞のアクチン重合速度を測定するために適用できます。葉状アクチン ネットワークの重合反応の解析、EGFP タグ β-アクチンの漂白時に蛍光回復時間をかけて評価が。(これはすべてフロント20に向かってポイント) 葉状アクチン フィラメントの有刺鉄線の両端にアクチン単量体が進む重合、ネットワークは常に転後方と転送、進行率を簡単にすることができます。退色時の蛍光の偏光の回復を介して取得。Lamellipodium の蛍光回復が完了するとすぐに漂白のゾーン、lamellipodium の背面部分とより多くのフィラメントの水平配置バンドルの低密度によって特徴付けられるラメラ間遷移領域に達しています。ひっくり返ること、lamellipodium で観察されたものよりもはるかに遅く。突起と逆行 (個別に代表される流れの距離を測ることができますラメラへの逆方向の端に水平ラインとしての蛍光回復を視覚化できます図 2gに示すように、オレンジと赤の矢印に変わったら、として図 2gの右端のパネルでそれぞれ)。
また PA GFP アクチン細胞質のアクチン単量体の移動とケラトサイトの突出に含める率を追跡するための B16 F1 セルに光に用いています。405 nm レーザーへの露出によってセンサー図 3a、bに示すように、ゾル性細胞質領域には、画像は、GFP に買収された中チャネルごとの 1.5 s GFP タグ、センサー アクチンの分布を可視化します。図 3bのゾル性細胞質領域拡散センサー GFP アクチンを見ることができます。センサーのゾル性細胞質領域の蛍光強度の減少率は t0 で初期強度の割合として表されます (最初 photoactivation; 後フレーム図 3c). センサー アクチンはまたケラトサイト、突起の中にアクチン フィラメントを伸長の成長とげのある端に新しいアクチン単量体を追加する場合の先端に統合します。葉状の混入率を推定するには、約 5 μ m の幅と高さに 1 μ m の 2次元輪郭/地域の時間をかけての蛍光強度を測定しました。地域が突出してそれと lamellipodium の先端に常に再配置されます。アクチン結合は t0 でセンサーのゾル性細胞質領域の蛍光強度の割合として表された (図 3d)。アクチン フィラメントの伸長に伴って新しいアクチン単量体が葉状の前面に組み込まれました。これらのアクチン単量体のほんの一部は、モノマーがセンサーをしたゾル性細胞質のプールから派生した確率的。これは、結果最初の 20 ラメリポディアにおける蛍光の急激な増加、photoactivation 後 s。葉状のフロント、逆行性流れによるラメラへフィラメントを以前組み込まれたアクチン単量体流に新規モノマーを追加されています。時間をかけて、投資収益率は完全に満ちている蛍光モノマーと蛍光のプラトーに達する (図 3d)。細胞全体のセンサーのモノマーの拡散に続くとき蛍光の漸進的な低下はさらに観察を非センサー アクチン単量体ますます再に追加されている葉状フロント。この蛍光の減少は、センサーとセンサー以外の単量体間のセル全体のバランス (データは示されていない) に達するとすぐに到達する新しい高原を見つけるでしょう。
細胞質中のアクチン単量体の可動性は等しいサイズ (図 3、ラベルの色分けされた地域によっての代表されるセンサー領域から遠配置の地域で蛍光強度を測定することにより派生しました。R1-R5)。図 3eで示すように、これらの領域のそれぞれの蛍光強度から離れて減少しつつ、cytosolically センサー領域センサー アクチン単量体の一部となるますますで希釈アクティブ化されていない (つまり、非蛍光) 単量体。さらに、蛍光のピークに達する後で: より遠い測定地域のあるセンサー領域からこれらの地域に拡散してアクチン単量体に必要な時間が長くなります。蛍光高原に達するの半分の時間を定量化することで、各地域にアクチン単量体浸潤度の代表値を派生できます。遠くにびまん性に存在するアクチンをセンサーにかかる地域は、もはや、従ってより多くの時間は蛍光高原に到達するのに必要な高い t1/2値 (図 3e) に 。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> 図 1: 商工会議所アセンブリ、マイクロインジェクション プロシージャをイメージングします。(、) のイメージングの商工会議所のコンポーネント。(b) シリコン グリスをプラスチック製のシーラーの開口部の周り慎重に塗った。(c)、coverslip はセル側イメージング チャンバー開口部に上向きに配置されます。(d) 安全シールを設立、coverslip の上にプラスチック製のシーラーを配置することで、側面のクランプを締めて。(e) 顕微鏡媒体は、商工会議所スロットに戻です。顕微鏡ステージにイメージング室 (f) が配置されて、熱感知器、電極は 37 ° C に設定事前加熱装置にリンクされて、細胞は顕微鏡を開始する前に、少なくとも 30 分の適応できます。