マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

マイクロマニピュレーションとFRAPや光活性化などの光学顕微鏡技術を組み合わせて使用する全体的な目標は、異なる条件またはシグナル伝達経路に依存する方法で細胞骨格の調節と移動に関与するタンパク質の時空間ダイナミクスを監視することです。ここで説明するマイクロマニピュレーション法は、あらゆる種類の分子を細胞に直接導入するだけでなく、定義された細胞内位置でのタンパク質活性の光誘導操作にも有用です。したがって、ここで紹介する手法の主な利点は、タンパク質が細胞に及ぼす瞬間的な影響を決定するとともに、細胞全体の移動性を追跡できることです。

この手順を開始するには、以前に増殖させたB16-F1細胞を1対5の比率で3cmのプラスチック皿に継代します。細胞培養培地を吸引します。PBSで細胞を洗浄し、PBSを吸引し、トリプシンEDTAを添加して細胞を剥離します。

トリプシン処理した細胞に細胞培養培地を添加します。この遠心分離機を1000rpmで3〜5分間遠心分離した後、細胞を再懸濁してファルコンチューブに移します。B16-F1細胞を3cmの皿に座らせ、少なくとも6時間広げた後、150ミリモルの塩化ナトリウムを含む溶液に500ナノグラムのDNAコンストラクトと1マイクロリットルのトランスフェクション試薬の混合物を加えてB16-F1細胞をトランスフェクションします。

B16-F1細胞の場合、15ミリメートルのカバースリップに150マイクロリットルのラミニン溶液をコーティングし、室温で1時間インキュベートします。NIH 3T3細胞の場合、カバースリップをフィブロネクチン溶液でコーティングし、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、ラミニンとフィブロネクチンをインキュベートしたカバースリップをPBSで洗浄し、PBSを吸引します。

NIH 3T3線維芽細胞の2ミリリットルを、コンフルエントディッシュからフィブロネクチンコーティングされたカバースリップに1対20の比率で播種します。トランスフェクションしたB16-F1細胞の2ミリリットルを、コンフルエントディッシュからラミニンコーティングされたカバースリップに1対30の比率でピペットで移します。これに続いて、細胞をラミニンおよびフィブロネクチンでコーティングされたカバースリップに広げ、顕微鏡検査の前に摂氏37度の組織培養インキュベーターで一晩

セル側を上にしてカバーガラスを熱伝導性RC-26アルミニウムイメージングチャンバーに置きます。次に、カバーガラスの上にプラスチックシーラーを置き、カバースリップとチャンバーとの間にしっかりとシールし、プラスチックシーラーをチャンバーのスライドクランプにねじ込んで固定し、媒体の漏れを防ぎます。次に、摂氏37度に予熱した顕微鏡用培地を中央部にピペッティングします。

熱検出器をチャンバーの指定スロットに挿入し、チャンバーの電極を摂氏324度の一定温度を維持するTC-37B自動温度コントローラーにリンクします。以前に解凍したタンパク質溶液を10, 000Gで少なくとも30分間遠心分離し、マイクロインジェクションキャピラリーに存在する場合、針の詰まりにつながる可能性のあるタンパク質凝集体を除去します。フレキシブルピペットチップを使用して、マイクロインジェクションニードルに1マイクロリットルのタンパク質溶液を裏側からロードします。

針先に気泡がある場合は、針の根元を軽くたたいて気泡を取り除きます。次に、マイクロマニピュレーションデバイスのニードルホルダーを慎重に調整します。マイクロインジェクション針をニードルホルダーにねじ込むと、マイクロインジェクション圧力装置を使用して針に圧力を加えてから、針先を細胞培養培地に移します。

次に、低倍率の対物レンズを使用して視野内に針を配置し、目的の細胞を見つけて、針を細胞の上に徐々に下げます。マイクロインジェクションの場合は、細胞に浸透するのに十分な細胞の原形質膜に優しく触れるか、顕微鏡のセットアップを非常に優しくタップして一過性の膜破裂を助けます。細胞への流れが見えたらすぐに、針先を培地に動かして注入プロセスを停止します。

レーザーをトリガーする前に、GFPチャンネルに切り替えて、画像タイムラプス取得を開始します。これに続いて、ディスプレイを見ながらGFPチャンネル上に光退色する領域を手動で描きます。画像取得の開始後、少なくとも3〜4フレーム後に405ナノメートルレーザーの手動トリガーによって光退色を開始します。

ソフトウェアでのGFP 488ナノメートル画像取得を、露出500ミリ秒、時間間隔1500ミリ秒に設定します。次に、デュアルチャンネルまたはトリプルチャンネルのタイムラプス動画を取得するためのソフトウェア設定を調整するには、波長シリーズを正方形にマークし、取得波長メニューで希望のチャンネル数を選択します。レーザーをトリガーする前に、画像タイムラプス取得を開始し、ディスプレイを見ながら位相コントラストチャネルに光活性化する領域を手動で描画します。