この例では、顕微鏡ステージも装備マイクロマニピュレーター薬剤を実行するため、マイクロインジェクション針は、イメージングのチャンバーに細胞層をカバーする媒体に浸したもの。(g)、NIH3T3 線維芽細胞はマイクロインジェクションの前に位相差顕微鏡による可視化します。核コンパートメントの赤十字は、かさばる核に近いのため高い細胞質領域に対応する将来のマイクロインジェクションの場所を示します。Rac1 と 10 分以下 (h) マイクロインジェクション、セル (緑色の矢印によって示されます) セル全体周辺ケラトサイトの著名な形成によって反応します。<a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> 図 2:FRAP タンパク質回転または葉状アクチン重合の速度を決定することができます。示される葉状部退色する前に EGFP VASP を表現する B16 F1 セルの (、) の代表例です。別様に着色された輪郭/図形蛍光強度測定の時間の経過と考えられていた領域を示すラベルが付けられます。メモ赤い輪郭感嘆符、複数の小胞と細胞表面フリルを含む領域に配置されているゾル性細胞質領域のラベルを付けられます。彼らが不正確な結果を引き起こす可能性があります蛍光の強い短期的な変動によって特徴付けられる、このような動的な領域は蛍光参照領域を選択するため避けてください。(b) 葉状 EGFP VASP 発現細胞前に、と退色後の領域。時系列的に視覚化が紫でマークされた領域内で退色後蛍光信号の回復。矢印はアクチン フィラメントの高密度のために可能性が高い VASP の濃縮、マイクロ スパイクの先端を示します重合が19。縛るの例 (c) 復旧曲線としては b 赤 photobleached lamellipodium (紫色の輪郭) の蛍光強度の定量化から派生し、右側の緑の線は、それぞれ、不動とモバイルの分画を示します。(d) A は c (左側のパネル) で縛る復旧曲線と回復半分時間 (右側のパネル) を導出するために使用する計算法の例のフィット。FRAP 復旧の例 (e) 曲線は、サンプルの母集団内の可変性を示す SEM バーで 15 細胞の蛍光回復曲線を平均から派生します。(f) カーブ フィットは、平均 15 セル (左側のパネル) と回復半分時間 (右側のパネル) を導出するために使用する計算法の例の FRAP 回復曲線フィットから派生します。(g) 葉状部漂白示されるように、上に続いて、lamellipodium の蛍光回復時間の前後にタグ付きの EGFP β-アクチンを表現する B16 F1 セルの lamellipodium を突出のタイムラプス パネル。右端のパネルでは、突起の測定値と逆行の距離が提供されます (オレンジと赤、それぞれ)。画像パネルの下の計算では、突起と逆行の距離の合計を使用して葉状アクチン ネットワークの重合率を導出する方法を明らかにします。<a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> 図 3:PA GFP アクチン単量体細胞全体の追跡のための Photoactivation 。赤丸 (PA) ゾル性細胞質領域の光をトリガーする前に PA GFP アクチンを表現する B16 F1 セルの (、) A の代表的な例。別様に着色された輪郭蛍光強度測定の時間の経過と考えられていた領域を示すラベルが付けられます。次の PA GFP アクチンの時空間分布の図 (b) の光。それから拡散するセンサー アクチン蛍光センサー、ゾル性細胞質領域 (赤い円) の漸進的な減少に注意します。フロントとネットワークにアセンブリへの拡散、原因センサー アクチン単量体はケラトサイト (シアン領域) で、距離と時間依存的細胞質 (別色分けされた領域) の中で徐々 に拡張されています。蛍光センサーのゾル性細胞質領域 (b で赤い輪郭) の (c) 代表的な一時的な減少。(d) 時間葉状領域 (b シアン輪郭) の蛍光強度の変化。(e) ゾル性細胞質の地域 (b の色分け) photoactivation の領域から可変間隔の位置決めのための蛍光強度の変化の代表的な曲線。蛍光に到達半分倍のプラトーに注意してください (右側の凡例に示されます) の距離とともに増加地域 photoactivation の領域に、与えられた可能性が増加との関連付けにアクチン単量体の拡散に必要な時間、それぞれの地域。<a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

どのように FRAP など photoactivation のマイクロ ・ photomanipulation テクニック運動パラメーターの決定法を有効にして移行内のタンパク質の時空間ダイナミクスについて述べる。細胞内動態と回転運動の規制当局または基になるアクチン細胞骨格の実験的読み出しが含まれます。

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

マイクロマニピュレーションとFRAPや光活性化などの光学顕微鏡技術を組み合わせて使用する全体的な目標は、異なる条件またはシグナル伝達経路に依存する方法で細胞骨格の調節と移動に関与するタンパク質の時空間ダイナミクスを監視することです。ここで説明するマイクロマニピュレーション法は、あらゆる種類の分子を細胞に直接導入するだけでなく、定義された細胞内位置でのタンパク質活性の光誘導操作にも有用です。したがって、ここで紹介する手法の主な利点は、タンパク質が細胞に及ぼす瞬間的な影響を決定するとともに、細胞全体の移動性を追跡できることです。この手順を開始するには、以前に増殖させたB16-F1細胞を1対5の比率で3cmのプラスチック皿に継代します。細胞培養培地を吸引します。PBSで細胞を洗浄し、PBSを吸引し、トリプシンEDTAを添加して細胞を剥離します。トリプシン処理した細胞に細胞培養培地を添加します。この遠心分離機を1000rpmで3〜5分間遠心分離した後、細胞を再懸濁してファルコンチューブに移します。B16-F1細胞を3cmの皿に座らせ、少なくとも6時間広げた後、150ミリモルの塩化ナトリウムを含む溶液に500ナノグラムのDNAコンストラクトと1マイクロリットルのトランスフェクション試薬の混合物を加えてB16-F1細胞をトランスフェクションします。B16-F1細胞の場合、15ミリメートルのカバースリップに150マイクロリットルのラミニン溶液をコーティングし、室温で1時間インキュベートします。NIH 3T3細胞の場合、カバースリップをフィブロネクチン溶液でコーティングし、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、ラミニンとフィブロネクチンをインキュベートしたカバースリップをPBSで洗浄し、PBSを吸引します。NIH 3T3線維芽細胞の2ミリリットルを、コンフルエントディッシュからフィブロネクチンコーティングされたカバースリップに1対20の比率で播種します。トランスフェクションしたB16-F1細胞の2ミリリットルを、コンフルエントディッシュからラミニンコーティングされたカバースリップに1対30の比率でピペットで移します。これに続いて、細胞をラミニンおよびフィブロネクチンでコーティングされたカバースリップに広げ、顕微鏡検査の前に摂氏37度の組織培養インキュベーターで一晩滑ります。セル側を上にしてカバーガラスを熱伝導性RC-26アルミニウムイメージングチャンバーに置きます。次に、カバーガラスの上にプラスチックシーラーを置き、カバースリップとチャンバーとの間にしっかりとシールし、プラスチックシーラーをチャンバーのスライドクランプにねじ込んで固定し、媒体の漏れを防ぎます。次に、摂氏37度に予熱した顕微鏡用培地を中央部にピペッティングします。熱検出器をチャンバーの指定スロットに挿入し、チャンバーの電極を摂氏324度の一定温度を維持するTC-37B自動温度コントローラーにリンクします。以前に解凍したタンパク質溶液を10, 000Gで少なくとも30分間遠心分離し、マイクロインジェクションキャピラリーに存在する場合、針の詰まりにつながる可能性のあるタンパク質凝集体を除去します。フレキシブルピペットチップを使用して、マイクロインジェクションニードルに1マイクロリットルのタンパク質溶液を裏側からロードします。針先に気泡がある場合は、針の根元を軽くたたいて気泡を取り除きます。次に、マイクロマニピュレーションデバイスのニードルホルダーを慎重に調整します。マイクロインジェクション針をニードルホルダーにねじ込むと、マイクロインジェクション圧力装置を使用して針に圧力を加えてから、針先を細胞培養培地に移します。次に、低倍率の対物レンズを使用して視野内に針を配置し、目的の細胞を見つけて、針を細胞の上に徐々に下げます。マイクロインジェクションの場合は、細胞に浸透するのに十分な細胞の原形質膜に優しく触れるか、顕微鏡のセットアップを非常に優しくタップして一過性の膜破裂を助けます。細胞への流れが見えたらすぐに、針先を培地に動かして注入プロセスを停止します。レーザーをトリガーする前に、GFPチャンネルに切り替えて、画像タイムラプス取得を開始します。これに続いて、ディスプレイを見ながらGFPチャンネル上に光退色する領域を手動で描きます。画像取得の開始後、少なくとも3〜4フレーム後に405ナノメートルレーザーの手動トリガーによって光退色を開始します。ソフトウェアでのGFP 488ナノメートル画像取得を、露出500ミリ秒、時間間隔1500ミリ秒に設定します。次に、デュアルチャンネルまたはトリプルチャンネルのタイムラプス動画を取得するためのソフトウェア設定を調整するには、波長シリーズを正方形にマークし、取得波長メニューで希望のチャンネル数を選択します。レーザーをトリガーする前に、画像タイムラプス取得を開始し、ディスプレイを見ながら位相コントラストチャネルに光活性化する領域を手動で描画します。これに続いて、画像取得の開始後少なくとも3〜4フレーム後に405ナノメートルレーザーの手動トリガーによる光活性化を開始します。