これに続いて、画像取得の開始後少なくとも3〜4フレーム後に405ナノメートルレーザーの手動トリガーによる光活性化を開始します。FRAP結果を解析するには、VisiViewから取得したタイムラプス動画をMetaMorphソフトウェアで開きます。MetaMorphを使用して各領域を手動で描画することにより、蛍光回復の各時点の光退色領域の強度値を導き出します。

ラメリポディウムの先端に、光退色領域の全体または一部を覆う形状を描き、必要に応じて後続のフレームでの位置を手動で調整して、前進する先端の変位中に各領域のラメリポディアル強度の経時的な変化を追跡します。背景の補正と光退色取得のために、細胞の外側と内側の領域をそれぞれ分析します。関心領域を選択したら、メニューの測定領域測定値を使用して、MetaMorphで強度値を抽出します。

[Lasted Time] と [Average Intensity] のオプションが [Configure] メニューで選択されていることを確認します。[ログを開く] をクリックし、[動的データ交換] を選択します。次に、[OK]をクリックしてExcelスプレッドシートを開き、[ログを開く]ボタンをもう一度クリックしてMetaMorph値をExcelに貼り付けます。

MetaMorphから導出された強度値を使用して、適切な式を含むExcelスプレッドシートに強度値を貼り付けることにより、FRAP蛍光回復曲線を計算します。光退色領域の蛍光回復は、バックグラウンド領域と内部領域に正規化されます。蛍光回復の半分の時間を計算するには、蛍光回復曲線の値と対応する時間をSigmaPlotに貼り付けてから、ダイナミックフィットウィザードの指数関数的上昇最大ツールを使用してカーブフィットを実行し、最適なカーブフィットに応じてモノ指数関数またはバイ指数関数を選択します。

選択した関数を解いて得られたパラメータは、適切な式を含むExcelスプレッドシートに貼り付けることができ、それぞれの回復の半分の時間を秒単位で計算できます。活性化時の光活性化可能なアクチンの拡散と、ラメリポディウムなどの特定の領域内での蓄積を測定するには、MetaMorphを使用して、各領域および細胞外の経時的な強度を決定し、標準化のためのバックグラウンド蛍光を決定します。光活性化可能なアクチンが活性化領域から離れる正確な変位速度、またはラメリポディウム内への取り込み速度を調べるには、以前にMetaMorphから得られたデータから蛍光曲線を生成します。

正規化に使用した背景領域、光活性化細胞質領域、または調査対象のラメリポディアル領域の強度値を、適切な式を含むExcelスプレッドシートに貼り付けます。ここでは、小さなGTPase Rac1のマイクロインジェクション前後のNIH 3T3線維芽細胞のフェイスコントラスト画像を示します。マイクロインジェクションの約12分で、細胞はその形態を変化させ、インジェクションが成功したことを示しています。

ここでは、漂白されたEGFP VASPをラメリポジウム先端の非漂白分子にリサイクルする様子を示しています。この特定の例では、漂白前の蛍光の約80%で蛍光プラトーを回復します。光活性化されると、光活性化されたGFPアクチンは細胞質領域から急速に拡散します。

光活性化アクチンモノマーの一部が前方に移動し、ラメリポディアで急速に蛍光を発散します。光活性化アクチンモノマーの画分がサイトゾルを通過する途中で非活性化モノマーで希釈されるため、光活性化領域から離れたラメリポディアでは、蛍光の取り込みが非常に低くなります。光活性GFPアクチンは、時間の経過とともに光活性化領域から拡散すると、非光活性化非蛍光アクチンに連続的に置換されます。

その結果、この領域の蛍光強度が徐々に減少することが観察されます。時間の経過とともに、細胞質活性化領域に近いラメリポディアは、蛍光アクチンを急速に取り込む。その後の蛍光の低下は、単にアクチンの解重合とラメリポジウムからのモノマーの拡散によるものです。

したがって、単一の顕微鏡システムで実験を行う場合、マイクロインジェクションとFRAPまたは光活性化技術の組み合わせは、調査するタンパク質の性質に応じて数分で現実的に実行できます。マイクロマニピュレーションの前、最中、後、またはレーザー光線への曝露後、常に自分自身を幸せに保つことを忘れないでください。FRAPと光活性化の場合、選択した領域が映画の期間中、その構造的完全性を維持することが特に重要です。

マイクロインジェクションの手順は、細胞内レベルでの特定の治療の即時的な結果に対処するために、原形質膜透過性薬物または細胞骨格阻害剤の局所適用によって補完することができます。マイクロマニピュレーション技術は、細胞骨格成分や複合体の拡散特性や細胞内ダイナミクスを探求し、細胞の形態形成を調節する二次経路を理解する道を開きました。このビデオを見れば、細胞質タンパク質、細胞骨格内の活動に組み込まれたタンパク質、または異なる細胞内小器官に存在するタンパク質の時空間ダイナミクスを追跡および監視する方法を十分に理解し、最終的に細胞調節の動態を解明する方法を理解できるはずです。