FRAP結果を解析するには、VisiViewから取得したタイムラプス動画をMetaMorphソフトウェアで開きます。MetaMorphを使用して各領域を手動で描画することにより、蛍光回復の各時点の光退色領域の強度値を導き出します。ラメリポディウムの先端に、光退色領域の全体または一部を覆う形状を描き、必要に応じて後続のフレームでの位置を手動で調整して、前進する先端の変位中に各領域のラメリポディアル強度の経時的な変化を追跡します。背景の補正と光退色取得のために、細胞の外側と内側の領域をそれぞれ分析します。関心領域を選択したら、メニューの測定領域測定値を使用して、MetaMorphで強度値を抽出します。[Lasted Time] と [Average Intensity] のオプションが [Configure] メニューで選択されていることを確認します。[ログを開く] をクリックし、[動的データ交換] を選択します。次に、[OK]をクリックしてExcelスプレッドシートを開き、[ログを開く]ボタンをもう一度クリックしてMetaMorph値をExcelに貼り付けます。MetaMorphから導出された強度値を使用して、適切な式を含むExcelスプレッドシートに強度値を貼り付けることにより、FRAP蛍光回復曲線を計算します。光退色領域の蛍光回復は、バックグラウンド領域と内部領域に正規化されます。蛍光回復の半分の時間を計算するには、蛍光回復曲線の値と対応する時間をSigmaPlotに貼り付けてから、ダイナミックフィットウィザードの指数関数的上昇最大ツールを使用してカーブフィットを実行し、最適なカーブフィットに応じてモノ指数関数またはバイ指数関数を選択します。選択した関数を解いて得られたパラメータは、適切な式を含むExcelスプレッドシートに貼り付けることができ、それぞれの回復の半分の時間を秒単位で計算できます。活性化時の光活性化可能なアクチンの拡散と、ラメリポディウムなどの特定の領域内での蓄積を測定するには、MetaMorphを使用して、各領域および細胞外の経時的な強度を決定し、標準化のためのバックグラウンド蛍光を決定します。光活性化可能なアクチンが活性化領域から離れる正確な変位速度、またはラメリポディウム内への取り込み速度を調べるには、以前にMetaMorphから得られたデータから蛍光曲線を生成します。正規化に使用した背景領域、光活性化細胞質領域、または調査対象のラメリポディアル領域の強度値を、適切な式を含むExcelスプレッドシートに貼り付けます。ここでは、小さなGTPase Rac1のマイクロインジェクション前後のNIH 3T3線維芽細胞のフェイスコントラスト画像を示します。マイクロインジェクションの約12分で、細胞はその形態を変化させ、インジェクションが成功したことを示しています。ここでは、漂白されたEGFP VASPをラメリポジウム先端の非漂白分子にリサイクルする様子を示しています。この特定の例では、漂白前の蛍光の約80%で蛍光プラトーを回復します。光活性化されると、光活性化されたGFPアクチンは細胞質領域から急速に拡散します。光活性化アクチンモノマーの一部が前方に移動し、ラメリポディアで急速に蛍光を発散します。光活性化アクチンモノマーの画分がサイトゾルを通過する途中で非活性化モノマーで希釈されるため、光活性化領域から離れたラメリポディアでは、蛍光の取り込みが非常に低くなります。光活性GFPアクチンは、時間の経過とともに光活性化領域から拡散すると、非光活性化非蛍光アクチンに連続的に置換されます。その結果、この領域の蛍光強度が徐々に減少することが観察されます。時間の経過とともに、細胞質活性化領域に近いラメリポディアは、蛍光アクチンを急速に取り込む。その後の蛍光の低下は、単にアクチンの解重合とラメリポジウムからのモノマーの拡散によるものです。したがって、単一の顕微鏡システムで実験を行う場合、マイクロインジェクションとFRAPまたは光活性化技術の組み合わせは、調査するタンパク質の性質に応じて数分で現実的に実行できます。マイクロマニピュレーションの前、最中、後、またはレーザー光線への曝露後、常に自分自身を幸せに保つことを忘れないでください。FRAPと光活性化の場合、選択した領域が映画の期間中、その構造的完全性を維持することが特に重要です。マイクロインジェクションの手順は、細胞内レベルでの特定の治療の即時的な結果に対処するために、原形質膜透過性薬物または細胞骨格阻害剤の局所適用によって補完することができます。マイクロマニピュレーション技術は、細胞骨格成分や複合体の拡散特性や細胞内ダイナミクスを探求し、細胞の形態形成を調節する二次経路を理解する道を開きました。このビデオを見れば、細胞質タンパク質、細胞骨格内の活動に組み込まれたタンパク質、または異なる細胞内小器官に存在するタンパク質の時空間ダイナミクスを追跡および監視する方法を十分に理解し、最終的に細胞調節の動態を解明する方法を理解できるはずです。

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